劉梓燊 鄭瑛瑛 袁夢琪 張甘霖 楊國旺

首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 （北京 100010）

肺癌（lung cancer）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康。根據(jù)統(tǒng)計，肺癌在全球發(fā)病率為11.4%位列第二，死亡率為18.0%位列第一［1］。盡管肺癌與吸煙、空氣污染、烹飪油煙等危險因素有關［2-4］，但導致肺癌發(fā)病的機制至今仍不清楚。晚期肺癌的主要治療手段化療、放療、靶向治療和免疫治療，但多數(shù)患者對目前的治療方法易產(chǎn)生耐藥性，疾病發(fā)生進展，最終導致死亡［5］。鑒于肺癌的高發(fā)病率和高死亡率，潛在危險因素的篩查和治療靶點的開發(fā)對于肺癌的診斷和治療尤為重要。

趨化因子是一種小分子蛋白質(zhì)，通過與細胞表面的G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體結合發(fā)揮功能［6］。趨化因子CCL2又稱單核細胞趨化蛋白1（MCP-1），是C-C趨化因子家族的成員，能夠趨化單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞［7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，不同病理類型肺癌微環(huán)境中CCL2的表達量不同，CCL2過表達與肺腺癌的不良預后相關，卻與肺鱗癌的良好預后相關，呈現(xiàn)出相反的結果。觀察性研究往往受到多種混雜因素的影響，趨化因子CCL2與肺癌直接因果關系暫不明確。

孟德爾隨機化研究（Mendelian randomization study，MR）是利用遺傳變異的單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為工具變量，探索暴露因素對結局因素的因果關系。由于使用遺傳因素，首先能夠避免觀察性研究中由于環(huán)境因素、研究者因素、行為因素、社會因素和其他原因產(chǎn)生的偏移；其次，觀察性研究容易受到反向因果關系的影響，而孟德爾研究中因果關系的方向是確定的。

鑒于既往發(fā)現(xiàn)肺癌和趨化因子CCL2呈現(xiàn)相關性，但研究結果受到復雜因素干擾和存在反向因果的可能；本研究采用孟德爾隨機化的研究方法，依據(jù)肺癌的不同病理分型進行亞組分析，探究趨化因子CCL2與肺癌之間直接因果關系。

1 資料與方法

1.1 研究設計首先選用趨化因子CCL2作為暴露因素，提取與趨化因子CCL2顯著相關的SNP作為工具變量，將肺癌作為結局因素，采用MR分析，使用Cochran Q檢驗進行異質(zhì)性檢驗，使用MR-Egger截距和留一法進行敏感性分析。

研究設計見圖1，孟德爾隨機化應滿足以下3個假設［9］：（1）工具變量與暴露因素相關；（2）工具變量不會受到混雜因素的影響；（3）工具變量只能通過暴露因素影響結局因素。

圖1 研究設計Fig.1 Research design

1.2 資料來源通過GWAS數(shù)據(jù)庫（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/）獲得趨化因子CCL2［10］和肺癌［11］資料，所使用的資料均來源于已發(fā)表的論文研究，論文研究已獲得倫理批件，故本次研究無需再次進行倫理審查，數(shù)據(jù)具體見表1。趨化因子CCL2的資料來自對超30 000例的85種循環(huán)蛋白的分析。肺癌的資料來自國外大型分析，對14 803例歐洲肺癌病例和12 262例對照組病理進行了基因分型，并結合現(xiàn)有數(shù)據(jù)對29 266例患者和56 450例對照進行了肺癌GWAS分析，該資料根據(jù)病理分型對肺癌進行亞組分析。

表1 數(shù)據(jù)來源與信息Tab.1 Data sources and information

1.3 研究方法

1.3.1 工具變量的篩選工具變量SNP應滿足“與暴露因素相關”的假設。首先，通過設定閾值為P＜5 × 10-8進行篩選，獲得的SNP數(shù)量較少，為了后續(xù)的分析，調(diào)整為P＜1 × 10-5，同時還需滿足連鎖不平衡條件r2＜0.001以及kb＞10 000，獲得SNP。接著，計算F統(tǒng)計量，公式為F=［R2/（1-R2）］×（NK-1）/K，R2=2×MAF×（1-MAF）×（β/sd）2，若F＜10考慮為弱工具變量，應剔除［12］。然后，應用Pheno Scanner網(wǎng)站（http：//www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/）查詢SNP的潛在因素，剔除與結局因素有關的SNP。提取結局因素SNP，協(xié)調(diào)暴露因素和結局因素的等位基因數(shù)據(jù)，剔除回文SNP。其余SNP用于后續(xù)MR分析。

1.3.2 MR分析使用R軟件4.3.1版本的“Two Sample MR”包進行MR分析，選擇逆方差加權法為主要分析，另選用加權中位數(shù)法、簡單模式法、MR-Egger回歸法、加權模式法進行補充。通過Cochran Q檢驗計算P值，用來評估是否存在異質(zhì)性，P≥ 0.05使用逆方差加權法隨機效應模型，P＜0.05則使用逆方差加權法固定效應模型。

1.3.3 敏感性分析使用MR-Egger回歸法評估多效性，若MR-Egger回歸截距的P＞0.05，則不存在水平多效性。留一法檢驗進行敏感性分析，評估單個SNP是否顯著影響結局因素，若顯著影響，則應剔除后重新進行MR分析。

2 結果

2.1 趨化因子CCL2對肺腺癌的因果關系工具變量：根據(jù)本文“1.3.1工具變量篩選”原則，最終納入23個SNP進行后續(xù)孟德爾隨機化法分析。

MR分析與敏感性分析：Cochran Q檢驗計算P= 0.019，故選擇逆方差加權法固定效應模型，IVW分析結果為OR= 1.065，95%CI（0.919～1.234），P= 0.401。MR-Egger回歸法、加權中位數(shù)法、簡單模式法、加權模式法的結果與IVW一致，均P＞0.05（圖2A、3A）。MR-Egger回歸截距P= 0.340，不存在水平多效性。留一法進行敏感性分析，未存在單個SNP顯著影響結局的情況。綜上，趨化因子CCL2對肺腺癌無因果效應。

圖2 孟德爾隨機化分析結果的森林圖Fig.2 Forest plot of the results of the Mendelian randomization analysis

圖3 孟德爾隨機化分析結果的散點圖Fig.3 Scatterplot of the results of Mendelian randomization analysis

2.2 趨化因子CCL2對肺鱗癌的因果關系工具變量：根據(jù)本文“1.3.1工具變量篩選”原則，最終納入23個SNP進行后續(xù)孟德爾隨機化法分析。

MR分析與敏感性分析：Cochran Q檢驗計算P= 0.694，故選擇逆方差加權法隨機效應模型，IVW分析結果為OR= 1.059，95%CI（0.931～1.205），P= 0.381。MR-Egger回歸法、加權中位數(shù)法、簡單模式法、加權模式法的結果與IVW一致，均P＞0.05（圖2B、3B）。MR-Egger回歸截距P= 0.174，不存在水平多效性。留一法進行敏感性分析，未存在單個SNP顯著影響結局的情況。綜上，趨化因子CCL2對肺鱗癌無因果效應。

2.3 趨化因子CCL2對小細胞肺癌的因果關系工具變量：根據(jù)本文“1.3.1工具變量篩選”原則，最終納入25個SNP進行后續(xù)孟德爾隨機化法分析。

MR分析與敏感性分析：Cochran Q檢驗計算P= 0.093，故選擇逆方差加權法隨機效應模型，IVW分析結果為OR= 0.959，95%CI（0.760～1.208），P= 0.720。MR-Egger回歸法、加權中位數(shù)法、簡單模式法、加權模式法的結果與IVW一致，均P＞0.05（圖2C、3C）。MR-Egger回歸截距P= 0.207，不存在水平多效性。留一法進行敏感性分析，去除單個SNP后，OR值和P值未見明顯改變。綜上，趨化因子CCL2對小細胞肺癌無因果效應。

3 討論

本研究通過雙樣本孟德爾隨機化的方法，根據(jù)病理類型亞組分析了趨化因子CCL2與肺癌的因果關系。MR分析結果顯示趨化因子CCL2暴露與肺癌結局無直接因果關系。

根據(jù)本研究結果，考慮趨化因子CCL2可能通過其他途徑間接影響肺癌結局。CCL2的主要受體是CCR2［13］，CCL2-CCR2軸在惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、類風濕性關節(jié)炎等多種疾病中發(fā)揮作用［14-16］。既往研究發(fā)現(xiàn)多種癌癥患者中CCL2的表達增高［17-22］。肺癌荷瘤小鼠CCL2的表達與正常小鼠相比，顯著增高［23］，CCL2表達會增加裸鼠的肺癌轉移［24］，考慮CCL2表達與肺癌的不良預后相關。研究證實，CCL2通過MAPK/ERK信號通路、PI3K/AKT信號通路促進腫瘤的增殖和遷移［24-25］。CCL2還能增加化療耐藥性，放療耐藥性［26-27］，導致疾病進展。CCL2通過直接和間接途徑促進腫瘤血管生成，CCL2與血管內(nèi)皮細胞上的CCR2受體結合，可以直接促進血管生成［28］。CCL2通過趨化單核細胞到腫瘤微環(huán)境中，導致大量IL-6釋放，促進血管生成［29］，增強循環(huán)腫瘤細胞的遷移和侵襲［30］。CCL2通過PI3K/Akt/mTOR信號通路、AKT/β-catenin信號通路促進上皮-間充質(zhì)轉化［24，31］。CCL2通過增加腫瘤相關巨噬細胞的募集、減少CD8+T細胞浸潤等［30，32-37］調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞。阻斷CCL2通路在抗腫瘤治療中發(fā)揮關鍵作用［37-40］。綜上所述，趨化因子CCL2通過間接途徑參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，與本研究結果相符。

本研究的優(yōu)勢在于：（1）從基因層面分析趨化因子CCL2對肺癌的影響，能夠避免受到環(huán)境因素、研究者因素、社會因素等混雜因素的影響，同時排除了反向因果關系影響。（2）資料來源于公共數(shù)據(jù)庫，樣本量大，人群統(tǒng)一，根據(jù)病理分型進行了亞組分析，避免不同人群異質(zhì)性和病理類型造成的混雜影響。（3）使用逆方差加權法、加權中位數(shù)法、簡單模式法、MR-Egger回歸法、加權模式法進行分析，較為全面，數(shù)據(jù)結果可靠性高。

本研究的局限性在于：（1）工具變量篩選時，因獲得SNP數(shù)量較少，將閾值調(diào)整為P＜1 × 10-5，擴大了SNP的納入范圍，可能會導致混雜因素影響。（2）公共數(shù)據(jù)庫缺少其他血統(tǒng)的趨化因子CCL2和肺癌資料，最終選用了歐洲血統(tǒng)進行分析，限制結果外推。（3）受到研究資料的限制，未對性別、年齡、吸煙與否等條件進行亞組分析。

綜上所述，基于孟德爾隨機化分析，趨化因子CCL2與肺癌沒有直接因果關系。趨化因子CCL2可能通過其他途徑間接影響肺癌結局，仍需后續(xù)臨床、基礎研究補充證明。