張闖，趙孔祥，潘紅蕊，于艷軍，宓捷波，蘇明躍，楊永超

（1.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津 300457；2.天津海關(guān)動植物食品檢測中心，天津 300457）

苦參堿農(nóng)藥是從苦參屬植物中分離出來的全部物質(zhì)，其主要成分為苦參堿和氧化苦參堿[1]。苦參堿與氧化苦參堿作為殺蟲劑被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2]。目前苦參堿農(nóng)藥是我國植物源農(nóng)藥中登記企業(yè)最多的品種，目標(biāo)害蟲有蚜蟲[3]，紅火蟻[4-5]、金龜子甲蟲[6]、田間幼蟲[7]、黑腹果蠅、美洲大蠊[8]等，應(yīng)用于豇豆生產(chǎn)種植[9]、結(jié)球甘藍(lán)防控[10]、茶葉種植防治[11]等領(lǐng)域。其作用機(jī)理是害蟲觸及苦參堿農(nóng)藥后被麻痹神經(jīng)中樞，苦參堿農(nóng)藥作為殺蟲劑可凝固蟲體蛋白質(zhì)，阻塞氣孔，使害蟲窒息而死，起到觸殺和胃毒的雙重作用[12-13]。由于其殺蟲活性相對較低，多與其他殺蟲劑配伍使用[14]。相關(guān)研究表明，苦參堿農(nóng)藥對人體有較為明顯的副作用。例如氧化苦參堿的毒性能降低人體正常肝細(xì)胞活性，大幅提高乳酸脫氫酶水平，通過光鏡觀察，人體肝細(xì)胞縮小、變得褶皺，顯示出肝毒作用[15]。

枸杞是我國藥食同源的中藥材重要品種，因其莖葉繁茂、果汁甘甜、營養(yǎng)豐富，易遭受病蟲的危害[16]?？鄥A、氧化苦參堿作為枸杞主要?dú)⑾x劑，可防治枸杞蚜蟲、枸杞木虱[17]、梨黑星病、菜青蟲、菜蚜等[18]。

目前文獻(xiàn)報道的關(guān)于苦參堿和氧化苦參堿的痕量檢測，主要有液相色譜法[19-20]、電化學(xué)法[21]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[22-24]、氣相色譜-質(zhì)譜法[25]，其中以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測靈敏度高、操作簡便，應(yīng)用最多?；|(zhì)主要有苦參、蜂蜜、柞蠶等，但鮮有對枸杞基質(zhì)的考察。同時目前關(guān)于苦參堿和氧化苦參堿也基本采用外標(biāo)法定量，結(jié)果準(zhǔn)確性受基質(zhì)效應(yīng)以及前處理過程中人工操作的影響，定量需要基質(zhì)曲線校準(zhǔn)，方法復(fù)雜，準(zhǔn)確性較差。本文建立枸杞中苦參堿和氧化苦參堿殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，簡化操作方法，提高結(jié)果準(zhǔn)確性，以期為開展枸杞中苦參堿和氧化苦參堿檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：市售；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；磷酸（優(yōu)級純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苦參堿、氧化苦參堿：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；同位素內(nèi)標(biāo)D3-苦參堿、D3-氧化苦參堿：天津阿爾塔科技有限公司。水系微孔濾膜（0.22 μm）：海寧市中力過濾設(shè)備廠；強(qiáng)陽離子固相萃取柱（SCX，150 mg，6 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（ultra）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高速分散機(jī)（T25）：德國艾卡公司；渦旋振蕩器（MIX-Multi）：拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司；超聲清洗器（SB-5200DTD）：寧波新芝生物科技股份有限公司；離心機(jī)（KL05RF）：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；純水機(jī)（Milli-Q）：美國密理博公司；電子天平（AL204）：梅特勒托利多科技（中國）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

以甲醇配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的苦參堿、氧化苦參堿混標(biāo)溶液，10 μg/mL 的D3-苦參堿、D3-氧化苦參堿混和內(nèi)標(biāo)溶液，于-18 ℃下儲存。以20% 甲醇水溶液配制1 μg/mL 的混標(biāo)工作液及混合內(nèi)標(biāo)工作液，配制混標(biāo)溶液1、2、5、10、20 ng/mL 和50 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)濃度為25 ng/mL），現(xiàn)配現(xiàn)用。

0.1% 甲酸水溶液：取適量超純水，加入1.0 mL 甲酸，用水定容至1 L，超聲脫氣，待用。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

采用高速分散機(jī)將枸杞打碎，稱取2 g 粉碎試樣（精確至0.001 g）于50 mL 塑料離心管中，加入1 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，加20 mL 1.0% 的磷酸水溶液，渦旋1 min，超聲提取30 min，5 000 r/min 離心5 min，收集上清液。

1.3.2.2 凈化

強(qiáng)陽離子固相萃取柱依次用6 mL 甲醇和6 mL 水活化，提取液經(jīng)漏斗過濾后固相萃取柱凈化，依次用6 mL 水和6 mL 甲醇淋洗，用10 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，45 ℃氮?dú)獯抵两?。加?0% 甲醇水溶液2 mL，渦旋1 min 溶解殘余物，水系微孔濾膜過濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱：T3（柱長100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.7 μm）；流動相A：0.1% 甲酸水溶液，流動相B：甲醇；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL/min。流動相洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase and gradient elution conditions

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；正離子掃描模式；噴霧電壓為3 500 V；離子源溫度為350 °C。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）按以下公式計算。

式中：M為基質(zhì)效應(yīng)；A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME>0，表明基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)；ME<0，表明基質(zhì)效應(yīng)抑制；ME=0 表示不存在基質(zhì)效應(yīng)；|ME|<0.2 為弱基質(zhì)效應(yīng)；0.2 ≤|ME| ≤0.5 為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME|>0.5 為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

色譜數(shù)據(jù)分析采用Xcalibur 軟件進(jìn)行處理，回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Office Excel 軟件處理，統(tǒng)計圖采用Origin Pro 8.5 制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑選擇

苦參堿、氧化苦參堿結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 苦參堿和氧化苦參堿結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of matrine and oxymatrine

由圖1 可知，苦參堿由兩個哌啶環(huán)駢合而成，呈叔胺狀態(tài)的氮原子處于駢合環(huán)之間，立體效應(yīng)影響較小，氧化苦參堿結(jié)構(gòu)式中含有氮氧化物基團(tuán)，具有半極性配位鍵，氧化苦參堿極性大于苦參堿。根據(jù)相似相溶原理，應(yīng)在較大極性的溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行提取。不同提取溶劑對苦參堿與氧化苦參堿峰面積的影響見圖2。

圖2 不同提取溶劑下苦參堿與氧化苦參堿峰面積比較Fig.2 Comparison of peak areas of matrine and oxymatrine under different extraction solvents

由圖2 可知，使用磷酸水溶液作為提取溶液效率較高，這與苦參堿和氧化苦參堿屬于強(qiáng)極性物質(zhì)，應(yīng)使用極性溶劑提取的結(jié)論一致。苦參堿、氧化苦參堿在酸性條件下比較穩(wěn)定，所以選擇磷酸水溶液作為提取溶劑。在不同濃度磷酸水溶液作為提取溶劑時，0.2%、0.5%、1.0% 磷酸水溶液提取后的目標(biāo)化合物的峰面積隨提取溶劑濃度的增加不斷增大，1.0% 與2.0% 差別不大。所以選擇1.0% 磷酸水溶液作為提取溶劑。

2.1.2 超聲時間的選擇

不同超聲時間，苦參堿與氧化苦參堿峰面積變化見圖3。

圖3 不同超聲時間下苦參堿與氧化苦參堿峰面積比較Fig.3 Comparison of peak areas of matrine and oxymatrine under different ultrasound time

由圖3 可知，隨著超聲時間（10~30 min）的延長，目標(biāo)化合物的峰面積逐漸增大，而在30 min 和40 min 下，目標(biāo)化合物的峰面積基本沒有變化，故選擇30 min 作為最終超聲時間。超聲波可以加速枸杞在溶液中的溶解，提高反應(yīng)速率和溶解度。但在30 min時，枸杞中的目標(biāo)化合物已被完全溶解于1.0% 磷酸水溶液中。

2.1.3 固相萃取凈化條件選擇

試驗(yàn)選擇強(qiáng)陽離子固相萃取柱作為凈化柱，這是由于苦參堿、氧化苦參堿屬于堿性農(nóng)藥，在溶液中帶正電荷，強(qiáng)陽離子類的固相萃取柱里有磺酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，二者形成相互作用力，可以吸附苦參堿和氧化苦參堿。

選擇氨水甲醇溶液作為洗脫溶液，是因?yàn)槎呖商峁A性環(huán)境，銨根離子自帶正電荷，可與強(qiáng)陽離子萃取柱的負(fù)電荷相結(jié)合，減弱目標(biāo)化合物苦參堿、氧化苦參堿與強(qiáng)陽離子萃取柱之間的作用力，使得固相萃取柱吸附的苦參堿和氧化苦參堿解離下來。

試驗(yàn)以目標(biāo)化合物峰面積為參考，對比不同比例洗脫溶液（甲醇溶液、2% 氨水甲醇溶液、5% 氨水甲醇溶液、10% 氨水甲醇溶液）下對苦參堿、氧化苦參堿的洗脫效果，結(jié)果見圖4。

圖4 不同洗脫溶劑下苦參堿與氧化苦參堿峰面積比較Fig.4 Comparison of peak areas of matrine and oxymatrine under different elution solvents

由圖4 可知，氨水濃度達(dá)到5% 以后目標(biāo)化合物峰面積增加不明顯，因此使用5% 氨水甲醇溶液作為洗脫溶劑。繼續(xù)考察固相萃取柱洗脫曲線，分段收集20 mL 5% 氨水甲醇洗脫液（每2 mL 一段），將洗脫液用氮?dú)獯抵两桑? mL 20% 甲醇溶液復(fù)溶，測定每部分苦參堿、氧化苦參堿峰面積，結(jié)果見圖5。

圖5 不同階段洗脫液下苦參堿與氧化苦參堿峰面積比較Fig.5 Comparison of peak areas of matrine and oxymatrine under different stages of eluent

由圖5 可知，10 mL 洗脫液可將目標(biāo)化合物洗脫完全。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

試驗(yàn)通過對兩種水相溶劑（0.1% 甲酸水溶液、5 mmol 乙酸銨+0.1% 甲酸水溶液）與兩種有機(jī)相溶劑（乙腈、甲醇）進(jìn)行交叉比對，分別為0.1% 甲酸水溶液+乙腈、0.1% 甲酸水溶液+甲醇、（5 mmol 乙酸銨+0.1% 甲酸水溶液）+乙腈、（5 mmol 乙酸銨+0.1% 甲酸水溶液）+甲醇。

從響應(yīng)強(qiáng)度、峰形以及出峰時間3 方面考察，發(fā)現(xiàn)0.1% 的甲酸水溶液與甲醇作為流動相效果最明顯，離子化效率更高，響應(yīng)更強(qiáng)，峰形窄而尖銳，保留時間合適。

在等度洗脫模式下，苦參堿、氧化苦參堿和基質(zhì)、溶劑、雜質(zhì)總是一同流出，在質(zhì)譜圖上無法區(qū)分，同時考慮枸杞樣品復(fù)雜、對離子源損害較大，決定采用梯度洗脫法將目標(biāo)物與基質(zhì)、溶劑、雜質(zhì)分離。梯度洗脫初始流動相設(shè)置水相多而有機(jī)相少能將親水性雜質(zhì)分離，后逐漸加大有機(jī)相比例達(dá)到親水雜質(zhì)與目標(biāo)物分離的效果，保留性強(qiáng)的雜質(zhì)則通過延長洗脫時間去除，最后恢復(fù)初始流動相平衡。

2.2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)對比了C18、T3 兩種型號色譜柱。目標(biāo)物在C18 柱下，目標(biāo)物保留較弱，出峰快，樣品中共流出物容易干擾其測定。而在T3 柱下，目標(biāo)物的峰形及質(zhì)譜相應(yīng)強(qiáng)度更好，同時保留時間合適。這是由于目標(biāo)物屬強(qiáng)極性物質(zhì)，T3 柱是在C18 鍵合相基礎(chǔ)上又加上極性基團(tuán)修飾，比單獨(dú)C18 柱對極性分子的保留能力更強(qiáng)，更適合極性較強(qiáng)的目標(biāo)化合物分析，因此選擇T3柱作為苦參堿分析用色譜柱。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)比較了ESI 負(fù)離子和ESI 正離子兩種掃描模式下目標(biāo)化合物的信號強(qiáng)度。配制100 ng/mL 濃度下的4 種混標(biāo)溶液，并以10 μL/min 的流速直接注入質(zhì)譜。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在正離子掃描模式下的信號強(qiáng)度明顯高于負(fù)離子掃描模式下，這是由于苦參堿、氧化苦參堿含有氮元素，容易結(jié)合得到一個質(zhì)子形成正離子，因此采用ESI 正離子掃描模式。進(jìn)一步優(yōu)化ESI 正離子掃描模式下MRM 的母離子、子離子、碰撞能量和去簇電壓，每個目標(biāo)物選擇豐度較高、干擾最少的2 組離子對用于MRM 監(jiān)測。最終優(yōu)化的質(zhì)譜條件如表2 所示。優(yōu)化后苦參堿、氧化苦參堿及各自同位素內(nèi)標(biāo)MRM 檢測見圖6。

圖6 4 種化合物多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜Fig.6 Chromatograms of four compounds in MRM mode

表2 MRM 模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters in MRM mode

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

在液質(zhì)檢測中，基質(zhì)效應(yīng)普遍存在，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，而同位素內(nèi)標(biāo)的引進(jìn)在一定程度上可以消除基質(zhì)效應(yīng)，提高定量準(zhǔn)確度。在使用外標(biāo)法時結(jié)果顯示|ME|苦參堿=0.17，|ME|氧化苦參堿=0.18，苦參堿與氧化苦參堿呈現(xiàn)弱基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標(biāo)法引入后|ME|苦參堿=0.04，|ME|氧化苦參堿=0.03，內(nèi)標(biāo)的引入很大程度減小了基質(zhì)效應(yīng)，可以采用溶劑配制工作曲線，簡化了定量操作過程。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性方程與檢出限、定量限

以3 倍信噪比確定方法檢出限，以10 倍信噪比確定定量限，結(jié)果如表3 所示。

表3 苦參堿和氧化苦參堿的線性關(guān)系及檢測靈敏度Table 3 Linear relationship and detection sensitivity of matrine and oxymatrine

2.5.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取空白樣品，選擇低、中、高3 個濃度進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)6 次，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表4所示。

表4 方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Method recovery rate and RSD

2.6 實(shí)際樣品測試

市場上采集15 份枸杞樣品，經(jīng)測定，有2 份樣品檢出氧化苦參堿成分，分別為0.76、0.83 μg/kg，其余均為未檢出。GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》僅制定了部分蔬菜水果的苦參堿限量標(biāo)準(zhǔn)（1~5 mg/kg），檢出苦參堿成分的枸杞樣品遠(yuǎn)未達(dá)到此限量，枸杞中苦參堿對人可能產(chǎn)生的風(fēng)險較小。同時由于樣品量較小，可能代表性不夠，下一步計劃擴(kuò)大樣品采樣繼續(xù)檢測。

3 結(jié)論

本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測枸杞中苦參堿和氧化苦參堿，通過優(yōu)化提取溶液、超聲時間、洗脫溶液、洗脫溶液體積等前處理?xiàng)l件達(dá)到痕量檢測的目的，同時通過查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)，首次采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，該方法簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確性高，大大降低了基質(zhì)效應(yīng)以及人工操作誤差，適合于枸杞中苦參堿和氧化苦參堿的測定。