劉永輝 譚慶晶 陳清 韋理萍 楊俊威 楊侃 高玉廣

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1腦病科，2康復(fù)科，4急診科 （南寧 530023）；3廣西中醫(yī)藥大學(xué) （南寧 530001）

抑郁癥是臨床常見的精神障礙性疾病，以心境低落、興趣與偷快感喪失、易疲勞等為主要臨床表現(xiàn)。研究顯示，全球共有3.22億人患抑郁癥，占全世界總?cè)丝诘?.4%，2020年，其疾病負(fù)擔(dān)占全球疾病負(fù)擔(dān)的7.5%，僅排在缺血性心臟病之后，居全球非致命性疾病之首［1-2］。目前抑郁癥的臨床治療主要以西藥治療為主，約有1/3的患者西藥治療無效［3］，20%～40%患者不能顯著緩解病情，且調(diào)整用藥仍難以奏效，并經(jīng)歷病情的反復(fù)，漸而加重病情，致使部分患者走向自殺的道路［4-5］。微小RNA（microRNA，miRNA）屬于非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）中的一種［6］，它具有微調(diào)多種不同分子過程的潛力［7］，參與了包括神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、樹突生長、突觸重塑、膠質(zhì)細(xì)胞增生等多個(gè)抑郁癥生物學(xué)過程［8-9］。miRNA不僅可以輔助診斷抑郁癥，還可以預(yù)測藥物反應(yīng)和評(píng)估疾病的預(yù)后［10］。研究表明，miR-421可通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡抵抗而使腫瘤消退，而Menin作為miR-421的靶標(biāo)，過表達(dá)Menin可逆轉(zhuǎn)miR-421的神經(jīng)凋亡作用［11］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Menin蛋白及其下游因子Caspase-3在抑郁小鼠海馬組織中為低表達(dá)，抑制Menin、Caspase-3的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)抑郁樣行為的發(fā)生［12-13］。由此，推測miR-421可通過調(diào)控Menin、Caspase-3的表達(dá)而影響抑郁癥的相關(guān)機(jī)制。為此，本研究擬開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究miR-421影響抑郁癥的相關(guān)機(jī)制，為臨床治療抑郁癥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取等級(jí)為SPF級(jí)，日齡為2月齡，品種為SD 健康雄性大鼠，共96只（模型組78只，對(duì)照組18只），體質(zhì)量為（200±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)SCXK（湘）2019-0004），本實(shí)驗(yàn)已通過動(dòng)物倫理審查（倫理審核編號(hào) DW20210610-088），實(shí)驗(yàn)在廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心開展。

1.2 抑郁大鼠模型的建立隨機(jī)取78只大鼠構(gòu)建抑郁模型。本研究采用腹腔注射脂多糖建立抑郁大鼠模型［14］，將脂多糖與生理鹽水配制成濃度為0.5 mg/mL的溶液，單次給予大鼠腹腔注射劑量為0.83 mg/mg，采用糖水偏好度測試和曠場實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的抑郁行為。（1）糖水偏好度測試：將大鼠單籠飼養(yǎng)，提前20 h禁食禁水。準(zhǔn)備飲用水和蔗糖水各一瓶，并分別稱重。禁食禁水環(huán)節(jié)結(jié)束后，同時(shí)將兩瓶液體插在鼠籠上給大鼠飲用。1 h后，將兩瓶液體中的剩余部分分別進(jìn)行稱量，并計(jì)算出前后的差值，即為，用飲用的蔗糖水量除以飲用的的總液體量，得到的值就是大鼠的糖水偏好度。（2）曠場實(shí)驗(yàn)（OFT）：將大鼠置于一大小為50 cm× 50 cm × 40 cm、底部黑色、四壁為白色的塑料測試箱內(nèi)，利用ANY-MAZE采集軟件采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，測試前設(shè)定好實(shí)驗(yàn)參數(shù)，設(shè)定采集時(shí)間為5 min，記錄大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)得次數(shù)、中央?yún)^(qū)的逗留時(shí)間和大鼠在箱內(nèi)的總靜止時(shí)間。為排除影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾因素，每只大鼠結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，均需要清除其排泄物，且測試箱的箱底和四壁均要使用75%的酒精進(jìn)行擦拭，待消毒酒精揮發(fā)晾干后再進(jìn)行下一次測試。

1.3 高通量測序隨機(jī)取3只抑郁模型大鼠與3只對(duì)照組大鼠，使用1 %的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，待大鼠完全麻醉后，進(jìn)行開胸，繼而剪開右心耳，左心室灌注生理鹽水，隨后剪開頭骨，取出腦組織，將腦組織置于冰塊上，快速操作分離出海馬組織，研磨成漿液后，使用TRizol（Thermofish-er，China，item number：1218355）進(jìn)行處理，接著使用miR-Neasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）分離RNA。將擴(kuò)增后的miRNA與Illumina表達(dá)譜微陣列進(jìn)行雜交，使用cyanine 3熒光標(biāo)記引物，再次進(jìn)行擴(kuò)增、變性，然后與miRNA微陣列雜交，在45～60 ℃的溫度下孵育，最后用激光激發(fā)成像，使用i Scan系統(tǒng)對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量成像，進(jìn)行表達(dá)分析。測序以P＜0.05，|log2FC| ≥ 1抑郁為篩選條件，以對(duì)照組為參照，篩選到差異表達(dá)的miRNAs［15］。

1.4 干預(yù)和分組將抑郁組剩余的75只大鼠再隨機(jī)分為5組，每組15只。分別是∶模型組（腹腔注射脂多糖0.83 mg/mg）、miR-421過表達(dá)組、miR-421抑制組、Menin過表達(dá)組、Menin抑制組。miR-421抑制組和過表達(dá)組采用目的基因重組腺病毒載體（上海齊源生物科技有限公司，No：GMDV0264532）進(jìn)行干預(yù)，用法為每周進(jìn)行2次干預(yù)，一共進(jìn)行3周，最終使大鼠體內(nèi)的目的基因發(fā)生抑制或者過表達(dá)反應(yīng)。

1.5 各組大鼠體質(zhì)量變化記錄造模前后各組大鼠的體質(zhì)量值，并計(jì)算兩者的差值，以此來反映大鼠的食欲變化。

1.6 目標(biāo)miRNA靶基因預(yù)測運(yùn)用TargetScan數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/）和miRDB數(shù)據(jù)庫（http：//mirdb.org/）進(jìn)行miR-421下游靶基因的預(yù)測，以保證后續(xù)研究分析的順利進(jìn)行。

1.7 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)造模后7 d，處死大鼠，分離出大鼠的海馬組織，部分用4%多聚甲醛保存以進(jìn)行免疫組化染色，部分使用Trizol研磨以檢測miR-421、Menin、Caspase-3mRNA水平。海馬組織經(jīng)研磨后，參照qPCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Mix 10 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，62 ℃45 s，40個(gè)循環(huán)［16］。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-421、Menin、Caspase-3mRNA水平。引物序列如下表所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將PC12細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，PM150210B）加入含10%胎牛血清，置于DMEM培養(yǎng)基中，在條件為5% CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。通過TargetScan數(shù)據(jù)庫分析得到Menin為miR-421的下游靶點(diǎn)基因之一，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒，將Menin過表達(dá)載體或陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染至神經(jīng)元細(xì)胞中。24 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.9 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)通過TargetScan數(shù)據(jù)庫分析得到Menin為miR-421的下游靶點(diǎn)基因之一，構(gòu)建插入熒光素酶的野生型與突變型Menin質(zhì)粒，并將野生型與突變型Menin質(zhì)粒分別與miR-421模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞中，在加入10 ng海腎熒光素酶測定海腎熒光素酶活性。48 h后，收獲細(xì)胞并裂解，最后運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)（Promega）檢測熒光素酶活性。

1.10 免疫印跡法（Western blot）檢測取大鼠海馬組織置于1.5 mL離心管中，電動(dòng)組織研磨棒進(jìn)行組織研磨，進(jìn)入蛋白裂解液，裂解5 min后于4 ℃，1 000 r/min，離心10 min，去沉淀組織，留取上清液。測出各樣本的蛋白質(zhì)濃度。然后電泳，分離膠濃度8%，每泳道加入50 μg白樣品。待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后將PVDF膜后置于含5%脫脂奶封閉液室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜。次日用WB洗滌液洗PVDF膜3次后，加入二抗，室溫孵育1 h。WB洗滌液洗PVDF膜3次后加入3 mL化學(xué)發(fā)光溶液（ECL），隨即進(jìn)行光敏膠片顯像。用Imag J圖像分析系統(tǒng)測定信號(hào)的灰度值［17］。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)分析及數(shù)據(jù)方差齊性檢驗(yàn)，若各組數(shù)據(jù)為正態(tài)分布且各組數(shù)據(jù)方差齊，則可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較。兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組及以上比較采用單因素方差分析；若不符合其中一項(xiàng)，則用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的抑郁行為及體質(zhì)量改變抑郁行為方面，對(duì)照組大鼠自主活動(dòng)正常、精神狀態(tài)正常、飲食正常、自由活動(dòng)正常。造模后，抑郁組大鼠出現(xiàn)表情淡漠、雙眼無神、喜歡獨(dú)處、活動(dòng)減少等抑郁行為。各組大鼠體質(zhì)量方面，造模前，各組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量顯著減輕（P＜0.001）；與模型組相比，miR-421抑制組、Menin過表達(dá)組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.001），miR-421過表達(dá)組、Menin抑制組大鼠體質(zhì)量明顯減輕（P＜0.001）。見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化Tab.2 Changes in body mass of rats in each group ±s，g

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化Tab.2 Changes in body mass of rats in each group ±s，g

注：與對(duì)照組相比，ΔΔΔP＜0.001；與模型組相比，***P＜0.001

組別對(duì)照組模型組miR-421過表達(dá)組miR-421抑制組Menin過表達(dá)組Menin抑制組造模后227.21±5.57 196.23±5.69ΔΔΔ 186.07±3.78***226.87±5.82***226.91±4.89***186.12±4.51***造模前210.40±6.69 209.83±4.21 210.45±4.12 211.23±5.39 211.14±4.93 209.96±4.62

2.2 miR?421在抑郁大鼠的腦組織中表達(dá)上調(diào)測序結(jié)果顯示，在P＜0.05，|log2FC| ≥ 1的篩選條件下，相對(duì)于對(duì)照組，在抑郁模型大鼠共有206個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中上調(diào)的miRNA有47個(gè)，下調(diào)的有159個(gè)（圖1A、圖1B）。PCR結(jié)果表明，miR-421在抑郁大鼠海馬組織中高表達(dá)的（P＜0.001，圖1C）。

圖1 miR-421參與抑郁的發(fā)病過程Fig.1 miR-421 is involved in the pathogenesis of depression

2.3 miR?421靶向結(jié)合Menin使用TargetScan數(shù)據(jù)庫分析得知Menin作為miR-421的靶點(diǎn)之一（兩者的結(jié)構(gòu)結(jié)合見圖2A）。本研究中，miR-421與Menin的結(jié)合關(guān)系在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中得到了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與miR-421-MUT組相比，Menin可明顯下調(diào)miR-421-WT質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性（圖2B），提示Menin可與miR-421特異性結(jié)合；qPCR結(jié)果表明，Menin在抑郁大鼠海馬組織中低表達(dá)的（P＜0.001，圖2C），當(dāng)過表達(dá)miR-421時(shí)，Menin的表達(dá)會(huì)被抑制，當(dāng)抑制miR-421的表達(dá)時(shí)，Menin的表達(dá)會(huì)升高（P＜0.001，圖2D、圖2E）。

圖2 miR-421調(diào)控Menin的表達(dá)Fig.2 miR-421 regulates the expression of Menin

2.4 糖水偏好度測試和曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠的糖水消耗體積和糖水偏好率均顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，miR-421抑制組和Menin過表達(dá)組大鼠的糖水消耗體積、糖水偏好率均顯著升高（P＜0.001），miR-421過表達(dá)組和Menin抑制組大鼠的糖水消耗體積、糖水偏好率均顯著降低（P＜0.001）。見表3。曠場實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，模型組的運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離（%）和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間（%）顯著減少（P＜0.001）；與模型組比較，miR-421抑制組和Menin過表達(dá)組大鼠的運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離（%）和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間（%）均顯著增加（P＜0.001），miR-421過表達(dá)組和Menin抑制組大鼠的運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離（%）均明顯減少（P＜0.01），中央?yún)^(qū)停留時(shí)間（%）減少（P＜0.05）。見表4。

表3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)Tab.3 Sugar water preference experiment ±s

表3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)Tab.3 Sugar water preference experiment ±s

注：與對(duì)照組相比，ΔΔΔP＜0.001；與模型組相比，***P＜0.001

組別對(duì)照組模型組miR-421過表達(dá)組miR-421抑制組Menin過表達(dá)組Menin抑制組糖水偏好率（%）80.16±5.32 36.79±3.94ΔΔΔ 16.53±0.86***70.66±3.72***71.05±3.77***16.65±1.08***糖水消耗體積（mL）14.31±1.12 6.61±0.79ΔΔΔ 3.01±0.50***12.08±0.75***12.24±0.58***3.11±0.37***

表4 曠場實(shí)驗(yàn)Tab.4 Open field test ±s

表4 曠場實(shí)驗(yàn)Tab.4 Open field test ±s

注：與對(duì)照組相比，ΔΔΔP＜0.001，與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別對(duì)照組模型組miR-421過表達(dá)組miR-421抑制組Menin過表達(dá)組Menin抑制組中央?yún)^(qū)停留時(shí)間（%）3.93±1.40 1.63±0.78ΔΔΔ 0.80±0.24*4.13±1.49***4.61±1.25***0.84±0.44*運(yùn)動(dòng)總距離（CM）1 354.80±281.56 678.93±138.28ΔΔΔ 350.42±245.43**1 364.59±428.18***1 477.53±333.41***357.58±240.46**中央?yún)^(qū)停留時(shí)間（%）9.78±2.53 3.63±1.25ΔΔΔ 1.60±0.62**10.19±2.27***10.41±2.59***1.72±0.55**

2.5 Menin是調(diào)控Caspase?3信號(hào)通路的關(guān)鍵因子qPCR檢測提示，Caspase-3、NF-κB在抑郁大鼠模型海馬組織中的表達(dá)顯著提高（P＜0.001），IL-1β在抑郁大鼠模型海馬組織中的表達(dá)明顯提高（P＜0.01），見圖3A。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，當(dāng)過表達(dá)Menin時(shí)，抑郁大鼠的Caspase-3、IL-1β、NF-κB會(huì)被下調(diào)，當(dāng)抑制Menin時(shí)，抑郁大鼠的Caspase-3、IL-1β、NF-κB會(huì)被上調(diào)（P＜0.05，圖3B）。qPCR檢測，也同樣得到上述結(jié)果（P＜0.05，圖3C）。

圖3 Menin對(duì)Caspase-3信號(hào)通路的影響Fig.3 Effect of Menin on Caspase-3 signaling pathway

3 討論

研究證實(shí)腹腔注射LPS可誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)［14］，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)可減輕抑郁樣行為［18-20］。本研究結(jié)果顯示，LPS可致使急性抑郁模型海馬組織中miR-421表達(dá)上調(diào)，降低Menin表達(dá)，提高Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎細(xì)胞因子含量，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，提示抑郁動(dòng)物模型建立完成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Menin與miR-421具有負(fù)相關(guān)的作用，抑制miR-421表達(dá)可上調(diào)Menin表達(dá)，降低LPS誘導(dǎo)的Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎細(xì)胞因子含量，降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而改善急性抑郁動(dòng)物模型的抑郁樣行為。

神經(jīng)炎癥被廣泛認(rèn)為是抑郁癥發(fā)生的病理機(jī)制之一，主要是通過激活炎性因子的活性，活化機(jī)體的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)的發(fā)生，降低海馬突觸的可塑性，影響中樞神經(jīng)元色氨酸的代謝，增強(qiáng)交感神經(jīng)的神經(jīng)活性，由此來參與抑郁癥的發(fā)生與發(fā)展［21-22］。大量研究表明，miRNA在多條與抑郁癥發(fā)病相關(guān)的生物途徑中發(fā)揮作用，可被作為抑郁癥治療的潛在生物靶點(diǎn)［23-26］。為進(jìn)一步探究miRNA對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性抑郁模型的作用機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的急性抑郁模型Menin表達(dá)降低，Caspase-3表達(dá)升高；當(dāng)抑制miR-421表達(dá)后，Menin表達(dá)升高，Caspase-3表達(dá)降低，且抑郁大鼠的食欲、體質(zhì)量及運(yùn)動(dòng)能力得到恢復(fù)，提示抑制miR-421表達(dá)可上調(diào)Menin表達(dá)，降低海馬組織中Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎因子含量，從而發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用，改善抑郁樣行為。所以，miR-421可調(diào)控Menin/Caspase-3通路改善抑郁樣行為，此調(diào)控通路可為抑郁癥的治療提供了新的靶點(diǎn)。

綜上所述，腹腔注射LPS可誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而建立急性抑郁模型。抑制miR-421表達(dá)，可升高M(jìn)enin表達(dá)，降低Caspase-3含量，發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用，恢復(fù)抑郁大鼠體重和運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而改善抑郁癥狀，為臨床治療抑郁癥提供新的方向。但是本研究僅涉及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，且抑郁癥機(jī)制復(fù)雜，神經(jīng)炎癥反應(yīng)只是其中一個(gè)發(fā)生機(jī)制；且在臨床上，抑郁癥多為慢性進(jìn)展，本研究選取急性抑郁動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)具有一定的局限性。但本研究的結(jié)果為將來探究miR-421在抑郁癥靶向治療中的作用提供了理論依據(jù)，為今后挖掘更多的靶向治療信號(hào)通路奠定了基礎(chǔ)。