趙晨陽，崔鶴蓉，岳德瓊，張晗，李昶，李紅艷*（.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 6600；.北京中醫(yī)藥大學，北京 0009）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白（Aβ）過度累積和清除不足是AD發(fā)生發(fā)展的始動因素[1]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細胞[2]，能夠感知識別Aβ并將其吞噬在自身溶酶體中從而限制它們在大腦中擴散[3]，有效抑制AD的自然病程，該過程依賴于mTOR/HIF-1α途徑[2]，并伴有PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活[4]。但長期暴露于Aβ環(huán)境中，小膠質(zhì)細胞會出現(xiàn)能量代謝障礙并逐漸減少免疫應答而發(fā)展為慢性耐受[2]，導致Aβ大量沉積，造成大量神經(jīng)元死亡和神經(jīng)炎癥反應，最終導致AD發(fā)生[5]。

龍眼肉系無患子科植物龍眼（Dimocarpus longanLour.）的假種皮，龍眼肉多糖（longan aril polysaccharides，LAPs）是其主要有效成分之一。現(xiàn)代研究表明，LAPs能抑制脂多糖（LPS）誘導的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和相關基因表達[6]，促進巨噬細胞的吞噬功能和炎癥因子釋放水平[7-9]。本研究基于文獻報道和前期研究結(jié)果，體外建立Aβ誘導耐受的小膠質(zhì)細胞（BV2）模型，探討LAPs對Aβ耐受BV2細胞吞噬能力的影響，并結(jié)合課題組前期研究結(jié)果[10]及小膠質(zhì)細胞免疫應答反應與PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路的相關性[2，4]，通過Western blot技術和熒光Aβ吞噬實驗等分析LAPs改善BV2細胞吞噬功能的作用機制，為深入探究LAPs的抗AD作用奠定基礎。

1 材料

1.1 細胞及培養(yǎng)

小鼠小膠質(zhì)細胞BV2（協(xié)和細胞庫），使用含10%胎牛血清與1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試藥

龍眼肉（貨號：2206001，河北潤滑藥業(yè)）；Aβ1-42（批號：P210727-GB20601，上海捷妮泰生物科技）；Alexa Fluor 488熒光標記Aβ1-42（批號：2156636，Anaspec）；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：8121526）、胰蛋白酶（批號：2277231）（Gibco）；胎牛血清（批號：18070505，四季青）；雙抗（批號：J200044，Hyclone）；抗GAPDH抗體（批號：3561122204）、抗AKT抗體（批號：55500009442）、抗P-AKT（S473）抗體（批號：5500011663）、抗HIF-1α抗體（批號：5500016723）、抗PI3K抗體（批號：3560538002）、HRP山羊抗兔IgG（H＋L）（批號：9300014001）（ABclonal）；線粒體膜電位JC-1檢測試劑盒（批號：20210712）、雷帕霉素（批號：427W021）、BAY87-2243（批號：709B021）（索萊寶）。

1.3 儀器

萬分之一電子分析天平（Ohaus）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Nuaire）；酶標儀（Mindray）；熒光倒置顯微鏡（Nikon）；電泳儀、半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；全自動化學發(fā)光/凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon）。

2 方法與結(jié)果

2.1 龍眼肉多糖的制備

稱取200 g去核龍眼肉，剪碎，置于10 L圓底燒瓶中，加入10倍量純水浸泡2 h后，于加熱套中加熱提取，220 V加熱至沸騰后，轉(zhuǎn)至50 V保持微沸1 h，冷卻后四層紗布過濾，收集濾液，同法煎煮3次，合并濾液，70℃蒸發(fā)濃縮至200 mL得龍眼肉水煎液，采用“慢加快攪”的方式向其中加入95%乙醇至乙醇終濃度為80%以上，充分攪拌后，靜置12 h以上，5000 r·min－1離心10 min，收集沉淀，60℃干燥至恒重即得LAPs。根據(jù)公式：LAPs收率（%）＝LAPs稱重質(zhì)量（g）/龍眼肉質(zhì)量（200 g）×100%，計算得LAPs收率約為25.51%；依據(jù)文獻[11]，采用苯酚-硫酸法測得其多糖含量為（56.25±1.25）%。

2.2 Aβ耐受BV2細胞模型的建立

模型建立方法參考文獻[2]并進行適當修改。取對數(shù)生長期的BV2細胞，無菌接種于96孔細胞培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)12 h后，隨機分為對照組及Aβ2、4、8 μmol·L－1組。除對照組外，各組分別采用2、4、8 μmol·L－1Aβ處理細胞48 h，對照組加入終體積相同的培養(yǎng)基。48 h后各組更換新鮮培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h，再加入2 μmol·L－1Aβ誘導細胞激活，依據(jù)MTT法進行細胞增殖實驗，確定誘導BV2細胞耐受的Aβ最佳濃度，建立BV2細胞耐受模型。結(jié)果表明，隨著Aβ濃度增加，細胞增殖率逐漸降低，8 μmol·L－1Aβ已出現(xiàn)明顯細胞毒性（見圖1A，P＜0.05）。故選用2和4 μmol·L－1Aβ進行進一步實驗，即在Aβ處理細胞48 h＋24 h后，加入2 μmol·L－1Aβ再次處理細胞，觀察細胞增殖情況，結(jié)果表明，2 μmol·L－1Aβ組再次加入Aβ時（Aβ2＋2組），細胞較2 μmol·L－1Aβ組進一步增殖（見圖1B，P＜0.05），提示細胞尚未耐受；4 μmol·L－1Aβ組再次加入Aβ時（Aβ4＋2組）細胞增殖較4 μmol·L－1Aβ組顯著降低（見圖1C，P＜0.01），表明再次經(jīng)Aβ處理時細胞并未繼續(xù)活化增殖，且因Aβ的再次加入而出現(xiàn)增殖率下降，提示在4 μmol·L－1Aβ處理細胞48 h＋24 h后，BV2細胞已達到耐受狀態(tài)，以此條件建立Aβ耐受的BV2細胞模型，作為模型組。

圖1 MTT法篩選Aβ耐受BV2細胞模型的造模條件Fig 1 Modeling conditions of immune-tolerant BV2 cell models by MTT method

2.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的BV2細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，12 h后隨機分為對照組、模型組和LAPs組（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL－1）。除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養(yǎng)48 h后常規(guī)培養(yǎng)24 h建立細胞耐受模型。除對照組外，各組每孔加入2 μmol·L－1Aβ處理24 h誘導細胞激活，LAPs組在加入2 μmol·L－1Aβ前分別加入終濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL－1的LAPs預處理細胞2 h，MTT法檢測細胞增殖水平，選取細胞增殖率較高的濃度作為LAPs最佳給藥濃度。結(jié)果表明，與對照組比較，模型組細胞增殖率顯著提高（P＜0.05）（見圖2）。與模型組比較，當LAPs質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL－1時，細胞增殖率顯著降低（P＜0.01）；LAPs濃度為0.2、0.4 mg·mL－1時，細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義；LAPs質(zhì)量濃度為0.8、1.6 mg·mL－1時，細胞增殖率顯著提高（P＜0.05）。結(jié)果提示，LAPs可能因使用劑量不同，對BV2細胞活化有著雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度（0.2、0.4 mg·mL－1）可能具有抑制BV2細胞激活的作用，高濃度（0.8、1.6 mg·mL－1）則能促進Aβ誘導耐受的BV2細胞增殖。

圖2 MTT檢測不同濃度LAPs對Aβ誘導耐受的BV2細胞增殖的影響Fig 2 Effect of different concentrations of LAPs on the proliferation of Aβ-induced tolerant BV2 cells by MTT method

2.4 JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位

取對數(shù)生長期的BV2細胞以1×105個·mL－1接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，隨機分為對照組，模型組，LAPs 0.8、1.6 mg·mL－1組。除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養(yǎng)48 h后常規(guī)培養(yǎng)24 h建立細胞耐受模型；各組每孔均加入2 μmol·L－1Aβ1-42再次處理細胞24 h，對照組加入等體積培養(yǎng)基。按照試劑盒說明書，每孔加入1 mL JC-1染色工作液，置于細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。孵育結(jié)束后棄去上清液，使用JC-1染色緩沖液洗滌2次后于倒置熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件分析各組細胞紅、綠色熒光強度，計算紅/綠熒光強度比，比較各組細胞線粒體膜電位變化。由圖3可見，與對照組比較，模型組細胞紅/綠熒光比值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，LAPs組細胞紅/綠熒光比值提高（P＜0.01）。結(jié)果提示，模型組細胞線粒體受損，膜電位下降或喪失；LAPs能提高Aβ誘導耐受的BV2細胞線粒體膜電位水平。

圖3 LAPs對BV2細胞線粒體膜電位的影響Fig 3 Effect of LAPs on mitochondrial membrane potential in BV2 cells

2.5 熒光顯微鏡檢測細胞吞噬功能

取對數(shù)生長期的BV2細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，細胞分組及處理同“2.4”項下。在LAPs預處理細胞2 h后，除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養(yǎng)48 h后常規(guī)培養(yǎng)24 h建立細胞耐受模型；各孔細胞均加入2 μmol·L－1熒光標記Aβ1-42再次處理24 h，對照組加入等體積培養(yǎng)基。24 h后棄去各孔培養(yǎng)基，用PBS小心潤洗后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件分析熒光強度，計算細胞熒光吞噬率。細胞熒光吞噬率（%）＝實驗組熒光強度/對照組熒光強度×100%。結(jié)果表明，與對照組比較，模型組細胞熒光吞噬率顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，LAPs組細胞熒光吞噬率顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），其中LAPs 0.8 mg·mL－1組熒光吞噬率尚未達到正常細胞水平（P＜0.05），LAPs 1.6 mg·mL－1組細胞熒光吞噬率顯著高于對照組細胞（P＜0.05）（見圖4A、B）。

圖4 LAPs對BV2細胞吞噬熒光Aβ的影響Fig 4 Effect of LAPs on the phagocytosis of fluorescent Aβ in BV2 cells

2.6 Western blot技術檢測PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路相關蛋白表達

取對數(shù)生長期的BV2細胞以5×105個·mL－1接種于細胞培養(yǎng)瓶中，細胞分組及處理同“2.4”項下。收集各組BV2細胞，用預冷PBS洗滌3次，根據(jù)說明書按比例加入裂解液，冰上裂解，吸取上清液進行BCA蛋白含量檢測。取等量蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至NC膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗滌；加入一抗（抗PI3K、Akt、p-Akt、HIF-1α以及GAPDH抗體，1∶500），4℃孵育過夜，洗滌；加入二抗（HRP標記山羊抗兔抗體，1∶3000），室溫孵育2 h，洗滌；采用ECL化學發(fā)光，用Image J軟件分析條帶灰度值。由圖5可見，與對照組比較，模型組除PI3K蛋白表達減少外，Akt、p-Akt和HIF-1α蛋白表達均增加（P＜0.01）；與模型組比較，LAPs（0.8、1.6 mg·mL－1）組的PI3K、Akt、p-Akt和HIF-1α蛋白的表達水平均提高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 LAPs對BV2細胞PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路蛋白表達的影響Fig 5 Effect of LAPs on the expression of PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α pathway proteins in BV2 cells

2.7 抑制劑BAY、Rapa對LAPs給藥后的BV2細胞吞噬功能的影響

取對數(shù)生長期的BV2細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，12 h后隨機分為對照組、模型組、LAPs組（0.8、1.6 mg·mL－1）和抑制劑組（LAPs＋BAY、LAPs＋Rapa），抑制劑組在LAPs給藥前根據(jù)文獻[2]分別加入HIF-1α抑制劑BAY87-2243（10 μmol·L－1）和mTOR抑制劑Rapa（30 nmol·L－1）。除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養(yǎng)48 h后常規(guī)培養(yǎng)24 h建立細胞耐受模型；各孔細胞均加入2 μmol·L－1熒光標記Aβ1-42再次處理24 h，對照組加入等體積培養(yǎng)基。24 h后棄去各孔培養(yǎng)基，用PBS小心潤洗后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件分析熒光強度。由圖6可見，與對照組比較，模型組細胞胞內(nèi)綠色熒光減少（P＜0.01）；與模型組比較，LAPs組細胞胞內(nèi)綠色熒光增多（P＜0.01）；與LAPs組比較，BAY及Rapa組細胞胞內(nèi)綠色熒光均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 BAY和Rapa對LAPs給藥的BV2細胞吞噬熒光Aβ的影響Fig 6 Effect of BAY and Rapa on the phagocytosis of fluorescent Aβ in BV2 cells administered with LAPs

2.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s），組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

近年來研究表明，Aβ沉積可誘導小膠質(zhì)細胞的增殖，使其從靜止態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)，最終促使活化的小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ能力增強[12]?；罨男∧z質(zhì)細胞聚集在Aβ周圍，不斷吞噬Aβ斑塊以延緩AD的發(fā)生發(fā)展[13-14]。但因Aβ具有線粒體毒性，長期的Aβ環(huán)境使小膠質(zhì)細胞線粒體嚴重受損[2，15]，細胞能量代謝障礙，而出現(xiàn)免疫耐受，對Aβ的吞噬能力下降[16]。本文以Aβ慢性處理誘導BV2細胞耐受，結(jié)果表明，耐受的BV2細胞雖然仍表現(xiàn)出一定水平的增殖，但其吞噬能力和線粒體膜電位均下降，再次加入Aβ后細胞增殖率明顯降低，提示耐受的BV2細胞功能受損或已發(fā)生早期凋亡。經(jīng)LAPs干預后，耐受的BV2細胞增殖能力、線粒體膜電位水平及吞噬功能均提高，提示LAPs能夠逆轉(zhuǎn)Aβ誘導的BV2細胞耐受，在一定程度上恢復BV2細胞的吞噬功能。因免疫耐受的小膠質(zhì)細胞存在PI3K/Akt/mTOR及mTOR/HIF-1α信號通路抑制[2，4]，本研究通過Western blot技術檢測PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路關鍵蛋白的表達情況，并觀察抑制劑BAY和Rapa對LAPs提高BV2吞噬功能的阻斷作用。結(jié)果表明，LAPs能顯著提高信號通路關鍵蛋白的表達，Rapa和BAY顯著降低了LAPs的作用，提示激活PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路是LAPs影響B(tài)V2細胞吞噬功能的可能作用機制，但Rapa和BAY的加入均未能完全阻斷LAPs的作用，因此課題組認為LAPs可能存在多個作用靶點，或存在多種作用途徑。

本研究為基于調(diào)控小膠質(zhì)細胞免疫應答反應探討LAPs抗AD的作用機制提供了依據(jù)，后續(xù)將基于體外實驗開展LAPs抑制AD進程的體內(nèi)作用與機制研究，以全面闡釋LAPs的抗AD作用。