摘要：本研究旨在探究乳清分離蛋白（WPI）成核前期形成的不同聚合物與玉米醇溶蛋白（zein）形成的復合物理化特性和乳化性的變化。采用反溶劑法制備WPI聚合物和zein復合物，利用濁度、粒徑、電位、X射線衍射（XRD）和傅里葉紅外光譜（FTIR）評估復合物的顆粒大小和結構。結果發(fā)現(xiàn)，WPI在pH 2.0和pH 7.0條件下高溫長時間加熱WPI均可以形成不同的聚合物。與pH 7.0條件下加熱相同時間的WPI與zein制備的復合物相比較，pH 2.0條件下加熱的WPI與zein復合形成的復合物具有更大的粒徑和更高的凈電荷。XRD和FTIR結果顯示不同pH修飾WPI與zein形成的復合物結構存在差異。而且，pH2.0條件下修飾的WPI與zein形成的復合物具有更優(yōu)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。希望本研究為制備新型環(huán)保蛋白材料提供理論依據(jù)和技術指導。

關鍵詞：玉米醇溶蛋白；乳清分離蛋白；熱處理；理化性質

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240620

基金項目：黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（202310234011，202310234019， S202410234073X）；黑龍江省自然科學基金項目（LH2023C067）；哈爾濱市科技計劃自籌項目（2023ZCZJCG008）。

Study on the physicochemical properties of zein and various modified whey protein isolate

Liu Haoran， Wan Ruining， Dong Yuxin， Li Binghao， Ren Shuang， Sun Yuhan， Dong Shirong

（ College of Food Egineering， Harbin University， Harbin， Heilongjiang 150086 ）

Abstract： To investigate the changes in the physicochemical properties and emulsifying properties of the complexes formed from zein and different polymers formed during the early nucleation stage of whey protein isolate （WPI）. WPI-zein complexes were prepared by using anti-solvent method， and the particle size and structure of these complexes were evaluated by turbidity， particle size， potential， X-ray diffraction （XRD）， and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）. It was found that WPI can form different polymers when heated at high temperature for a long time under pH 2.0 and pH 7.0 conditions. Compared with the composite prepared by heating WPI and zein at pH 7.0 for the same time， the composite formed by heating WPI and zein at pH 2.0 has a larger particle size and higher net charge. Moreover， there were differences in the structure of the composite formed by WPI and zein modified with different pH values using X-ray diffraction （XRD） and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）. Moreover， the complex formed between WPI modified under pH 2.0 and zein exhibits superior emulsifying activity and stability. It is hoped that the research results will provide theoretical basis and technical guidance for the preparation of new environmentally friendly protein materials.

Key words： zein； whey protein isolate； heat treatment； physicochemical property

玉米醇溶蛋白（zein）具有可再生、可降解、安全和無毒等優(yōu)點而引起廣泛關注[1]。zein是玉米中的主要脯氨酸儲存蛋白，可以溶解在60%～90%的乙醇水溶液中，但由于其高含量（超過50%）的疏水氨基酸而不溶于水[2]。zein特殊的氨基酸組成賦予其強的自組裝特性，通過調控自組裝條件可以形成納米或微米級顆粒。因此，zein可以用于開發(fā)新型蛋白生物材料，用于封裝和遞送疏水性生物活性化合物和功能性營養(yǎng)素[3]。然而，當pH在等電點6.2附近時，zein納米顆粒的物理穩(wěn)定性變差，甚至發(fā)生聚集[4]。在這種條件下，尤其是在中性環(huán)境中，單一zein納米顆粒的遞送或口服給藥并不理想。

乳清分離蛋白（WPI）是食品工業(yè)生產(chǎn)奶酪的副產(chǎn)品，其具有很好的穩(wěn)定性。WPI在低pH值高溫長時間加熱會形成纖維聚合物，聚合物的形成過程包括成核期、生長期和成熟期[5]。成核前會經(jīng)歷一段滯后期，此階段蛋白質單體結構展開，構象發(fā)生變化，β-折疊結構增加，單體疏水核心暴露形成寡聚體，寡聚體含有大量β-折疊結構，并通過分子間相互作用逐漸成核[6]，這些聚合物的不同可能會帶來性質的差異。

為了研究這些聚合物是否可以改善zein納米顆粒的穩(wěn)定性，本研究在pH 2.0、90 ℃加熱WPI不同時間（0、30、60、90 min），然后與zein復合，制備不同的復合物。以pH 7.0為對照組，其他處理相同。利用納米粒度電位分析儀分析復合物的顆粒大小和電位高低，利用X射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）和傅里葉紅外光譜（ fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析復合物的結構差異。同時比較了不同復合物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。希望本研究為制備新型復合物材料提供技術指導和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Zein（Z3625）：Sigma Aldrich 公司；乳清分離蛋白（WPI）： 美國Hilmar公司；大豆油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；乙醇：濟南衍德生物科技有限公司；十二烷基磺酸鈉：上海尚寶生物科技有限公司；硫黃素T：Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要設備

H-7650型透射電鏡：日本日立公司；F4500型熒光分光光度計：美國PerkinElmer公司；T6型紫外可見分光光度計：蘇州賽力威儀器有限公司； Ultima X射線衍射儀：日本理學；Is50型傅里葉變換紅外吸收光譜儀：賽默飛世爾科技；N-1200B型旋轉蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；Fsh-Ⅱ型高速電動勻漿機：常州國宇儀器制造有限公司；Nano-ZS型納米粒度電位儀：英國 Malvern Panalytical公司。

1.3 WPI不同聚合物的制備

利用去離子水配置3%（w/v）的WPI溶液，然后分成8份，4份調節(jié)至pH 2.0，在90 ℃分別加熱0、30、60、90 min，分別命名為A、B、C、D；另外4份調節(jié)至pH 7.0，在90 ℃分別加熱0、30、60和90 min，分別命名為E、F、G、H。

1.4 復合物的制備

采用反溶劑法制備復合納米顆粒[7]。將上述制備的A、B、C、D、E、F、G、H分別用相同pH水稀釋至1%（w/v）。利用 80%乙醇溶液配制2.5%的zein溶液。將20 mL的8份濃度為2.5%的zein溶液分別邊攪拌邊滴加至50 mL的A、B、C、D、E、F、G、H樣品中，確定在20 min內滴加完成。3 000 r/min離心20 min，取上清液。然后利用旋轉蒸發(fā)儀將溶液中的乙醇除去，樣品凍干備用，制備的復合物分別命名為zein-A、zein-B、zein-C、zein-D、zein-E、zein-F、zein-G、zein-H。

1.5 濁度的測定

利用紫外分光光度計在500 nm下測定各復合物的吸光度，以去離子水做空白調零，測定吸光度作為濁度[8]。

1.6 粒徑和電位的測定

利用納米粒度電位分析儀在室溫下測定各復合物的粒徑強度分布、平均粒徑、聚合物分散性指數(shù)（PDI）和電位。其中水的折射率為1.33，樣品的折射率為1.53[9]。

1.7 XRD的測定

分別取zein-A、zein-B、zein-C、zein-D、zein-E、zein-F、zein-G、zein-H樣品測定XRD[10]。操作條件：40 kV和40 mA，Cu-Kα輻射（λ=1.54 ？），測定范圍：10°～90°（2θ），掃描速率：1°s-1。

1.8 FTIR的測定

分別取zein-A、zein-B、zein-C、zein-D、zein-E、zein-F、zein-G、zein-H樣品放入樣品池。測定光譜范圍為4 000～ 400 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率為4 cm-1掃描次數(shù)32[11]。

1.9 乳化性的測定

采用濁度法測定乳化活性和乳化穩(wěn)定性，具體描述參考董世榮等的方法[12]。乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）計算公式如下：

式中：EAI為乳化活性指數(shù)（m2/g）；T為2.303，為換算系數(shù)；A0為0 min時的吸光值；C為乳化前樣品蛋白濃度（g/mL）；φ為溶液中油的體積分數(shù)，0.25；ESI為乳化穩(wěn)定性（%）；A10為10 min時吸光值。

1.10 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Statistix8.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Origin10.0軟件進行作圖，每組試驗重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 濁度的分析

當 pH、溫度、離子強度等外部環(huán)境條件發(fā)生改變時，蛋白質會發(fā)生聚集，從而使蛋白質溶液的濁度增加。蛋白質分子在溶液中的聚集程度由濁度決定，濁度取決于溶液中不溶性懸浮團聚體的粒徑和數(shù)量[8]。圖1為500 nm下測定A、B、C、D、E、F、G、H樣品的吸光值表示濁度。當pH為2.0時，加熱30 min時，濁度達到0.369，0 min時，溶液最為透明，濁度為0.077。說明WPI成核前期形成了不同的聚合物。當pH為7.0時，加熱0 min時，溶液狀態(tài)最為透明，濁度為最小值0.081，在90 min時，濁度達到最大值0.688，溶液最為渾濁。濁度的改變可能是由于WPI在不同pH值和加熱時間下聚集量不同，進而形成了不同大小的聚合物。這些結果說明在不同pH和加熱不同時間WPI形成了不同的聚合物。

2.2 粒徑變化分析

通過粒徑的大小表征蛋白質聚集形成顆粒的大小，蛋白質粒徑與蛋白聚集程度呈現(xiàn)正相關[13]。利用反溶劑法將A、B、C、D、E、F、G、H分別與zein復合，形成的不同復合物粒徑強度分布、平均粒徑和PDI見圖2。不同復合物的粒徑強度分布、平均粒徑和PDI均存在差異。從粒徑強度分布結果（圖2a）顯示zein-A、zein-F、zein-G、zein-H呈現(xiàn)單峰分布，說明納米顆粒尺寸分布較為均勻；而zein-B、zein-C、zein-D、zein-E呈現(xiàn)雙峰分布，說明這些復合物的粒徑尺寸在兩種明顯不同的尺寸范圍，有較大顆粒生成。但是所有樣品的平均粒徑均在納米尺寸范圍內（圖2b）。其中，zein-C具有最大的平均粒徑（674.03 nm），zein-F具有最小的平均粒徑（267.03nm），zein-A、zein-B、zein-C和zein-D的平均粒徑均分別大于zein-E、zein-F、zein-G和Zein-H的平均粒徑，這可能是因為當復合納米顆粒的pH值大于兩種蛋白質的等電點時帶負電荷，從而由于靜電排斥導致形成較小的蛋白質聚集體。粒度強度分布曲線也很好地驗證了這些結果。粒徑大小不同，源于WPI形成的不同聚合物與zein包裹的多少和緊密程度不同。PDI值越小，Zein與不同WPI聚合物形成的復合物體系分布越均勻。8種樣品的PDI值均小于0.3，說明分布均較均勻。其中，zein-A的PDI為0.068，說明其分布最均勻，其中zein-D的PDI為0.283。這可能是在pH2.0條件下不加熱修飾的WPI能夠提高zein在水介質中的分散性。

2.3 不同復合物電位變化分析

在pH 2.0條件下加熱不同時間的WPI與zein復合后形成復合物的電位呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，而且電位均呈現(xiàn)正電荷。單獨的zein形成的納米顆粒帶正電荷[14]。pH 2.0環(huán)境下WPI也帶正電荷，所以形成的復合物帶正電荷。在pH 7.0條件下加熱不同時間的WPI與zein復合后形成復合物的電位為負電荷。zein-A電位為22.46 mV，zein-D的電位升高至28.48 mV。zein-E的電位為-22.39 mV，zein-H電位降低至-30.97 mV，電位的變化說明WPI不同聚合物吸附在了zein的表面。其中在8種樣品中，zein-F的電位絕對值最大，說明其在溶液中最穩(wěn)定，zein-E的電位絕對值最小。zein的等電點為～6.2和WPI的等電點在4.8～5.2。因此，當pH值高于其等電點時，這兩種蛋白質都帶有負電荷，導致靜電zein和WPI之間的排斥作用。這種排斥作用在pH7.0條件下，WPI和zein復合時起到阻止蛋白質聚集的屏障作用，所以表現(xiàn)出不同的電位絕對值（圖3）。而且電位的大小可以一定程度反映聚合物的穩(wěn)定性，電位的絕對值越大，說明復合物的穩(wěn)定性越高[3]。

2.4 XRD的分析

圖4為不同復合物的XRD圖譜，通過XRD圖譜分析不同復合物的結構[1]。pH 2.0條件下熱修飾不同時間的WPI與zein形成的復合物均出現(xiàn)尖銳峰，說明這些復合物是有規(guī)則的。pH 2.0條件下加熱不同時間的WPI與zein形成的復合物在31.76°和45.56°附近出現(xiàn)峰。隨著加熱時間的延長，WPI與zein形成復合物的峰值呈現(xiàn)降低趨勢，說明長時間加熱降低了WPI和zein的結晶度[15]。pH 7.0條件下熱修飾不同時間的WPI與zein形成的復合物均出現(xiàn)了饅頭峰，說明這些復合物呈現(xiàn)無規(guī)則的結構。pH 7.0條件下加熱不同時間的WPI與zein形成的復合物在19.06°附近出現(xiàn)無定型峰。zein-E復合物在19.31°出現(xiàn)無定型峰，而zein-F、zein-G、zein-H復合物的峰值強度明顯低于zein-E復合物的峰值，這可能是因為zein-E的晶體化程度高。這些結果說明在pH2.0條件下WPI形成的聚合物與zein形成的復合物更有規(guī)則。

2.5 FTIR變化分析

利用傅里葉紅外光譜技術可以用于分析蛋白等物質結構[16]。圖5為不同復合物的傅里葉紅外光譜圖，不同復合物均在1 039.926、1 532.649、1 637.751、2 968.875、3 288.036 cm-1處出現(xiàn)較為相似的吸收峰。通過對比圖5可知，zein-D復合物在878.892、1 049.086 cm-1處最早出現(xiàn)吸收峰，并且對于WPI、zein也出現(xiàn)相似的吸收峰。在1 500 cm-1處將紅外光譜圖分成兩部分，左側可以觀察到一個寬峰和一個較窄的峰，1 532.649、1 637.751 cm-1為酯基或羧基C=O伸縮振動吸收峰，在878.892、1 049.086cm-1處為C=O伸縮振動吸收峰，說明復合物之間存在靜電相互作用。在2 968.875、3 288.036 cm-1的吸收峰為復合物中的—OH 特征伸縮吸收峰，說明存在氫鍵相互作用[17]。這些結果說明WPI形成的聚合物與zein成功復合，而且復合物的結構存在差異。

2.6 不同復合物乳化性變化分析

乳化活性和乳化穩(wěn)定性是用于評價不同聚合物的乳化液性能的常用指標。乳化活性指數(shù)是蛋白質吸附到界面能力的量度[18]。從圖6的結果可以得出，在相同的pH值修飾的WPI與zein復合物形成的復合物，乳化活性呈現(xiàn)上升的趨勢。Zein-A的乳化活性為1.09 m2/g，而zein-D的乳化活性增加至1.62 m2/g；從Zein-E的乳化活性為1.05 m2/g，Zein-H的乳化活性增加至1.65 m2/g。而且zein-G和zein-H的乳化活性分別大于zein-C和zein-D的乳化活性，這可能是因為在pH 7.0形成的復合物所帶負電荷（圖3）。ESI 是評價乳液滴在乳化和絮凝過程中保持穩(wěn)定性的能力。當pH 2.0修飾的WPI與zein形成的復合物的乳化穩(wěn)定性均大于pH 7.0修飾的WPI與zein形成復合物的ESI。這說明規(guī)則的晶體結構更有利于提高乳液的穩(wěn)定性，而好的乳化性有利于乳液凝膠的形成[19]。

3 結 論

本研究以WPI形成纖維聚合物滯后期形成的不同聚合物（A、B、C、D、E、F、G、H）為基料與zein進行復合制備了8種復合物（zein-A、zein-B、zein-C、zein-D、zein-E、zein-F、zein-G、zein-H）。研究發(fā)現(xiàn)這8種聚合物具有不同的粒徑和電位，其中zein-F具有最小的粒徑和最大電位絕對值。zein-A、zein-B、zein-C、zein-D與zein-E、zein-F、zein-G和Zein-H的晶體結構不同。8種樣品的乳化活性和乳化穩(wěn)定性也表現(xiàn)出不同，其中Zein-H具有最大的乳化活性，而zein-E具有最小的乳化活性，而zein-A具有最小的乳化穩(wěn)定性和zein-D具有最大的乳化穩(wěn)定性。本研究利用在復雜的食品加工過程中的半成品與zein進行復合制備復合物也可以有效提高乳化液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。但是該研究制備的復合物在運載疏水或者親水小分子活性物質是否有效果需要進一步研究。

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