汪倩，謝超 ，鄭霖波，鄭煒

（1.浙江海洋大學 食品與藥學學院，浙江 舟山 316000；2.舟山市常青海洋食品有限公司，浙江 舟山 316000）

帶魚（Trichiuruslepturus）體帶狀，側扁。舟山帶魚是冷水帶魚，個頭小，肉質細膩嫩滑，營養(yǎng)價值高，含有豐富的鎂元素，對心血管系統(tǒng)有很好的保護作用，有利于預防高血壓、心肌梗塞等心血管疾病。然而，帶魚在捕撈后極易死亡，其屬中脂魚類，不飽和脂肪酸含量高，易受微生物和內源性蛋白酶的影響而產生胺類和醛類物質，發(fā)生腐敗變質[1-2]，因此，探明帶魚貯藏期間的微生物菌群多樣性是控制細菌繁殖、延長帶魚貨架期的基礎。

空間電場技術是新興的食品綠色冷加工技術，研究前景十分廣闊。電場保鮮是一種物理保鮮手段，能夠在很大程度上保留食品的天然感官品質。目前電場保鮮裝置主要分為低壓靜電場、低壓變頻電場等，研究主要集中于果蔬、禽肉、瘦肉等方面。陳文波等[3]的研究表明，低壓靜電場可抑制微生物生長，可通過低壓靜電處理延長白切雞貨架期。岑劍偉等[4]研究空間電場對羅非魚的冷藏保鮮效果，發(fā)現(xiàn)高壓靜電場結合冰溫氣調組合條件可保持新鮮魚片的品質，貨架期也得到有效延長，為冰鮮羅非魚魚片產品在國內超市流通提供可行的技術條件。

高通量測序技術具有通量高、檢測范圍廣、精準等特點，廣泛應用在海捕魚類、土壤、水體、醫(yī)療等領域。已有較多研究使用高通量測序對微生物菌落組成進行分析[5-6]，但空間電場結合低溫對帶魚微生物群落影響鮮見報道。本文基于高通量測序技術，在進行微生物信息分析、菌落總數(shù)等品質指標測定的基礎上，對貯藏至20 d 的帶魚微生物群落堿基信息測序，產生的堿基序列通過操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）群落聚類及相關分析、多樣性分析、相關性分析等手段分析后，旨在獲得影響帶魚保鮮效果的微生物群落組成和發(fā)育信息，探究不同電場強度對帶魚微生物群落組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮舟山帶魚：舟山市普陀海匯水產有限公司。E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑：艾森生物（杭州）有限公司；Qubit3.0 DNA 試劑盒：美國Life Technologies 公司；Hieff NGS?DNA 分選磁株、2×Hieff?Robust PCR Master Mix 試劑：翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

商用型空間電場發(fā)生器（BX-2000）、電場板：浙江馳力科技股份有限公司；INGENIUS 凝膠成像系統(tǒng)：上海復日科技有限公司；臺式離心機（CF - 16RN0）：Thermo Fisher 公司；數(shù)字萬用表（208107）：福祿克測試儀器（上海）有限公司；熒光計（Q32866 Qubit 3.0）：美國Invitrogen 生物技術有限公司；MiSeq 測序平臺：美國Illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

以同一批次新鮮舟山帶魚作為試驗原料，挑選魚體大小均勻、魚肉飽滿有彈性、魚皮顏色鮮亮、魚眼明亮無渾濁、品質完好無破損的個體運送至實驗室后進行清洗、分裝。

對照組（CG）：使用無菌水及無菌紗布進行沖洗以及過濾，將帶魚放入無電場的環(huán)境下，-4 ℃微凍保鮮，樣品標記為Y1。

試驗組（TG）：-4 ℃下將帶魚樣品放入2、3 kV/m的電場強度下進行處理，魚體距離電場板均為15 cm，電場頻率為50 Hz，樣品標記為Y2、Y3。

選擇對照組和試驗組的樣品分別于0~20 d 內定期取菌體沉淀物進行微生物菌群研究，判定其鮮度變化。在貯藏第20 天時取出帶魚樣本，使用高通量測序對帶魚微生物群落進行提取與進一步分析。

1.3.2 菌落總數(shù)的測定

帶魚菌落總數(shù)測定依照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[7]進行。

1.3.3 樣品微生物提取

準確稱取10.0 g 帶魚樣本，加入90 mL 無菌生理鹽水，然后采用無菌紗布過濾并用無菌水淋洗后，于離心機進行離心處理（12 000 r/min、10 min）。取下層沉淀物進行分析，每個樣本做3 次平行試驗[8]。

1.3.4 DNA 抽取

參照基因組DNA 提取試劑盒說明，提取帶魚微生物中總基因組DNA，在瓊脂糖凝膠電泳處理下檢測樣本中的基因組DNA 以及純度，瓊脂糖凝膠電泳的體積分數(shù)為1%[9-10]。之后使用生物信息學分析并進行高通量測序。

1.3.5 微生物群落分析

通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物擴增，對樣本的數(shù)據(jù)進行聚類分析以及拼接劃分，收集各種序列進行進一步分析，對各個級別的菌落結構進行統(tǒng)計，經過處理后，對菌落分布以及變化進行統(tǒng)計分析以及可視化處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3 次。獲得的數(shù)據(jù)采用Excel 2013 與SPSS 18.0 進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 空間電場對菌落總數(shù)的影響

不同處理條件對帶魚菌落總數(shù)的影響見圖1。

圖1 不同處理條件對帶魚菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of different treatment conditions on the total colonies of Trichiurus lepturus

由圖1 可知，隨著貯藏時間的延長，整個貯藏期內帶魚菌落總數(shù)呈明顯增長的趨勢，組內存在顯著差異（P<0.05），電場組與無電場組增長趨勢較為相似。貯藏10~20 d 時，對照組（CG）的菌落總數(shù)一直高于試驗組（TG），貯藏0~5 d 時菌落總數(shù)無顯著差異（P>0.05）。

帶魚在貯藏過程中，魚體中的微生物生長對帶魚魚體產生一定的分解作用并生成各種物質從而影響帶魚的鮮度，所以菌落總數(shù)是判斷魚鮮度的重要指標之一。帶魚樣本的最初菌落總數(shù)值為3.99 lg（CFU/g），這主要是由魚體中自身攜帶的內源性微生物與船舶捕撈以及車輛運輸過程中從外界環(huán)境中接觸的外源性微生物作用導致。在貯藏期間電場組的菌落總數(shù)始終低于無電場組，說明空間電場作用能夠對帶魚中部分微生物的生長繁殖起到抑制作用。根據(jù)GB 4789.2—2016的規(guī)定，當菌落總數(shù)數(shù)值大于6.00 lg（CFU/g）時帶魚已經變質不可食用。3 組帶魚菌落總數(shù)均隨著時間延長而增長，貯藏第5 天到第20 天時，3 kV/m 的菌落總數(shù)始終高于2 kV/m 組的菌落總數(shù)。在貯藏至第20 天時，2 kV/m 組菌落總數(shù)最低，為5.27 lg（CFU/g），說明在貯藏期間2 kV/m 電場較3 kV/m 電場更能抑制微生物的生長繁殖，應進一步對電場參數(shù)進行優(yōu)化，研究不同電場強度對帶魚保鮮過程中不同貯藏時間微生物菌落總數(shù)的抑制效果。

2.2 樣品測序數(shù)據(jù)分析

樣品測序數(shù)據(jù)分析結果見表1~表3。

表1 不同電場強度處理下帶魚序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Sequencing data of Trichiurus lepturus treated under electric fields at different intensities

表2 OTU 序列數(shù)統(tǒng)計Table 2 Number of OTU sequences of Trichiurus lepturus

表3 OTU 分類學信息Table 3 OTU taxonomy information

MiSeq 測序會產生大量的16S 序列，OTU 是在遺傳生物學和統(tǒng)計系統(tǒng)學研究中，為方便分析而人為對微生物菌群分類添加的標志。由表1 中數(shù)據(jù)可以得出，帶魚樣本的有效序列、堿基數(shù)目和平均序列長度大致相同，表明電場強度越大，檢測出的有效序列與堿基數(shù)目越少。

表2 中為所有優(yōu)化序列與OTU 代表序列對比，選取與代表性序列相似性大于97% 的序列及其輸出名，可得到不同樣品間的OTU 和序列數(shù)目的差異，需結合物種注釋加以分析。OTU 物種的注釋表明，帶魚在空間電場與-4 ℃結合處理貯藏條件下帶魚微生物群落均為細菌，并未發(fā)現(xiàn)真菌群落。門水平上，舟山新鮮帶魚樣品總細菌組成主要以變形菌門與厚壁菌門為主。綱水平上，丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）為優(yōu)勢菌綱，丙型變形菌綱分布廣泛，各組樣品均有OTU聚類[11-13]?？扑奖憩F(xiàn)出了較高的豐度，聚類結果為希瓦氏菌科（Shewanellaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae）、微球菌科（Micrococcaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）、李斯特菌科（Listeriaceae）、柄桿菌科（Caulobacteraceae）。在屬水平上，擬桿菌屬（Bacteria）、嗜冷菌屬（Psychrobacter）一直占據(jù)優(yōu)勢，在舟山帶魚冷藏期間豐度呈上升趨勢，在帶魚腐敗變質中起重要作用。此次OTU 分析中屬類有嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、肉桿菌屬（Carnobacterium）。

2.3 多樣性指數(shù)分析

Alpha 指數(shù)稀釋性曲線見圖2。

圖2 Alpha 指數(shù)稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curve of alpha index

Miseq 測序后的OTU 聚類能夠表征微生物群落的具體信息，從圖2 中可以看出，當樣本讀取次數(shù)超過30 000 時各組樣本曲線接近平緩，說明測序合理，進一步增加測序數(shù)量不會帶來更多的OTU 聚類，進而影響試驗結果與分析[14]。當讀取次數(shù)小于10 000 時，隨著抽樣數(shù)量的增加，樣本中檢測出的OTU 數(shù)量快速上升，當讀取次數(shù)大于10 000 之后，隨著讀取次數(shù)的增加，樣本中所檢測出的OTU 數(shù)量緩慢上升并且逐漸趨于穩(wěn)定，但從整體來看Y2 所檢測出的樣本中OTU 數(shù)量要高于Y1 與Y3，并且Y1 中隨著讀取次數(shù)上升所檢測出的樣本OTU 數(shù)量要大于Y3，當讀取次數(shù)大于20 000 后樣本中所檢測出OTU 數(shù)量在2 kV/m 電場組中最高而3 kV/m 電場組中最低，說明電場強度的大小對從樣本中檢測OTU 有較大的影響。

2.4 菌群組成分析

不同電場強度下屬水平上群落豐度表現(xiàn)熱圖見圖3。

圖3 不同電場強度下屬水平上群落豐度表現(xiàn)熱圖Fig.3 Heat map of abundance of microbial genera under different electric field intensities

群落豐度表現(xiàn)熱圖用顏色對比來反映數(shù)據(jù)的信息情況，可以直觀顯示樣本中菌落含量的變化。由圖3可以看出，在施加外部空間電場的處理下，帶魚中菌落組成發(fā)生了明顯的改變。施加空間電場后帶魚中變形桿菌（Proteobacteria）的群落豐度減少，說明在一定程度上施加外部空間電場能夠抑制變形桿菌的生長繁殖，但Y2 和Y3 之間差異不明顯，說明電場強度的大小對抑制變形桿菌生長繁殖影響不明顯，需要進一步進行研究。厚壁菌（Firmicutes）的群落豐度在施加空間電場之后變大，說明空間電場對厚壁菌的影響不明顯?？赡苁怯捎诳臻g電場抑制了其他菌種的生長繁殖，導致對電場不敏感的厚壁菌生長繁殖速度加快。放線菌（Actinobacteria）在施加電壓變頻電場之后菌落豐度降低，并且Y3 的降低幅度大于Y2，說明空間電場對放線菌的生長繁殖具有一定的抑制作用并且隨著電場強度的增大抑制的作用愈發(fā)明顯。除以上3 種主要菌群外，空間電場對其他菌群也有一定的抑制效果，并且隨著電場強度的增大抑制效果明顯[15-19]。說明空間電場能夠抑制變形桿菌以及放線菌的生長繁殖，但厚壁菌對空間電場可能不敏感。

2.5 樣本群落結構

不同電場強度下微生物群落結構見圖4，共線性關系見圖5。

圖4 不同電場強度下微生物群落結構Fig.4 Microbial community structures under different electric field intensities

圖5 共線性關系Fig.5 Collinearity diagram

由圖4 可知，在施加空間電場并在-4 ℃環(huán)境中貯藏，帶魚樣本中的優(yōu)勢微生物為嗜冷菌（Psychrobacter），Y1、Y2、Y3 組中嗜冷菌占比微生物群落結構均達到了80% 以上，說明嗜冷菌比較適應-4 ℃貯藏環(huán)境。在施加空間電場之后嗜冷菌的含量均發(fā)生了下降，2 kV/m 組下降的幅度要略大于3 kV/m 組，說明空間電場在一定程度上能夠抑制嗜冷菌的生長繁殖，而且2 kV/m 的電場參數(shù)對嗜冷菌的抑制效果要優(yōu)于3 kV/m。從圖5 可以看出，在施加空間電場之后厚壁菌（Firmicutes）的相對豐度升高，說明空間電場對厚壁菌生長繁殖影響不明顯，可能是由于空間電場抑制了嗜冷菌的生長繁殖導致厚壁菌有更多的空間進行繁衍，從而使厚壁菌的相對豐度上升[20-23]。放線菌（Actinobacteria）對空間電場比較敏感，隨著電場強度的增加，放線菌的相對豐度逐漸降低，說明空間電場對放線菌的生長繁殖具有一定的抑制效果。

2.6 相關性分析

樣本距離熱圖見圖6，主成分分析見圖7。

圖6 樣本距離熱圖Fig.6 Heat map of sample distance

圖7 主成分分析Fig.7 Principal component analysis

樣本組之間的相關性檢驗是驗證試驗可靠以及樣本合理的重要標準之一，越接近0，分離度越小，相關性越好[24]。從圖6 可以看出，Y1 與Y2、Y3 之間的分離度分別為0.10 與0.11，Y2 與Y3 的分離度為0.06，說明電場組（Y2、Y3）與Y1 相比分離度較小，相關性較大。

成分分析是通過分析數(shù)據(jù)，使用方差分析分析不同樣本之間的距離及差異。使用百分比判斷差異度，兩點之間越近，說明具有相似的菌群組成[25]。由圖7可知，電場組Y2 與Y3 樣本具有較大差異，而無電場組Y1 與兩組電場組距離較遠差異明顯，說明施加空間電場，對微生物菌群具有一定影響，并且電場強度的大小對微生物菌群也有部分影響。

3 結論

以舟山帶魚為研究對象，采用Illumina Miseq 高通量測序技術，對不同電場強度下貯藏至20 d 的帶魚微生物群落堿基信息測序，研究不同電場強度下帶魚樣品中菌群組成及微生物變化情況。通過OTU 聚類、多樣性指數(shù)分析、菌群組成分析、樣本菌落結構分析、相關性分析手段，探究空間電場對帶魚微生物組成的變化。OTU 聚類屬主要有希瓦氏菌屬（Shewanella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、工地桿菌屬（Pedobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、索絲菌屬（Brochothrix）、嗜冷菌屬（Psychrobacter）、柄桿菌屬（Caulobacter），根據(jù)菌屬相對豐度結果和經驗，推測嗜冷菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）是帶魚微生物腐敗主要致腐菌。結果表明，新鮮舟山帶魚樣品以嗜冷菌屬、棲熱菌屬與假交替單胞菌為主，相對豐度分別為23.24%、24.27% 和17.98%；其中嗜冷菌屬作為主要優(yōu)勢腐敗菌在帶魚腐敗過程中起重要作用。對照組Y1 的OTU 多樣性高，有多個獨有OTU 聚類菌屬，電場處理組Y2、Y3 也有多個獨有菌屬，但均無致腐性和致病性。綜上所述，空間電場保鮮技術在帶魚低溫貯藏過程中能夠有效抑制腐敗菌的滋生，延緩帶魚的腐敗變質，有利于帶魚品質控制；同時，Miseq 基因組測序技術能夠實現(xiàn)產品貯藏期間腐敗菌的快速檢測。上述相關技術能夠為水產品貯藏保鮮和質量安全監(jiān)測領域提供理論依據(jù)，具有較好的產業(yè)化應用前景。