張正皓 馬芳 張晴 夏童童 劉虹麟，3 白志剛，4 盧冠軍，5 張競文 彭紅建，6 姜怡鄧 馬勝超，3

寧夏醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3檢驗(yàn)學(xué)院 （銀川 750004）；2國家衛(wèi)生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （銀川 750004）；4寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 （銀川 750004）；5寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 （銀川 750004）；6中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 （長沙 410083）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作為慢性腎臟疾病患者心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，由蛋氨酸和半胱氨酸共同代謝形成。腎臟是Hcy重要代謝場所之一，當(dāng)血清中Hcy含量超過15 μmol/L即可診斷為高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocyste?inemia，HHcy）。HHcy引起腎小球受損和腎臟功能下降進(jìn)而導(dǎo)致慢性腎炎、慢性腎功能不全等腎病綜合征［1］，終末期腎臟疾病患者中HHcy的發(fā)病率高達(dá)85%［2］。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的主要組成部分，其功能是維持體內(nèi)水、電解質(zhì)和代謝物的穩(wěn)態(tài)，足細(xì)胞的功能障礙或損傷是腎小球疾病的主要病理基礎(chǔ)之一［3］。足細(xì)胞焦亡將導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少，裂孔膜破壞、足突融合和蛋白尿產(chǎn)生，最終引起腎損傷，但是其作用機(jī)制還尚未清楚。有研究［4］顯示Hcy水平升高可導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷，致使其功能障礙，但Hcy能否引起足細(xì)胞發(fā)生焦亡及其作用機(jī)制目前尚未闡明。因此，深入探究足細(xì)胞發(fā)生焦亡的作用機(jī)制，將對未來防治腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，ln?cRNA）作為轉(zhuǎn)錄因子和染色體的修飾因子，通常與DNA、RNA和蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)修飾。lncRNA細(xì)胞功能多樣，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞焦亡、信號傳遞等多個(gè)方面。核仁小RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene1，SNHG1），在人類基因組中位于11q12.3位置，在多種疾病發(fā)生過程中扮演重要角色。CUI 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)lncSNHG1能夠有效抑制miR-101-3p的表達(dá)水平，激活下游Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而影響非小細(xì)胞肺癌的的發(fā)生發(fā)展；此外，腎癌組織中l(wèi)ncSNHG1呈高表達(dá)，lnc?SNHG1敲除后能夠抑制腎癌增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的作用也被相繼報(bào)道［6］。然而關(guān)于lncSNHG1在Hcy誘導(dǎo)足細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制尚未報(bào)道。因此，本研究觀察和分析lncSNHG1的表達(dá)及其對足細(xì)胞焦亡的作用，探討lncSNHG1在Hcy誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生焦亡中的具體作用，將為Hcy引起的腎損傷提供潛在靶向預(yù)防和治療新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器細(xì)胞株：小鼠腎小球細(xì)胞株（MPC-5）由寧夏醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系惠贈；同型半胱氨酸（美國，Sigma）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國，Gibco）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（北京，索萊寶）；超凈工作臺（蘇州，安泰空氣技術(shù)）；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（德國，Heraeus）；5415D微型離心機(jī)（德國，Eppendorf）；總蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液（江蘇，凱基生物）；總RNA提取試劑盒（北京，天根生化）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本，TaKaRa）；小鼠GAPDH內(nèi)參引物及l(fā)ncSNGH1上下游引物（上海，生工生物工程）；實(shí)時(shí)熒光定量分析儀（德國，耶拿）；激光共聚焦顯微鏡（德國，ZEISS）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀及凝膠成像儀（美國，Bio-Rad）；熒光顯微鏡（日本，Olympus）；酶標(biāo)儀（美國，BioTek）；ELISA IL-1β、IL-18炎癥因子試劑盒（上海，科艾博生物）；Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3抗體（美國，Cell Signaling Technology）、GSDMD、GSDMDN抗體（江蘇，Affinity）；辣根過氧化物酶（HRP）、熒光羊抗兔二抗（北京，博奧森）；β-actin抗體（武漢，愛博泰克）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物SPF級18只雄性雜合子Cbs+/-小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室，體質(zhì)量25～30 g，8周齡，合格證號：SCXK（京）2016-0006，小鼠飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 動物及分組選取18只Cbs+/-小鼠隨機(jī)分成兩組（每組9只），設(shè)置正常飲食組（ND）和高蛋氨酸飲食組（HMD），正常飲食中加入2%蛋氨酸。晝夜節(jié)律12 h，室內(nèi)環(huán)境溫度（25±2） ℃，相對濕度60%，每2天更換飼養(yǎng)籠1次，喂養(yǎng)8周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組足細(xì)胞采用DMEM（高糖）培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素）培養(yǎng)，條件：37 ℃、5% CO2。細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，設(shè)置對照組（Control，0 μmol/L Hcy）和同型半胱氨酸干預(yù)組（Hcy，80 μmol/L Hcy），干預(yù)細(xì)胞48 h后，檢測焦亡相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組依照過表達(dá)慢病毒載體試劑盒說明書按步驟培養(yǎng)足細(xì)胞至對數(shù)生長期，細(xì)胞密度達(dá)40%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置對照組（Con?trol）、lncSNHG1過表達(dá)陰性對照組（OE-NC）和lnc?SNHG1過表達(dá)組（OE-SNHG1）；轉(zhuǎn)染后同型半胱氨酸干預(yù)細(xì)胞，設(shè)置lncSNHG1過表達(dá)陰性對照+同型半胱氨酸干預(yù)組（OE-NC+Hcy）和lncSNHG1過表達(dá)+同型半胱氨酸干預(yù)組（OE-SNHG1+Hcy）。干預(yù)細(xì)胞48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建效果鑒定lncSNHG1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞72 h后，通過熒光顯微鏡下觀察足細(xì)胞綠色熒光情況；qRT-PCR法檢測足細(xì)胞中l(wèi)ncSNHG1表達(dá)水平。

1.2.5 qRT?PCR法檢測lncRNA SNHG1表達(dá)水平依據(jù)RNA提取試劑盒說明書分別提取各組細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測。Gene Bank數(shù)據(jù)庫查詢lncSNHG1基因序列并設(shè)計(jì)引物（上海，生工生物工程）合成。lncSNHG1引物序列Forward；5′-TCCTT?GTTCGGGGTTTGAGG-3′，Reverse：5′-ACAGCACCCTGACTACAAGC-3。GADPH引物序列Forward；5′-ACCCAGAAGACTGTGGAGG-3′，Reverse：5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3′。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix×4 1.0 μL、5× PrimeScriptBuffer2（For Real Time） 4.0 μL、RNase Free dH2O 4.0 μL；PCR反應(yīng)體系：TBGreen 10 μL、上下游引物各0.8 μL、RNase Free dH2O 6.4 μL、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL；lnc SNHG1熒光定量PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、57.8 ℃ 34 s，共35個(gè)循環(huán)。以小鼠GADPH內(nèi)參基因?yàn)閷φ?，目的基因相對量根?jù)公式2-ΔΔCt分析lnc SNHG1的表達(dá)。公式如下：ΔΔCt=［Ct目的基因（對照組）-Ct內(nèi)參基因（對照組）-］-［（Ct目的基因（實(shí)驗(yàn)組）-Ct內(nèi)參基因（實(shí)驗(yàn)組）］，2-ΔΔCt表示的是目的基因表達(dá)量相對于對照組的變化倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot法檢測Caspase?1、Cleaved Caspase?1、NLRP3蛋白表達(dá)水平依據(jù)分組收取細(xì)胞，根據(jù)凱基蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白樣品濃度。上樣蛋白經(jīng)SDS?PAGE凝膠電泳90 V 20 min，120 V 30 min濕轉(zhuǎn)2 h轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉的PBST封閉4 h，PBST洗膜10 min × 3次；依次加入Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3特異性一抗（1∶1 000）4 ℃搖床孵育過夜；次日加入HRP標(biāo)記的兔二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育2 h，PBST洗膜10 min × 3次；ECL試劑盒發(fā)光顯色，凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。Image Lab軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參對照，計(jì)算Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3蛋白與β?actin內(nèi)參灰度值的比值做定量分析。

1.2.7 ELISA法檢測白細(xì)胞介素IL?1β、IL?18含量依據(jù)分組處理細(xì)胞，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣品稀釋液40 μL及待測樣品10 μL；每孔加酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外；封板膜封板60 min；棄去液體，甩干，每孔加洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次；每孔加顯色劑37 ℃避光顯色15 min后加終止液50 μL；以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔吸光度（OD值）。

1.2.8 免疫熒光法檢測GSDMD、GSDMD?N表達(dá)足細(xì)胞密度達(dá)50%鋪皿，同型半胱氨酸干預(yù)細(xì)胞48 h后收皿，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，山羊血清封閉30 min，配置GSDMD、GSDMD-N特異性抗體（1∶200）4 ℃搖床孵育過夜，次日加入FITC熒光標(biāo)記二抗避光孵育60 min，細(xì)胞核染色避光孵育5 min，使用激光共聚焦取視野拍照采取圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行制圖。結(jié)果采用（）表示，并滿足方差齊性。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way A NOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高蛋氨酸小鼠腎臟組織中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Western blot檢測Cbs+/-小鼠腎臟組織中的焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與ND組相比較，HMD組中Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 檢測ND、HMD組中的焦亡蛋白表達(dá)Fig.1 Detection of the expression of pyroptosis in ND and HMD groups

2.2 同型半胱氨酸對足細(xì)胞焦亡的影響Western blot和免疫熒光分別檢測了足細(xì)胞中焦亡蛋白表達(dá)水平，使用ELISA檢測焦亡介導(dǎo)的炎癥因子含量。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Control組相比較，Hcy組中焦亡蛋白Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3表達(dá)水平增高（P＜0.05，P＜0.01）；免疫熒光結(jié)果顯示：與Control組相比較，Hcy組中焦亡蛋白GSDMD、GSDMD-N表達(dá)水平增高；ELISA結(jié)果顯示：與Control組相比較，Hcy組中焦亡介導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和IL-18的含量增高（P＜0.01）。見圖2。

2.3 同型半胱氨酸對lncRNA SNHG1表達(dá)水平的影響qRT?PCR法檢測了足細(xì)胞中l(wèi)ncSNHG1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與Control組相比較，Hcy組中l(wèi)ncSNHG1的表達(dá)水平增高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 LncSNHG1在Hcy干預(yù)的足細(xì)胞中高表達(dá)Fig.3 LncSNHG1 is High-expression in homocysteine intervention podium

2.4 過表達(dá)lncRNA SNHG1慢病毒載體構(gòu)建為了探究過表達(dá)lncSNHG1慢病毒載體在足細(xì)胞中是否構(gòu)建成功。通過鏡下觀察足細(xì)胞轉(zhuǎn)染的綠色熒光，qRT?PCR法檢測足細(xì)胞中l(wèi)ncSNHG1表達(dá)水平。結(jié)果顯示：慢病毒轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞72 h后，可見較強(qiáng)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率＞80%；qRT?PCR法結(jié)果顯示：與Control組和OE-NC組相比較，OE-SNHG1組中l(wèi)ncSNHG1的表達(dá)水平增高（P＜0.01）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示慢病毒載體在足細(xì)胞中構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖4。

圖4 過表達(dá)慢病毒lncSNHG1載體構(gòu)建結(jié)果Fig.4 Construction of lentivirus overexpressed lncSNHG1

2.5 過表達(dá)lncRNA SNHG1對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的足細(xì)胞焦亡的影響Western blot和免疫熒光技術(shù)分別檢測了足細(xì)胞中的焦亡蛋白表達(dá)水平，使用ELISA檢測焦亡介導(dǎo)的炎癥因子含量。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與OE-NC+Hcy組相比較，OE-SNHG1+Hcy組中焦亡蛋白Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3表達(dá)水平增高（P＜0.05，P＜0.01）；免疫熒光結(jié)果顯示：與OE-NC+Hcy組相比較，OE-SNHG1+Hcy組中焦亡蛋白GSDMD、GSDMD-N表達(dá)水平增高；ELISA結(jié)果顯示：與OENC+Hcy組相比較，OE-SNHG1+Hcy組中焦亡介導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和IL-18的含量增高（P＜0.01）；見圖5。

圖5 檢測OE-NC+Hcy、OE-SNHG1+Hcy組中的焦亡相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)Fig.5 Detection of the expression of pyroptosis related indicators in OE-NC+Hcy and OE-SNHG1+Hcy groups

3 討論

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）指多種原因?qū)е履I臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異質(zhì)性疾病的總稱。CKD主要特征是通過炎癥、纖維化和高濾過等過程損害腎小球、血管供應(yīng)和腎小管間質(zhì)。足細(xì)胞是腎小球有絲分裂后高度分化的上皮細(xì)胞，通過血漿蛋白和腎小球基底膜之間的支撐作用過濾血漿，在維持腎小球?yàn)V過屏障功能和結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用［7］。當(dāng)足細(xì)胞損傷或功能發(fā)生障礙時(shí)會引起細(xì)胞內(nèi)信號通路異常、基質(zhì)增生和炎癥反應(yīng)使腎小球?yàn)V過膜破壞，進(jìn)而導(dǎo)致慢性腎臟疾?。?］。有文獻(xiàn)［9］報(bào)道，腎臟是Hcy代謝途徑之一，因此Hcy與慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，所以Hcy可以作用于足細(xì)胞并引起腎小球結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，但具體作用機(jī)制尚未明確。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種依賴Caspase蛋白，伴隨炎癥反應(yīng)的特殊程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡通過清除病原體或產(chǎn)生炎性信號來保護(hù)機(jī)體，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)源性信號的作用下，導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展［10］。經(jīng)典細(xì)胞焦亡信號通路，由活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）切割并激活成孔細(xì)胞通透性蛋白gasdermin-D在細(xì)胞膜上成孔、細(xì)胞腫脹、質(zhì)膜破裂，繼而釋放炎性胞質(zhì)內(nèi)容物IL-1β、IL-18和其他物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂引起炎性反應(yīng)［11-12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高蛋氨酸飲食小鼠腎臟組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)增高；體外80 μmol/L Hcy干預(yù)足細(xì)胞48 h后Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3和GSDMD、GSDMD-N表達(dá)增高，焦亡介導(dǎo)的炎癥因子IL-1β、IL-18含量增高。提示Hcy可以誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生焦亡進(jìn)而引起足細(xì)胞損傷。但Hcy具體通過何種途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生焦亡尚未明確。

長鏈非編碼RNA在人類疾病中已成為新的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，長鏈非編碼核仁小分子RNA宿主基因1在多種疾病組織中具有顯著特異性，廣泛參與人體生理調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，在調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展有著重要作用［13］。ZHANG等［14］研究發(fā)現(xiàn)，SNHG1通過抑制miR-195-5p的表達(dá)來促進(jìn)肝臟癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。LEI等［15］在對骨關(guān)節(jié)炎的研究中證實(shí)，SNHG1可介導(dǎo)p38 MAPK-NF-κB信號通路減緩骨關(guān)節(jié)炎的代謝功能障礙與炎性狀態(tài)，并提出SNHG1可以緩解骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。XU等［16］發(fā)現(xiàn)SNHG1基因敲除可抑制肌層浸潤性膀胱癌癌細(xì)胞的侵襲。另有研究者通過GEO數(shù)據(jù)庫的分析顯示，SNHG1在腎癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與腎癌患者預(yù)后不良相關(guān)［17］。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Hcy誘導(dǎo)的足細(xì)胞lncSNHG1表達(dá)增高；過表達(dá)lnc?SNHG1后足細(xì)胞中Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3和GSDMD、GSDMD-N表達(dá)增高，焦亡介導(dǎo)的炎癥因子IL-1β、IL-18含量增加。提示，在Hcy誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生焦亡過程中，過表達(dá)lncSNHG1可以進(jìn)一步促進(jìn)足細(xì)胞發(fā)生焦亡，進(jìn)而加速腎臟損傷。

綜上所述，lncSNHG1在慢性腎臟疾病中介導(dǎo)的分子功能和細(xì)胞機(jī)制是復(fù)雜的，涉及多個(gè)因素。這些分子機(jī)制對泌尿生殖系統(tǒng)的臨床診斷、治療和預(yù)后有重要意義。本文首次探究了lncSNHG1在Hcy誘導(dǎo)的足細(xì)胞焦亡中的具體調(diào)控作用。提示lncSNHG1可作為慢性腎臟疾病的一種新型靶向標(biāo)記，為進(jìn)一步研究足細(xì)胞焦亡的具體作用機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？紤]本次實(shí)驗(yàn)條件存在局限性，隨著基因組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證lncSNHG1在HHcy致腎損傷中的作用，闡明足細(xì)胞焦亡引起腎功能障礙的分子機(jī)制，為進(jìn)一步治療HHcy引起的腎損傷提供理論依據(jù)。