高雪 康媛 滕月

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)發(fā)病率為4%～10%,主要特征為月經(jīng)滯后、月經(jīng)過多和崩漏等[1-2]。PCOS發(fā)病機制與信號通路的異常有關。熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)在機體受到應激后迅速增加,參與蛋白運輸,保護細胞免受刺激[3],同時還參與細胞的凋亡及抗氧化等作用,在抵抗冷應激早期反應時,HSP90是由應激細胞分泌[4],HSP90還是促炎因子,其可通過調控相關信號通路的細胞因子,從而調控炎性反應水平并影響細胞凋亡[5]。炎性反應參與PCOS的全過程[6]。己證實PCOS的主要病理為皮質纖維化及卵巢間質增生等,均是慢性炎性反應體現(xiàn)[7]。當機體受到冷應激刺激時,核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)表達增加,同時胰島素抵抗水平增加,雄激素水平升高,促進PCOS的產(chǎn)生及發(fā)展。但目前關于冷應激對于PCOS大鼠的報道較少,本實驗研究冷應激反應對PCOS大鼠生殖功能的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只SPF級SD雌性大鼠體質量200～300 g[上海凱學生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)-2020-0126)],適應飼養(yǎng)1周后實驗。本實驗已通過我院動物倫理委員會批準,批號：20200120。

1.2 主要實驗試劑 蘇木素-伊紅染色液(上海源葉生物科技公司),FSH、LH、T、SOD、MDA和GSHPx試劑盒(均上海仁捷生物科技公司),TUNEL工作液(杭州浩克生物科技公司),HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1和RIP一抗(均武漢艾美捷生物科技公司),辣根過氧化物酶二抗(河北翰林生物科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠的分組與處理：于50只大鼠中隨機抽取10只作為對照組,剩余40只大鼠根據(jù)文獻[8]建立PCOS模型。40只大鼠建模成功,隨機分為模型組、冷應激組、抑制劑組、聯(lián)合組,每組10只。冷應激組刺激溫度為4℃,刺激時間為 3 h (11∶00～14∶00),干預3周;抑制劑組大鼠于腹腔注射格爾德霉素(50 mg/kg,HSP90抑制劑),持續(xù)5 d;聯(lián)合組大鼠在冷應激組的前提下給予HSP90抑制劑干預。

1.3.2 ELISA檢測血清性激素水平及氧化應激水平：取5組大鼠頸動脈血2 mL,1 250 r/min,離心5 min,后取血清。ELISA檢測促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinising hormone,LH)、睪酮(testosterone,T)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx),嚴格按照說明書操作。

1.3.3 HE染色觀察卵巢組織病理形態(tài)：按常規(guī)操作,光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3.4 TUNEL染色檢測卵巢組織細胞凋亡：按上述方法取組織并脫水后,放于載玻片上,加入蛋白酶K工作液孵育20 min后清洗,加入TUNEL工作液反應1 h后清洗,滴加50 μL convertr-POD,反應0.5 h后清洗,DAB顯色液顯色,光鏡下觀察并計數(shù)。

1.3.5 免疫印跡檢測卵巢組織HSP90、NF-κB p65、核轉錄因子抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IKB)、轉化生長因子β激活激酶1(relationship between transforming growth factor β kinase 1,TAK-1)、受體相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)蛋白表達：取卵巢組織剪碎后,3 000 r/min,離心5 min,離心半徑為12 cm,取上清液,測蛋白濃度。蛋白變性后進行電泳,電泳后的蛋白溶液置于PVDF膜上,脫脂奶粉封閉,2 h后將PVDF取出,加入NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP、HSP90一抗(1∶500)4℃過夜孵育過夜,取出PVDF膜,加辣根過氧化物酶二抗(1∶500),孵育2 h進行清洗、顯色、拍照并分析條帶吸光度值absorbance,計算各指標相對水平。

2 結果

2.1 冷應激對PCOS大鼠性激素水平的影響 與對照組比較,模型組FSH降低、LH與T升高(P<0.05),與模型組比較,冷應激組和抑制劑組FSH降低、LHT升高(P<0.05),與抑制劑組比較,冷應激組FSH降低、LH與T升高(P<0.05)。見表1。

表1 冷應激對PCOS大鼠性激素水平的影響 n=10,

2.2 冷應激對PCOS大鼠氧化應激水平的影響 與對照組比較,模型組SOD和GSH-Px水平降低,MDA水平升高(P<0.05),與模型組比較，冷應激組與抑制劑組SOD和GSH-Px水平升高,MDA水平降低(P<0.05),與抑制劑組比較,冷應激組SOD和GSH-Px水平降低,MDA水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 冷應激對PCOS大鼠氧化應激水平的影響 n=10,

2.3 冷應激對PCOS大鼠卵巢形態(tài)的影響 對照組大鼠卵巢組織結構正常;模型組與聯(lián)合組卵巢皮質黃體及卵泡減少,卵泡囊性擴張并有閉鎖產(chǎn)生;冷應激組與抑制劑組大鼠的卵巢主要表現(xiàn)為大量的小竇卵泡、囊性卵泡和增大的卵泡膜細胞層,且以冷應激組更為嚴重。見圖1。

圖1 冷應激對PCOS大鼠卵巢病理形態(tài)(HE×100)

2.4 冷應激對PCOS大鼠卵巢組織細胞凋亡的影響 對照組、模型組、抑制劑組、冷應激組與聯(lián)合組的細胞凋亡率分別為(5.62±0.58)%、(41.38±3.92)%、(52.67±4.22)%、(63.48±5.71)%和(40.62±4.28)%,對照組卵巢組織中細胞凋亡率低于模型組、聯(lián)合組(F=168.200,P<0.001),抑制劑組卵巢組織中細胞凋亡率較模型組高(P<0.001),冷應激組細胞凋亡率較抑制劑組高(P<0.001)。見圖2。

圖2 冷應激對PCOS大鼠卵巢組織細胞凋亡的影響(TUNEL×200)

2.5 冷應激對5組PCOS大鼠HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組大鼠卵巢組織中HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP升高(P<0.05),與模型組比較,冷應激組與對照組大鼠卵巢組織中HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP升高(P<0.05)。見表3,圖3。

圖3 5組大鼠HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1和RIP水平比較

表3 5組大鼠HSP90、NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP水平比較 n=10,

2.6 HSP90與NF-κB p65在冷應激刺激后的相關性分析 大鼠卵巢組織中HSP90與PI3K在冷應激刺激后的表達呈正相關關系(r=0.581,P<0.001)。見圖4。

圖4 HSP90與NF-κB p65相關分析

3 討論

HSP90 是應激反應上調的分子伴侶蛋白,過度激活的HSP90參與PCOS的產(chǎn)生及發(fā)展。此外HSP90還是促炎因子的一種。HSP90靶蛋白RIP激酶、TAK-1激酶和IκB 激酶均屬于NF-κB通路相關因子,當細胞受到刺激后,IKB磷酸化后將NF-κB釋放至胞核并發(fā)生磷酸化,通過調控下游相關因子,促進炎性反應發(fā)展[9]。HSP90在PCOS大鼠中顯著降低,抑制其水平后會加重PCOS發(fā)展[10]。但HSP90在經(jīng)過冷應激刺激后表達會升高,因此本實驗運用HSP90抑制劑作為對照,進一步證實冷應激可加重PCOS大鼠病情。在本實驗中經(jīng)過冷應激刺激后NF-κB p65、IkB、TAK-1、RIP、HSP90水平升高,且HSP90與NF-κB在冷應激刺激下具有正相關關系。提示冷應激可能是通過抑制HSP90表達加重炎性反應,從而加重PCOS大鼠病情。二甲雙胍通過抑制HSP水平抑制NF-κB通路,減少炎性反應,改善PCOS病情[11]。證實了本研究上述結論。此外,NF-κB信號通路還可調控細胞生物學行為。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS大鼠卵巢組織細胞在經(jīng)過冷應激干預后會加速凋亡。研究提出,通過抑制NF-κB 信號通路,減少卵巢顆粒細胞凋亡,改善PCOS病情[12]。證實了本研究的上述結論?；诖?本實驗認為冷應激干預后導致HSP90異常升高從而激活了NF-κB通路后,加重了炎性反應及卵巢組織細胞凋亡,從而促進PCOS惡化。

PCOS病理特點之一是高雄激素、高促黃體生成素,同時也是導致生殖功能產(chǎn)生障礙的重要原因[13]。研究認為應激狀態(tài)可能通過激活卵巢HSP90的表達,降低FSH水平,阻礙顆粒細胞增殖分化,從而降低芳香化酶活性,使雌激素減少,卵泡發(fā)育受阻,促進大鼠形成多囊卵巢狀態(tài)[14]。常壯鵬等[15]研究提示,通過抑制NF-κB炎性反應信號通路,可改善卵巢組織病理形態(tài),并調節(jié)卵巢激素微環(huán)境。本研究與上述結論相似。這提示冷應激通過增加HSP90反應介導NF-κB通路,進而調控性激素水平,加重PCOS生殖功能障礙。此外,本研究HE染色及氧化應激結果也可證實上述結論。

綜上所述,冷應激可通過增加HSP90水平后,促進NF-κB通路激活,從而加重PCOS生殖功能障礙。