孫素靈，姜 逸，陸 雄，吳雪卿，楊孫虎，王 鳴*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科，上海 200082； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞生物與組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

膿毒癥是一種由感染引起宿主強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)并伴發(fā)器官功能障礙的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［1］。盡管近年來膿毒癥治療有所進(jìn)展，但它仍然是重癥監(jiān)護(hù)病房患者最常見的死亡原因之一［2-3］。一項(xiàng)全球性的膿毒癥發(fā)生率和死亡率回顧性研究結(jié)果顯示，僅在2017 年全球膿毒癥患者人數(shù)累計(jì)4 890 萬例，其中1 100 萬例患者報(bào)告死亡，占全球死亡人數(shù)的19.7%［4］。腸道是參與和加重膿毒癥的中心器官，被認(rèn)為是全身炎癥反應(yīng)綜合征的“引擎”［5］。尤其在盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP） 模型中，腸屏障損傷導(dǎo)致腸道通透性增加，促使管腔微生物和內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)，誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)釋放進(jìn)一步加劇多器官功能衰竭［6］。

梔子金花湯出自《醫(yī)宗金鑒·雜病心法要訣》［7］，在黃連解毒湯的基礎(chǔ)上添加一味大黃，對(duì)熱毒內(nèi)蘊(yùn)患者有奇效。已有研究證實(shí)梔子金花湯可以通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)改善膿毒癥腹腔感染［8］，梔子金花湯保留灌腸在肛竇炎治療過程中亦可發(fā)揮良好的抑菌作用［9］。關(guān)于梔子金花湯對(duì)膿毒癥腸黏膜屏障的影響及機(jī)制探索不多，本研究旨在為相關(guān)臨床研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 雄性大鼠30 只，8 周齡，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （浙） 2019-0002］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，光照日夜循環(huán)各12 h，自由飲食飲水，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 藥物 生梔子、黃芩（批號(hào)20230421、2023030707，上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司）； 黃連（批號(hào)220809，上海青浦中藥飲片有限公司）； 黃柏（批號(hào)230508，上海虹橋中藥飲片有限公司）； 大黃（批號(hào)20221117，上海萬仕誠(chéng)藥業(yè)有限公司），藥材均購(gòu)自上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)專家鑒定為正品。梔子金花湯由梔子15 g、黃連15 g、黃芩10 g、黃柏10 g、大黃3 g 組成，藥材加蒸餾水1 L 浸泡30 min，武火燒開轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，過濾，濾渣加蒸餾水1 L 復(fù)煎30 min，過濾，合并2 次濾液，加熱濃縮至生藥量3.6 g/mL。根據(jù)人與大鼠體表面積計(jì)算法換算，梔子金花湯低、中、高劑量組為6、18、36 g/kg，每天相當(dāng)于臨床劑量的（1、3、6 倍）。

1.3 試劑 TNF-α、IL-10、IL-1β、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)230714204R、230714229R、230714225R、230714245R，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）； 伊紅和蘇木素染液 （批號(hào)220602，上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑技術(shù)有限公司）； 25%戊二醛水溶液、乙醇（批號(hào)20200109、20210728，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 鋨酸［批號(hào)10194309，阿法埃莎（中國(guó)） 化學(xué)有限公司］； 環(huán)氧樹脂E-51 （昆山綠循電子材料有限公司）； 異弗烷（批號(hào)20230403，青島歐博方醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 儀器 Axio imager 2 正置熒光顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss公司）； Tecnai G2 spirit 透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI 公司）；Tianshi 988 洗板機(jī)（北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心）； Rayto RT-6100 酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）； 電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司）； TG16W 微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）； TGL16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； HT-111B 恒溫?fù)u床（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）； EasyWeLL 系列JY98-IIIN 細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和梔子金花湯高、中、低劑量組，每組6 只。參考文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道，采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP） 技術(shù)建立膿毒癥大鼠模型。大鼠吸入異氟烷麻醉，麻醉后固定于鼠板，繼續(xù)予以異氟烷維持。大鼠腹部剃毛備皮，用75% 乙醇消毒，用手術(shù)剪刀從大鼠腹部正中開口（倒T 型） 暴露腹腔，將盲腸輕輕拉出并分離腸系膜，在距盲腸末端1 cm 處用3-0號(hào)無菌手術(shù)縫線結(jié)扎，然后用22G 針頭在盲腸結(jié)扎遠(yuǎn)端中央?yún)^(qū)域貫通穿刺2 次（注意避開血管），輕微擠壓盲腸，確保穿刺點(diǎn)通暢，隨后將腸段送回腹腔，用6-0 號(hào)無菌手術(shù)縫線關(guān)閉腹膜及腹肌，最后縫合皮膚； 假手術(shù)組除不進(jìn)行盲腸結(jié)扎與穿孔外，其余手術(shù)操作同模型組。手術(shù)結(jié)束后，大鼠于鼠籠內(nèi)觀察1 h 后放回動(dòng)物飼養(yǎng)中心繼續(xù)飼養(yǎng)。其中模型組死亡2 只。造模后次日，梔子金花湯高、中、低劑量組灌胃給予6、18、36 g/kg 藥液，假手術(shù)組和模型組灌胃給予生理鹽水，每天2 次，每次間隔12 h，連續(xù)給藥3 d［11］。

2.2 膿毒癥模型評(píng)判 給藥結(jié)束后，參考文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道，從外觀、自主意識(shí)、自主活動(dòng)、對(duì)刺激的反應(yīng)、眼睛是否有分泌物、呼吸頻率、呼吸質(zhì)量7 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，每個(gè)指標(biāo)分成5 個(gè)等級(jí)（0～4 分），總分為7 個(gè)指標(biāo)的分?jǐn)?shù)相加，最高分為28 分，若大鼠出現(xiàn)死亡則記為最高分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 膿毒癥模型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 HE 染色觀察回腸組織病理變化 末次給藥后禁食不禁水12 h，次日采用異氟烷麻醉大鼠后，取血5 mL，并取回腸部位。取部分回腸于10%中性甲醛中固定，乙醇梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片，依次使用二甲苯、乙醇脫蠟，蘇木素染核，鹽酸乙醇分化，伊紅染胞漿，自然晾干后樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察回腸組織病理結(jié)構(gòu)變化。

2.4 透射電鏡觀察回腸組織超微結(jié)構(gòu) 取部分回腸段固定于2.5%戊二醛中，0.1 mol/L PBS 充分浸洗3 次后，依次使用1%鋨酸后固定，梯度乙醇、丙酮脫水，采用環(huán)氧樹脂618 浸透固化，超薄切片70 nm，使用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，蒸餾水洗3 次，自然晾干后于透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

2.5 ELISA 法檢測(cè)血清及回腸組織DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平 血液樣本室溫放置2 h，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清，備用； 取適量回腸組織，加入0.1 mol/L PBS 破碎勻漿，離心取上清，蛋白定量后備用。按照相應(yīng)試劑盒說明書檢測(cè)血清及回腸組織DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 9.0.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 梔子金花湯對(duì)膿毒癥大鼠膿毒癥評(píng)分的影響 如圖1所示，與假手術(shù)組比較，模型組膿毒癥評(píng)分升高 （P＜0.01），平均26 分，提示造模成功； 與模型組比較，梔子金花湯中、高劑量組膿毒癥評(píng)分降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠膿毒癥評(píng)分（±s，n＝4～6）

3.2 梔子金花湯對(duì)膿毒癥大鼠回腸組織病理形態(tài)的影響如圖2 所示，假手術(shù)組大鼠回腸各層結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)； 模型組大鼠回腸結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，腸絨毛排列紊亂，部分腸上皮層脫落，黏膜層可見大量炎性細(xì)胞聚集，以中性粒細(xì)胞為主； 與模型組比較，梔子金花湯各劑量組回腸結(jié)構(gòu)基本完整，少量腸上皮細(xì)胞脫落，低劑量組黏膜層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)面積減少，中、高劑量組炎性細(xì)胞數(shù)量偶見且優(yōu)于低劑量組。

圖2 各組大鼠回腸組織HE 染色（×200）

3.3 梔子金花湯對(duì)膿毒癥大鼠回腸組織黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖3 所示，假手術(shù)組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、邊界清晰，細(xì)胞器、連接結(jié)構(gòu)正常； 與正常組比較，模型組大鼠腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，表現(xiàn)為微絨毛大量脫落，連接結(jié)構(gòu)疏松不明，細(xì)胞膜破碎； 與模型組比較，梔子金花湯低劑量組無明顯變化，中、高劑量組大鼠腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。

圖3 各組大鼠回腸組織超微結(jié)構(gòu)（×8 200）

3.4 梔子金花湯對(duì)膿毒癥大鼠血清和回腸組織DAO 及炎癥因子水平的影響 如圖4 ～5 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清和回腸組織DAO 水平升高（P＜0.01），提示腸黏膜細(xì)胞受損，回腸機(jī)械性屏障完整性破壞； 促炎因子TNF-α、IL-1β 水平升高（P＜0.01），而血清抗炎因子IL-10水平降低（P＜0.05），回腸組織IL-10 水平無明顯變化（P＞0.05）。與模型組比較，梔子金花湯中、高劑量組血清IL-1β 水平及血清和回腸組織DAO、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），血清和回腸組織IL-10 水平升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 低劑量組血清DAO、IL-1β 水平降低（P＜0.01），血清IL-10 水平升高（P＜0.01）； 中劑量組回腸組織IL-1β 水平降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠血清DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平（±s，n＝4～6）

圖5 各組大鼠回腸組織DAO、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平（±s，n＝4～6）

4 討論

膿毒癥病情兇險(xiǎn)，是重癥監(jiān)護(hù)病房患者常見死亡原因［3］。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展膿毒癥主流的抗感染治療和器官功能支持技術(shù)獲得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但膿毒癥的ICU 監(jiān)測(cè)和治療花費(fèi)頗多，嚴(yán)重消耗公共醫(yī)療資源。疾病預(yù)后差，又拖累患者的后期生活質(zhì)量。從個(gè)人家庭和社會(huì)層面，膿毒癥都造成了巨大威脅。如何拓展膿毒癥的治療手段，降低膿毒癥的重癥死亡率，是各類臨床或?qū)嶒?yàn)室研究所面臨的嚴(yán)苛挑戰(zhàn)。膿毒癥機(jī)制復(fù)雜尚未闡明，在CLP 模型中盲腸創(chuàng)傷誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)過度激活，炎癥介質(zhì)的觸發(fā)、增強(qiáng)和放大效應(yīng)是病理核心［13］。

中醫(yī)經(jīng)典中并無“膿毒癥” 對(duì)應(yīng)病名，諸醫(yī)家普遍將其歸入“傷寒” “溫病” “疫病” 范疇，可參見“異病同治” 或“同病異治” 理論予以治療?！夺t(yī)宗金鑒》 記載梔子金花湯主治痘中厥逆，因陽毒內(nèi)攻，熱極反寒，致熱厥者，與膿毒癥早期“毒熱證機(jī)理相合”。梔子金花湯方組黃芩、黃連、黃柏、梔子、大黃，在黃連解毒湯基礎(chǔ)上添加一味大黃形成。黃連解毒湯主治三焦火毒，且多項(xiàng)研究證實(shí)黃連解毒湯對(duì)膿毒癥早期之毒熱證有較好抗炎療效，在中醫(yī)臨床應(yīng)用于各類感染性疾病和胃腸道疾病等［14-15］。此外大黃性味苦、寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒的功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)大黃主要有效成分大黃素可以通過TLR4 信號(hào)通路減輕LPS 誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷，并上調(diào)縫隙接連蛋白CX43 表達(dá)［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梔子金花湯中、高劑量組可明顯改善CLP 模型大鼠回腸黏膜層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減少中性粒細(xì)胞積聚，降低血清和局部回腸組織相關(guān)促炎因子TNF-α、IL-1β 水平，升高抗炎因子IL-10 水平，提示梔子金花湯對(duì)膿毒癥大鼠具有較好的抗炎作用。

腸道作為膿毒癥多器官功能障礙綜合征關(guān)鍵一環(huán)，也是非腸源性膿毒癥的靶目標(biāo)，近乎半數(shù)的膿毒癥患者伴嚴(yán)重腸道功能障礙［17］。而腸上皮細(xì)胞作為腸道重要的生理屏障，一旦腸上皮完整性喪失，細(xì)菌和內(nèi)毒素移位入血，由此誘導(dǎo)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成多器官衰竭。DAO 是一種分布在人類和哺乳動(dòng)物小腸黏膜上層絨毛中的高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在組胺和多種多胺代謝中起作用，其活性與黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梔子金花湯中、高劑量組腸絨毛排列相對(duì)整齊，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整； 腸上皮超微結(jié)構(gòu)損傷有所改善，腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，微絨毛脫落減少，連接結(jié)構(gòu)相對(duì)緊密； 血清和回腸組織DAO水平減少。

綜上所述，梔子金花湯可以改善CLP 致膿毒癥大鼠模型血清和回腸組織炎癥反應(yīng)，通過保護(hù)腸上皮細(xì)胞及其連接結(jié)構(gòu)維護(hù)腸屏障的完整性。本研究為后續(xù)梔子金花湯減輕炎癥、保護(hù)腸屏障來改善膿毒癥的深入機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ)。