徐俐 胡珊珊 趙海明

四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院（電子科技大學附屬醫(yī)院）消化內科 （成都 610000）

胃癌（gastric cancer，GC）致死率較高，在全球因癌死亡主要原因中排第2位，其中約有40%的GC患者在中國，嚴重威脅人們的身體健康和生存質量［1-2］。由于早期GC幾乎沒有任何癥狀，約70%以上的患者在診斷時病程已進入晚期，這給后續(xù)治療造成了巨大挑戰(zhàn)［3］。GC的發(fā)病機制復雜，涉及因素較多，因此，探索GC的病理機制和新的治療靶點對提高治療效果、抑制腫瘤進展具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是多種癌癥的潛在生物標志物和治療靶點，能參與癌細胞增殖、凋亡、血管生成等多種生物學過程［4-5］。GNAS反義RNA1（GNAS antisense RNA 1，GNASAS1）是GNAS的基因轉錄本之一，位于人類染色體20q13.3，研究發(fā)現GNAS-AS1能夠促進乳腺癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤的發(fā)展進程［6-7］。miR-449a在含GC在內的多種癌癥中出現異常低表達，且具有治療潛能，發(fā)揮著腫瘤抑制作用［8］。缺刻基因1（Notch1）屬于跨膜受體家族Notch，Notch信號通路中蛋白的異常表達與多種癌癥如非小細胞肺癌、GC的發(fā)展密切相關［9］。但GNAS-AS1與GC中miR-449a/Notch1軸之間的關系仍有待進一步研究。本研究探究GNAS-AS1對GC細胞AGS增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集四川省人民醫(yī)院2013年9月至2017年9月30例GC患者腫瘤組織及癌旁組織標本。所有參與患者均需排除同時患有其他癌癥的可能性。所獲取全部人體標本均事先經患者或其委托人簽署知情同意書，并獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 細胞GC細胞株AGS購自于中國科學院上海生命科學研究院。

1.3 主要試劑與儀器胰蛋白酶、Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher公司；MTT試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑、RIPA裂解液購自美國Invitrogen公司；Transwell小室，美國Corning公司；Notch1、E-cadherin、Vimentin、Ncadherin、GAPDH一抗和相應二抗購自Affinity公司；si-GNAS-AS1、si-NC、miR-449a inhibitor、inhibi?tor NC，上海吉瑪制藥技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，上海鈺博生物科技有限公司。RT-qPCR儀購自美國Applied Biosystems公司；酶標儀（美國BioTek公司）。

1.4 細胞培養(yǎng)在37 ℃加5% CO2的濕空氣中，AGS細胞在RPMI-1640中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和抗生素（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL）。

1.5 細胞分組與處理AGS細胞接種到6孔板（3 × 105個/孔），貼壁后分為si-GNAS-AS1組（轉染si-GNAS-AS1）、si-NC組（轉染si-NC）、si-GNASAS1+miR-449a inhibitor組（共轉染si-GNAS-AS1與miR-449a inhibitor）、si-GNAS-AS1+inhibitor NC組（共轉染si-GNAS-AS1與inhibitor NC）、對照組（Control組，不轉染）。轉染過程按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒的制造商說明進行，共轉染48 h。

1.6 RT?qPCR測定GNAS?AS1、miR?449a和Notch1 mRNA表達用Trizol試劑從組織或培養(yǎng)AGS細胞中提取總RNA，程序按照提供的指南執(zhí)行。然后通過逆轉錄試劑盒將分離的總RNA逆轉錄成cDNA。使用RT-qPCR儀，結合TransStart Top Green qPCR Super Mix進行PCR擴增。使用2-ΔΔCt法進行數據量化，以GAPDH為內參，分析GNAS-AS1和Notch1 mRNA表達水平；以U6為內參，分析miR-449a表達水平。RT-qPCR確切的引物序列見表1。

表1 引物設計序列Tab.1 Primers design sequence

1.7 MTT法檢測細胞增殖能力取對數期AGS細胞以密度5 × 103個/孔接種在96孔板中，按1.5方法進行分組與處理。孵育48 h，棄去上層培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h。吸取上清液，每孔添加150 μL甲臜增溶溶液，于振蕩器上振蕩10 min，使甲臜全部溶解。在490 nm處測定各樣品吸光度（OD490）。

1.8 平板克隆形成實驗測量細胞增殖將AGS細胞（1 × 103/孔）接種于6孔板，培養(yǎng)2周，固定后用結晶紫染色。人工計數＞30個細胞形成的菌落。

1.9 wound healing法測定細胞遷移AGS細胞接種在6孔板（1 × 105個/孔）。當細胞融合約80%時，用200 μL移液槍尖端進行劃痕，分別在0 h和48 h觀察記錄細胞遷移情況，并用Image J計算劃痕愈合率。以0 h和48 h劃痕寬的差值與0 h劃痕寬的百分比表示劃痕愈合率。

1.10 Transwell法測定細胞侵襲Transwell小室的基底膜預涂Matrigel，37 ℃過夜。將AGS細胞重懸（1 × 105個/mL），并添加到Transwell上腔，添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于下腔。孵育1 d后，用棉簽輕輕清潔上腔過濾器上表面的細胞。然后，將濾光片固定在4%多聚甲醛中，并用0.1%結晶紫染色。PBS洗滌3次后，對穿過濾光片的細胞進行成像，在顯微鏡下隨機計數5次，計算浸潤細胞的數量。

1.11 Western Blot測定蛋白Notch1、Vimentin、E?cadherin、N?cadherin表達在RIPA裂解液中冰孵育AGS細胞30 min后，細胞在4 ℃下離心15 min（10 000 ×g）。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。然后用SDS-PAGE分離蛋白，轉移到聚偏二氟乙烯膜上1 h。用5%脫脂奶粉在室溫阻斷1 h。加入1∶1 000稀釋的Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、GAPDH一抗，在4 ℃下保存過夜。在3次洗膜后，用各自的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。膜用ECL試劑孵育以觀察蛋白質。使用Image Lab?進行免疫印跡定量。

1.12 雙熒光素酶報告基因實驗TargetScan預測miR-449a與GNAS-AS1和Notch1的位點結合。通過將含有預測miR-449a結合位點的GNAS-AS1 cDNA克隆到pmirGLO雙熒光素酶miRNA靶表達載體中，構建GNAS-AS1-WT熒光素酶報告載體。通過在miR-449a結合位點插入含有點突變的突變體GNAS-AS1，生成GNAS-AS1-MUT載體。同樣，將野生型和突變型Notch1 3′-UTR片段克隆到pmirGLO載體中，構建Notch1-WT和Notch1-MUT熒光素酶報告載體。用Lipofectamine 2000在AGS細胞中轉染miR-449a mimic或miR-NC與報告載體48 h，使用熒光測定儀測量熒光素酶活性。

1.13 統計學方法Graphpad Prism 7.0用于統計分析，計量數據以均數±標準差（）表示。采用單因素方差分析（3組及以上）、t檢驗（兩組）確定統計學顯著性，LSD-t用于單因素方差分析后的兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GNAS?AS1、miR?449a和Notch1 mRNA在GC組織中的表達比較腫瘤組織與癌旁組織相比，GNAS-AS1、Notch1 mRNA表達升高（P＜0.05），miR-449a表達降低（P＜0.05）。見表2。

表2 腫瘤組織與癌旁組織中GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表達比較Tab.2 Comparison of GNAS-AS1，miR-449a and Notch1 mRNA expression in tumor tissues and adjacent tissues ±s，n = 30

表2 腫瘤組織與癌旁組織中GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表達比較Tab.2 Comparison of GNAS-AS1，miR-449a and Notch1 mRNA expression in tumor tissues and adjacent tissues ±s，n = 30

注：與癌旁組織相比，*P＜0.05

組別癌旁組織腫瘤組織Notch1 1.00±0.00 2.17±0.24*GNAS-AS1 1.00±0.00 2.58±0.28*miR-449a 1.00±0.00 0.41±0.05*

2.2 GNAS?AS1、miR?449a和Notch1 mRNA在AGS細胞中的表達比較si-GNAS-AS1組相較于si-NC組、Control組，GNAS-AS1和Notch1 mRNA下調表達，miR-449a上調表達（P＜0.05）。si-GNASAS1+miR-449a inhibitor組相較于si-GNAS-AS1+in?hibitor NC組、si-GNAS-AS1組，Notch1 mRNA表達升高，miR-449a表達降低（P＜0.05），GNAS-AS1表達沒有明顯變化（P＞0.05）。見表3。

表3 各組AGS細胞中GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表達比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of GNAS-AS1，miR-449a and Notch1 in AGS cells of each group ±s，n = 6

表3 各組AGS細胞中GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表達比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of GNAS-AS1，miR-449a and Notch1 in AGS cells of each group ±s，n = 6

注：*P＜0.05 vs.Control組；#P＜0.05 vs.si-NC組；&P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1組；^P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1+inhibitor NC組

組別Control組si-NC組si-GNAS-AS1組si-GNAS-AS1+inhibitor NC組si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組Notch1 1.00±0.00 1.02±0.12 0.45±0.05*#0.43±0.04 0.86±0.09&^GNAS-AS1 1.00±0.00 1.01±0.12 0.36±0.04*#0.34±0.04 0.35±0.04 miR-449a 1.00±0.00 1.02±0.11 2.25±0.24*#2.23±0.24 1.62±0.18&^

2.3 各組細胞活力（OD490）的比較si-GNAS-AS1組OD490值低于Control組、si-NC組（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組OD490值高于si-GNAS-AS1組、si-GNAS-AS1+inhibitor NC組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組細胞OD490、劃痕愈合率、克隆形成數和細胞侵襲數目的比較Tab.4 Comparison of OD490，scratch healing rate，number of clone formation and number of cell invasion in each group ±s，n=6

表4 各組細胞OD490、劃痕愈合率、克隆形成數和細胞侵襲數目的比較Tab.4 Comparison of OD490，scratch healing rate，number of clone formation and number of cell invasion in each group ±s，n=6

注：*P＜0.05 vs.Control組；#P＜0.05 vs.si-NC組；&P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1組；^P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1+inhibitor NC組

組別Control組si-NC組si-GNAS-AS1組si-GNAS-AS1+inhibitor NC組si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組細胞侵襲數目（個）157.69±8.48 159.44±10.08 93.21±8.34*#90.89±10.25 138.54±11.55&^OD490 0.70±0.08 0.68±0.07 0.29±0.03*#0.27±0.03 0.61±0.06&^克隆形成數（個）108.42±7.30 106.22±6.47 52.69±3.38*#55.38±5.02 86.79±7.08&^劃痕愈合率（%）42.66±5.18 43.45±4.42 17.69±2.14*#18.32±1.97 38.85±3.56&^

2.4 各組細胞克隆形成數比較si-GNAS-AS1組的克隆形成數低于Control組、si-NC組（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組的克隆形成數高于si-GNAS-AS1組、si-GNAS-AS1+inhibitor NC組（P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 細胞克隆形成觀察Fig.1 Observation of cell clonal formation

2.5 各組劃痕愈合率比較si-GNAS-AS1組劃痕愈合率低于si-NC組、Control組（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組劃痕愈合率高于si-GNAS-AS1+inhibitor NC組、si-GNAS-AS1組（P＜0.05）。見表4和圖2。

圖2 wound healing實驗檢測AGS細胞遷移能力Fig.2 Migration ability of AGS cells was detected by wound healing experiment

2.6 各組細胞侵襲能力的比較si-GNAS-AS1組細胞侵襲數目少于si-NC組、Control組（P＜0.05）；si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組的侵襲數目多于si-GNAS-AS1+inhibitor NC組、si-GNAS-AS1組（P＜0.05）。見表4和圖3。

圖3 Transwell實驗檢測AGS細胞侵襲能力Fig.3 The invasion ability of AGS cells was detected by Transwell test

2.7 各組細胞Notch1、E?cadherin、Vimentin、N?cadherin蛋白表達比較si-GNAS-AS1組與si-NC組、Control組比較，Vimentin、Notch1、N-cadherin蛋白下調表達，E-cadherin蛋白上調表達（P＜0.05）。si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組與si-GNAS-AS1+inhibitor NC組、si-GNAS-AS1組比較，Notch1、Vi?mentin、N-cadherin蛋白表達升高，E-cadherin蛋白表達降低（P＜0.05）。見表5和圖4。

圖4 Western Blot檢測AGS細胞Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的表達Fig.4 Western Blot analysis of Notch1，E-cadherin，Vimentin，N-cadherin protein expression in AGS cells

表5 各組細胞Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的表達比較Tab.5 Comparison of protein expression of Notch1，E-cadherin，Vimentin and n-cadherin in each group ±s，n = 6

表5 各組細胞Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的表達比較Tab.5 Comparison of protein expression of Notch1，E-cadherin，Vimentin and n-cadherin in each group ±s，n = 6

注：*P＜0.05 vs.Control組；#P＜0.05 vs.si-NC組；&P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1組；^P＜0.05 vs.si-GNAS-AS1+inhibitor NC組

組別Control組si-NC組si-GNAS-AS1組si-GNAS-AS1+inhibitor NC組si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor組N-cadherin 0.87±0.09 0.89±0.09 0.35±0.03*#0.33±0.03 0.76±0.08&^Notch1 0.79±0.08 0.81±0.08 0.32±0.03*#0.30±0.03 0.68±0.07&^E-cadherin 0.28±0.03 0.26±0.03 0.70±0.07*#0.72±0.07 0.42±0.04&^Vimentin 0.85±0.09 0.83±0.08 0.40±0.04*#0.42±0.04 0.75±0.07&^

2.8 GNAS?AS1通過miR?449a調控Notch1的表達圖5、圖6顯示，miR-449a和GNAS-AS1、Notch1之間具有的結合位點。miR-449a mimic與GNASAS1-WT共轉染組的熒光素酶活性低于miR-NC與GNAS-AS1-WT共轉染組（P＜0.05，表6）。miR-449a mimic與Notch1-WT共轉染組的熒光素酶活性低于miR-NC與Notch1-WT共轉染組（P＜0.05，表7）。

圖5 GNAS-AS1和miR-449a的結合位點預測Fig.5 Prediction of binding sites of GNAS-AS1 and miR-449a

圖6 miR-449a和Notch1間的結合位點預測Fig.6 Prediction of binding sites between miR-449a and Notch1

表6 各組熒光素酶活性比較Tab.6 Comparison of luciferase activities in each group ±s，n = 6

表6 各組熒光素酶活性比較Tab.6 Comparison of luciferase activities in each group ±s，n = 6

注：與miR-NC與GNAS-AS1-WT共轉染組相比，*P＜0.05

組別miR-NC與GNAS-AS1-WT共轉染組miR-NC與GNAS-AS1-MUT共轉染組miR-449a mimic與GNAS-AS1-WT共轉染組miR-449a mimic與GNAS-AS1-MUT共轉染組熒光素酶活性1.07±0.13 1.04±0.13 0.34±0.04*1.06±0.13

表7 熒光素酶活性比較Tab.7 Comparison of luciferase activities ±s，n = 6

表7 熒光素酶活性比較Tab.7 Comparison of luciferase activities ±s，n = 6

注：與miR-NC與Notch1-WT共轉染組相比，*P＜0.05

組別miR-NC與Notch1-WT共轉染組miR-NC與Notch1-MUT共轉染組miR-449a mimic與Notch1-WT共轉染組miR-449a mimic與Notch1-MUT共轉染組熒光素酶活性1.03±0.13 1.07±0.13 0.46±0.05*1.01±0.11

3 討論

GNAS-AS1作為一種LncRNA，在多種腫瘤組織和細胞中呈現異常表達。馬虹飛等［10］研究發(fā)現GNAS-AS1在肺鱗癌組織中高表達，且與腫瘤分期相關；GNAS-AS1能通過調節(jié)MAPK信號通路的活性影響肺鱗癌的進展，可能是肺鱗癌的治療靶點之一。宋芷霜等［11］研究發(fā)現GNAS-AS1在卵巢癌細胞中表達升高，下調其表達可以降低卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲等能力，這可能是通過負調控miR-2116-3p的表達實現的。提示GNAS-AS1是癌癥治療的可能靶點。本實驗中，GC腫瘤組織中GNAS-AS1上調表達，敲低GNAS-AS1抑制了AGS細胞的遷移、侵襲和增殖能力。揭示GNAS-AS1在GC進展中發(fā)揮促癌功能。

miRNA已被眾多研究證明在癌癥的進展中起著重要的作用。我們通過生物信息學分析顯示，miR-449a具有與GNAS-AS1相互補的序列。目前已有廣泛的報道表明miR-449a在多種癌癥中出現異常表達，黃潔等［12］研究發(fā)現miR-449a在肺癌細胞A549中的表達低于肺正常細胞，且miR-449a能夠通過靶向HDAC1的表達，抑制肺癌的增殖、侵襲和遷移。LAN等［13］研究發(fā)現miR-449a在結直腸癌細胞中低表達，通過提高miR-449a的表達可以提高自噬能力，抑制結直腸癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲等。杜晨旭等［14］研究發(fā)現miR-449a在人宮頸癌細胞中呈低表達，沉默LINC01123可以通過上調miR-449a表達，抑制HGF/c-MET信號通路，進而阻礙宮頸癌細胞的轉移和生長。本實驗發(fā)現，沉默GNAS-AS1升高miR-449a表達。在沉默sGNAS-AS1基礎上下調miR-449a表達后，細胞增殖、侵襲、遷移被抑制。提示GNASAS1敲低可能通過促進miR-449a表達阻滯AGS細胞的遷移、侵襲和增殖過程。

通過查詢targetscan數據庫，我們發(fā)現miR-449a潛在的靶基因包括Notch1。Notch信號通路高度保守，其在細胞分化、增殖、組織發(fā)育、穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，也與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關［15-16］。ZHANG等［17］研究發(fā)現激活Notch信號通路可通過調節(jié)上皮間質轉化通路和HES-1表達加速乳腺癌細胞遷移和增殖過程。賈曉瓊等［18］研究發(fā)現miR-449a可以誘導非小細胞肺癌NCIH1975細胞凋亡和增殖抑制，其作用機制可能與抑制Notch1信號有關。本實驗發(fā)現，敲低GNASAS1使Notch1下調表達，而抑制miR-449a可增高Notch1蛋白表達，提示沉默GNAS-AS1對AGS細胞遷移、侵襲、增殖的抑制作用可能與提高miR-449a來下調Notch1表達有關。

綜上，我們在GC中發(fā)現了miR-449a及其直接靶點Notch1對GNAS-AS1的一種新的調控機制。GNAS-AS1的表達減少通過影響GC的增殖、侵襲和轉移而阻礙GC的進展。因此，LncRNA GNASAS1可能在GC中發(fā)揮促瘤作用，提示GNAS-AS1作為GC治療的新靶點的潛力。本研究的主要局限性是臨床受試者較少，并且由于現有實驗室和設備的限制，缺乏體內實驗。為了更全面地了解這種LncRNA作為潛在生物標志物的適用性，在后續(xù)的臨床試驗中納入更大的患者群體將是謹慎的。