史 達(dá)，陳 潔，張 玲，胡紫艷，曹 玉*

（1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 211198； 2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211112）

活血止痛膠囊/片均由三七、土鱉蟲等6 味藥材組成，具有活血散瘀、消腫止痛的功效［1］。真菌毒素是真菌產(chǎn)生的具有生物體內(nèi)蓄積效應(yīng)的有害次生代謝物，具有人體造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等毒性以及致癌和致畸作用［2-4］。據(jù)已有文獻(xiàn)研究，處方中三七與土鱉蟲均有玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬毒素、雜色曲霉毒素等真菌毒素殘留現(xiàn)象［5-9］。同時(shí)，活血止痛膠囊及活血止痛片制備工藝均為全粉入藥，2020 年版《中國(guó)藥典》 通則“9305 中藥中真菌毒素測(cè)定指導(dǎo)原則” 規(guī)定，處方中含有易污染的藥材及生粉投料的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的測(cè)定。

2020 年版《中國(guó)藥典》 僅對(duì)處方中土鱉蟲規(guī)定黃曲霉毒素限度，活血止痛膠囊規(guī)定項(xiàng)下及活血止痛片劑執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［10］均未規(guī)定真菌毒素殘留限度。目前較為成熟的測(cè)定方法有液相色譜法［11］、酶聯(lián)免疫法［12］及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［13-15］； 真菌毒素常用的前處理方法包括QuEChERS 凈化［13］、液液萃?。?6］、固相萃?。?7］、免疫親和凈化［18］等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比QuEChERS 凈化、固相萃取凈化、免疫親和柱凈化這3 種前處理方法，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS） 法準(zhǔn)確、靈敏、快速篩查活血止痛膠囊和活血止痛片劑中16 種真菌毒素，以期為合理評(píng)價(jià)活血止痛制劑質(zhì)量及為該類中成藥安全監(jiān)管提供數(shù)據(jù)支撐與技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 液相色譜儀、Agilent 6470 三重四級(jí)桿質(zhì)譜（美國(guó)Agilent 公司）； CPA225D 十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）； Milli-Q 純水儀（美國(guó)Merck公司）； KQ-250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率30 kHz）； 渦旋混勻器 （德國(guó)Wiggens 公司）； N-EVAP24 型氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）； Oasis Prime HLB 固相萃取柱、Oasis HLB 固相萃取柱（美國(guó)Waters 公司）。

1.2 試劑與藥物 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2對(duì)照品溶液（25 μg/mL），黃曲霉毒素M1、M2對(duì)照品溶液（10 μg/mL），伏馬毒素對(duì)照品溶液（50 μg/mL），HT-2 毒素對(duì)照品溶液（100 μg/mL），T-2 毒素對(duì)照品溶液（100 μg/mL），雜色曲霉毒素對(duì)照品溶液（50 μg/mL），脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)照品溶液 （100 μg/mL），赭曲霉毒素A 對(duì)照品溶液（10 μg/mL），玉米赤霉烯酮對(duì)照品溶液 （100 μg/mL），桔青霉毒素對(duì)照品溶液（100 μg/mL），真菌毒素六合一復(fù)合免疫親合柱（黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素、T-2 毒素，6 mL），均購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司。QuEChERS 試劑1（MgSO46 g、CH3COONa 1.5 g，貨號(hào) 5982-5755）、QuEChERS 試劑2 （PSA 800 mg、MgSO41 200 mg，貨號(hào)5982-6666）、QuEChERS 試劑3 （PSA 400 mg、MgSO41 200 mg，貨號(hào)5982-5058）、QuEChERS 試劑4 （Carbon S 90 mg、C18300 mg、PSA 300 mg、SiO2300 mg、MgSO4900 mg，貨號(hào)5610-2056）、QuEChERS 試劑5 （PSA 150 mg、C18EC 150 mg、MgSO41 200 mg，貨號(hào)5982-5156） 購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司。甲醇、乙腈為色譜純 （美國(guó)Honeywell 公司）； 甲酸、甲酸銨、乙酸銨為色譜純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）?；钛雇茨z囊、活血止痛片均為市售，共40 批，來(lái)源于6 家生產(chǎn)企業(yè)，具體見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS/MS 條件

2.1.1 色譜 Agilent RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）； 流動(dòng)相水（含有0.1% 甲酸和2 mmol/L 甲酸銨，A） -乙腈 （B），梯度洗脫 （0 ～3 min，90%A； 3 ～8 min，90% ～60%A； 8 ～12 min，60% ～30% A；12～14 min，30% ～10% A； 14 ～15 min，10% A； 15 ～15.1 min，10% ～90% A； 15.1 ～18 min，90% A）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫35 ℃； 進(jìn)樣量3 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子掃描； 離子源溫度350 ℃； 毛細(xì)管電壓3 500 V （＋）、2 500 V （-）；鞘氣體積流量12 L/min，溫度350 ℃； 霧化器壓力45 psi（1 psi＝6.895 kPa）； 采集模式，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（DMRM）。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，MRM 色譜圖見圖1。

圖1 各真菌毒素MRM 色譜圖

表2 各真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密吸取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，黃曲霉毒素M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，T-2 毒素，HT-2 毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素對(duì)照品溶液適量，置于20 mL 量瓶中，乙腈稀釋至刻度，制成含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，桔青霉毒素80 ng/mL，伏馬毒素B1、B2、B3，T-2 毒素800 ng/mL，玉米赤霉烯酮200 ng/mL，赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素160 ng/mL，HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇2 000 ng/mL 的貯備液，密封，在-20 ℃下保存。精密吸取0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，50%乙腈稀釋至刻度，逐級(jí)稀釋，即得（含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，桔青霉毒素0.1、0.2、0.4、1、2、4 ng/mL，伏馬毒素B1、B2、B3，T-2 毒素1、2、4、10、20、40 ng/mL，玉米赤霉烯酮0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素0.2、0.4、0.8、2、4、8 ng/mL，HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇2.5、5、10、25、50、100 ng/mL，編號(hào)S1～S6）。

2.2.2 供試品溶液

2.2.2.1 QuEChERS-HLB 凈化法 取本品約5 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，精密加入提取液（80% 乙腈-15%水-5%甲酸） 20 mL，渦旋振蕩2 min，加入QuEChERS提取試劑盒（含PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg）渦旋振蕩5 min，10 000 r/min 離心5 min。精密量取上清液5 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，10 000 r/min 離心5 min，精密量取3 mL，緩慢通過(guò)已處理好的Oasis HLB 固相萃取柱（3 mL/150 mg，依次用甲醇、水各3 mL 洗脫） 直至有適量空氣通過(guò)，收集洗脫液，用3 mL 含0.2%甲酸的乙腈洗脫，收集合并洗脫液，40 ℃氮?dú)饩徛抵两?，加?0%乙腈（含0.2%甲酸） 定容至1.5 mL，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2 Prime HLB -IAC 凈化法 取本品約5 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，精密加入提取液（80% 乙腈-15%水-5%甲酸） 20 mL，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min 離心5 min。精密量取上清液5 mL，緩慢通過(guò)Oasis Prime HLB固相萃取柱，1 mL 乙腈洗脫柱子，接凈化液加PBS 磷酸緩沖液配方（8.0 g NaCl、l.2 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl，加990 mL 水溶解，鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0，再加水稀釋至1 000 mL） 稀釋至40 mL，稀釋液以重力自然速度通過(guò)免疫親合柱，20 mL 水洗脫，棄去洗脫液，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子后再用1.5 mL 乙腈（含0.2%甲酸）、0.5 mL 水依次洗脫（乙腈洗脫時(shí)稍作停留），收集洗脫液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 QuEChERS 凈化法 取本品約5 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，精密加入提取液（80% 乙腈-15% 水-5%甲酸） 20 mL，渦旋振蕩2 min，加入6 g MgSO4、1.5 g CH3COONa 渦旋振蕩2 min，10 000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液10 mL，置于50 mL 離心管中，加入QuEChERS提取試劑（PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg），渦旋5 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液5 mL，40 ℃氮?dú)饩徛抵两桑?0% 乙腈 （含0.2% 甲酸） 定容至1 mL，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng) 取未檢出16 種真菌毒素的活血止痛膠囊（批號(hào)190328） 作為空白基質(zhì)，按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備空白基質(zhì)溶液，將“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液分別用空白基質(zhì)溶液、50%乙腈逐級(jí)稀釋，以各真菌毒素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，分別以空白基質(zhì)、50%乙腈制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值對(duì)基質(zhì)效應(yīng)（ME） 進(jìn)行評(píng)估［17，19］，以ME＞100%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME＜100%為基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME 85% ～115% 為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。結(jié)果，黃曲霉毒素B2、T-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素均有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，而黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素M2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B3、HT-2 毒素存在明顯基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，見圖2。

圖2 各真菌毒素基質(zhì)抑制效應(yīng)（A）、基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（B）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取“2.2.3” 項(xiàng)下基質(zhì)空白溶液適量，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液S1 ～S6，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并以S/N ＝10 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限，S/N＝3 時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限，結(jié)果見表3，可知各真菌毒素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各真菌毒素線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液S2，在“2.1 “項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，T-2 毒素，HT-2 毒素，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素峰面積RSD 分別為2.39%、2.68%、4.76%、2.70%、5.28%、3.84%、2.12%、5.87%、4.36%、7.91%、7.29%、5.77%、3.82%、3.77%、4.11%、3.48%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取本品（批號(hào)190328） 5 g，按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，T-2毒素，HT-2 毒素，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素峰面積RSD分別為2.39%、1.67%、2.87%、2.93%、1.72%、1.41%、5.18%、9.32%、8.31%、11.06%、9.32%、9.05%、1.97%、3.58%、8.11%、6.13%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品（批號(hào)190328） 5 g，平行6 份，按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，伏馬毒素B1、B2、B3，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，T-2 毒素，HT-2 毒素，桔青霉毒素，雜色曲霉毒素含量RSD 分別為1.78%、1.88%、3.11%、4.85%、3.89%、1.88%、6.20%、5.50%、10.76%、8.46%、6.39%、3.81%、1.22%、7.93%、3.91%、2.33%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取本品（批號(hào)190328）5 g，按低、中、高質(zhì)量濃度水平分別精密加入對(duì)照品溶液50、125、500 μL，平行3 份，按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 各真菌毒素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

2.4 樣品含量測(cè)定 取 40 批樣品，各 2 份，按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定含量。結(jié)果，檢出黃曲霉毒素B1、G1、伏馬毒素B1、B2、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素，檢出率分別為20%、32.5%、57.5%、25%、42.5%、27.5%，其中黃曲霉毒素B1、G1檢出量分別為1.96～10.26、2.16～20.41 μg/kg，伏馬毒素B1、B2檢出量分別為22.45～812.2、12.52 ～913.8 μg/kg，赭曲霉毒素A檢出量為2.75 ～12.50 μg/kg，雜色曲霉毒素檢出量為2.99～32.78 μg/kg，表明真菌毒素殘留較嚴(yán)重，存在潛在用藥安全隱患。

3 討論

3.1 色譜條件、提取溶劑選擇 乙腈較甲醇洗脫能力強(qiáng)，柱效更高，甲酸銨較乙酸銨各真菌毒素響應(yīng)更好，加入0.10%甲酸可明顯提高部分毒素離子化效率，故最終選擇乙腈-甲酸銨（2 mmol/L，0.10%甲酸） 作為流動(dòng)相。甲醇雖比乙腈有更好的溶解性，但乙腈具有更好的選擇性，可有效避免過(guò)多提取脂肪、色素等雜質(zhì)成分，并且一定比例水及甲酸可使部分水溶性、酸敏感性真菌毒素（伏馬毒素、赭曲霉毒素） 有更好響應(yīng)，同時(shí)還可使樣品保持較高滲透性，故最終選擇80% 乙腈-15% 水-5% 甲酸系統(tǒng)作為提取溶劑。

3.2 凈化方式優(yōu)化 活血止痛膠囊/片存在基質(zhì)效應(yīng)，同位素內(nèi)標(biāo)能夠最大程度減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾，但其定制繁瑣，價(jià)格昂貴，而合適的提取凈化方式也能有效減少基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［13-14］，比較不同凈化方式選擇最優(yōu)去除干擾物方式，發(fā)現(xiàn)僅以QuEChERS 提取凈化活血止痛基質(zhì)，伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A 和HT-2 毒素回收率較差，但加入PSA、MgSO4試劑后有助于水相與有機(jī)相分層，而加入carbon S、SiO2等可導(dǎo)致黃曲霉毒素、伏馬毒素、雜色曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等響應(yīng)值偏低，并且過(guò)多PSA 也會(huì)影響伏馬毒素回收率，最終選擇PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg 為提取試劑。進(jìn)一步研究不同凈化方式組合，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)經(jīng)過(guò)QuEChERS 提取并過(guò)Oasis HLB 固相萃取柱凈化或者直接通過(guò)Oasis Prime HLB 固相萃取柱與免疫親合柱串聯(lián)凈化可滿足目標(biāo)真菌毒素回收率要求，但免疫親合柱中不含有雜色曲霉毒素、HT-2 毒素和桔青霉毒素等抗體導(dǎo)致該部分毒素回收率較差［20-24］?？紤]到活血止痛膠囊/片中雜色曲霉毒素有較高的檢出率，因此本實(shí)驗(yàn)為合理考察活血止痛膠囊/片中16 種真菌毒素殘留情況，最終選擇更經(jīng)濟(jì)、適合高通量真菌毒素篩查的QuEChERS 提取組合Oasis HLB 固相萃取柱凈化作為提取凈化方式。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS 法，從40 批活血止痛膠囊/片中檢出黃曲霉毒素B1、G1，伏馬毒素B1、B2，赭曲霉毒素A，雜色曲霉毒素，提示該類中藥品種存在潛在的真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)，患者口服用藥后有較大安全隱患，故應(yīng)加強(qiáng)其來(lái)源藥材、加工、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)的監(jiān)管。另外，該方法快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確靈敏，可為合理評(píng)價(jià)活血止痛膠囊/片中真菌毒素殘留風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐，并為安全監(jiān)管提供參考依據(jù)。