孫衛(wèi)華,陳馳昊,李 喆,呂向國(guó),王秀華

(1.浙江理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,杭州 310018;2.嘉興學(xué)院材料與紡織工程學(xué)院,浙江嘉興 314001;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿科,上海 200127)

0 引 言

長(zhǎng)段尿道狹窄是泌尿外科一種常見(jiàn)的疾病,組織工程技術(shù)有望成為治愈該疾病的有效方法。支架材料可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供空間結(jié)構(gòu)與力學(xué)支撐,并通過(guò)模擬體內(nèi)微環(huán)境促進(jìn)組織重建與再生,因此在組織工程研究中具有重要作用[1-3]。研究表明,高度模擬細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)的納米三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)影響細(xì)胞行為,進(jìn)而提高細(xì)胞黏附、增殖及蛋白表達(dá),促進(jìn)組織重建[4-7]。

天然可降解的生物材料已廣泛用于制備尿道組織工程支架。明膠(Gelatin, Gel)和絲素蛋白(Silk fibroin, SF)是尿道組織工程中常用的兩種天然生物材料。Gel具有良好的生物相容性及可降解性,且降解產(chǎn)物毒性較低;SF具有良好的力學(xué)強(qiáng)度及可塑性。以明膠和絲素蛋白為原料制備的疏松多孔支架,兼具兩者的優(yōu)良性能。BC具有良好的持水性能、機(jī)械性能及生物相容性,且其三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠完美模擬天然ECM[8-10]。因此,BC三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與Gel/SF多孔支架進(jìn)行結(jié)合,有望應(yīng)用于尿道組織修復(fù)。

本文將Gel與SF水溶液進(jìn)行混合,通過(guò)冷凍干燥法制備Gel/SF管狀多孔支架,探究了不同預(yù)凍溫度對(duì)支架多孔結(jié)構(gòu)的影響,選擇與尿道組織多孔結(jié)構(gòu)相近的Gel/SF支架,并以其為模板,采用原位發(fā)酵法使BC與Gel/SF支架復(fù)合,最終得到具有多尺度結(jié)構(gòu)的雙層支架Gel/SF/BC。對(duì)Gel/SF/BC雙層支架的結(jié)構(gòu)及性能進(jìn)行測(cè)試表征,分析其微觀形貌、化學(xué)結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能及生物相容性。本文的研究結(jié)果可為尿道、血管、皮膚等組織工程支架的設(shè)計(jì)與構(gòu)筑提供新的思路與方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

主要材料:木葡糖酸醋桿菌1.1812,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;酵母膏、魚粉蛋白胨和戊二醛(生物試劑),購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇和明膠(分析純),購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;曲拉通 X-100(化學(xué)純),購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;最低限量基本培養(yǎng)基(MEM,AH29917357),購(gòu)自上海橋星貿(mào)易有限公司;L-929細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù));胎牛血清(FBS,NYN0769),購(gòu)自上海橋星貿(mào)易有限公司;二苯基四氮唑溴鹽(MTT,J17GS15117),購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;青霉素鏈霉素(J210042),購(gòu)自上海橋星貿(mào)易有限公司;高糖液體培養(yǎng)基(DMEM,PM150210),購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;苯酚和溴化鋰(分析純),購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;2,4-二硝基氯苯(分析純),購(gòu)自上海博飛美科化學(xué)科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(色譜純),購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;高密度聚乙烯薄膜(海門市揚(yáng)子醫(yī)療器械有限公司);雄性豚鼠(普通級(jí)),購(gòu)自邳州市東方養(yǎng)殖有限公司;道康寧硅膠及其固化劑(DC184),購(gòu)自北京瑞德佑業(yè)科技有限公司;蠶繭(浙江嘉欣絲綢股份有限公司)。

主要儀器:超聲診斷儀(東芝Aplio 500),購(gòu)自日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社;冷凍干燥機(jī)(SCIENTZ-18 N),購(gòu)自上海雙旭電子有限公司;3D打印機(jī)(Creater Pro),購(gòu)自浙江閃鑄三維科技有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082),購(gòu)自濟(jì)源千司生物技術(shù)有限公司;立式高壓蒸汽滅菌鍋(申安LDZX-50KBS),購(gòu)自上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司;掃描電鏡(Apreo S),購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司;傅里葉變換紅外光譜儀(VERTEX 70),購(gòu)自德國(guó)布魯克公司;X射線薄膜衍射儀(D8 ADVANCE型),購(gòu)自德國(guó)布魯克公司;萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(Instron 5982),購(gòu)自美國(guó)英斯特朗公司。

1.2 Gel/SF管狀多孔支架的制備

圖1為Gel/SF管狀多孔支架的制備流程圖。通過(guò)超聲掃描獲取尿道組織二維斷層圖片(圖1(a)),對(duì)二維斷層圖片做數(shù)據(jù)識(shí)別處理,利用imaris軟件對(duì)處理后的系列二維斷層圖片進(jìn)行三維重建及擬合(圖1(b)),再經(jīng)3DMax軟件平滑處理后得到尿道三維數(shù)字模型(圖1(c)),3D打印得到ABS材質(zhì)的尿道節(jié)段性三維實(shí)體模型(圖1(d))。硅膠和固化劑按照質(zhì)量比100∶5進(jìn)行混合,將3D打印模型放入方形透明塑料器皿中并注入上述混合試劑,固化后的硅膠進(jìn)行倒模處理,得到具有尿道組織宏觀形貌的硅膠模具(圖1(e))。將Gel/SF混合倒入硅膠模具,冷凍干燥后得到Gel/SF管狀多孔支架(圖1(f))。

圖1 Gel/SF管狀多孔支架的制備流程圖

將10 g脫膠處理后的蠶繭在質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的溴化鋰溶液中60 ℃條件下溶解5 h,多層紗布過(guò)濾,然后用去離子水透析3 d,每隔12 h換水;透析完成后的SF溶液冷凍干燥,制得純SF。取純SF溶于去離子水中,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的SF水溶液,將Gel溶于45 ℃去離子水中,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的明膠溶液,將兩種溶液等體積混合后注入硅膠模具中,分別在-20、-80 ℃以及液氮(-196 ℃)中冷凍12 h,然后進(jìn)行冷凍干燥,得到Gel/SF管狀多孔支架。

1.3 Gel/SF/BC雙層支架的制備

配制發(fā)酵培養(yǎng)液(5 g/L酵母膏、5 g/L魚粉蛋白胨、50 g/L葡萄糖、2 g/L磷酸氫二鈉、1 g/L檸檬酸、1 g/L磷酸二氫鉀),待上述物質(zhì)充分溶解后,放入立式高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌,并在121 ℃、0.1 MPa下滅菌30 min。

采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的戊二醛無(wú)水乙醇溶液交聯(lián)Gel/SF管狀多孔支架10 min,用發(fā)酵培養(yǎng)液清洗3次,置換出多余的戊二醛溶液。將處理后的Gel/SF管狀多孔支架重新放置于硅膠模具中,配制菌種密度為107個(gè)/mL的木葡糖酸醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液,并將其注入模具內(nèi)。待發(fā)酵培養(yǎng)液充分浸潤(rùn)Gel/SF管狀多孔支架后,放入恒溫培養(yǎng)箱中,35 ℃發(fā)酵培養(yǎng)7 d,獲得Gel/SF/BC雙層支架。將雙層支架浸入醫(yī)用酒精消毒處理24 h,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的曲拉通 X-100浸泡處理24 h,并用超純水清洗3次,除去多余的試劑。

1.4 樣品表征

1.4.1 形貌及結(jié)構(gòu)分析

采用掃描電鏡對(duì)管狀樣品內(nèi)表面及橫截面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,采用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量,并用Origin軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析(n=200,n為統(tǒng)計(jì)數(shù)量),利用傅里葉變換紅外光譜儀及X射線薄膜衍射儀對(duì)雙層支架進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)試。

1.4.2 孔隙率測(cè)試

采用乙醇置換法測(cè)量支架孔隙率。取凍干后的支架稱重為m1,將其完全浸沒(méi)在無(wú)水乙醇中,用濾紙輕蘸去表面多余液體后稱重為m2;將多孔支架放入20 mL量筒中,緩慢倒入乙醇至10 mL,添加乙醇的體積為V;計(jì)算樣品的孔隙率,每組支架測(cè)試3個(gè)樣品?？紫堵蔖用式(1)計(jì)算:

(1)

其中:m1為支架凍干后的質(zhì)量,g;m2為浸泡無(wú)水乙醇2 h后的質(zhì)量,g;V為添加的乙醇的體積,mL;ρc為無(wú)水乙醇密度,g/mL。

1.4.3 吸水量測(cè)試

將支架置于去離子水中浸泡24 h,支架取出后用濾紙將支架表面多余的水分擦拭干凈,用電子天平稱重得到濕態(tài)質(zhì)量Ws,然后將支架進(jìn)行冷凍干燥,稱重得到干態(tài)質(zhì)量Wd。計(jì)算出支架的吸水量,每組支架測(cè)試3個(gè)樣品。吸水量通過(guò)式(2)計(jì)算:

(2)

其中:Sr為吸水量;Ws為支架在去離子水中浸泡24 h后的質(zhì)量,g;Wd為冷凍干燥后干態(tài)質(zhì)量,g。

1.4.4 力學(xué)性能測(cè)試

采用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)對(duì)材料進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試。將樣品統(tǒng)一裁剪為25×4×2 mm3的樣條進(jìn)行拉伸力學(xué)性能的測(cè)試,拉伸速率為5 mm/min。

循環(huán)壓縮力學(xué)性能測(cè)試:濕態(tài)下的Gel/SF多孔支架以及Gel/SF/BC雙層支架進(jìn)行壓縮循環(huán)測(cè)試。將樣品采用相同的工藝條件,統(tǒng)一制備為直徑15 mm,高16 mm的圓柱狀樣品,壓縮至樣品發(fā)生60%形變,然后恢復(fù)至0%,壓縮速率為10 mm/min,重復(fù)10次循環(huán)。

1.4.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)按照《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分:體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》(GB/T 16886.5—2017)進(jìn)行測(cè)試。將L-929細(xì)胞在含10%胎牛血清和抗生素(青霉素100 μg/mL,鏈霉素100 μg/mL)的MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)后,分別加入100 μL Gel/SF/BC試驗(yàn)樣品浸提液(100%)、陽(yáng)性對(duì)照(含0.5%苯酚的DMEM培養(yǎng)液)和陰性對(duì)照液(高密度聚乙烯薄膜的浸提液),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,每組做6個(gè)平行;培養(yǎng)24 h后,做細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及吸光度的測(cè)定。

1.4.6 皮膚致敏和皮膚刺激試驗(yàn)

皮膚致敏試驗(yàn)和皮膚刺激試驗(yàn)按照《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第10部分:刺激與皮膚致敏試驗(yàn)》(GB/T 16886.10—2017)進(jìn)行測(cè)試。

皮膚致敏試驗(yàn)過(guò)程:選取15只雄性豚鼠將其分為2組:其中陰性對(duì)照組為5只動(dòng)物/組,試驗(yàn)組為10只動(dòng)物/組。試驗(yàn)前24 h將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部左側(cè)去毛,去毛范圍約為4～6 cm2。無(wú)菌條件下制備Gel/SF/BC樣品與陰性對(duì)照組,樣品規(guī)格為2.5 cm×2.5 cm,將試驗(yàn)組(Gel/SF/BC)及對(duì)照組(醫(yī)用紗布)樣品在動(dòng)物背部去毛區(qū)域進(jìn)行貼敷并誘導(dǎo)激發(fā)致敏反應(yīng)。在24 h與48 h后觀察動(dòng)物激發(fā)部位皮膚反應(yīng),并按照Magnusson and Kligman分級(jí)表評(píng)分。

皮膚刺激試驗(yàn)過(guò)程:在給藥前24 h內(nèi),將動(dòng)物背部?jī)蓚?cè)去毛,去毛面積約為10 cm×15 cm。將試驗(yàn)組(Gel/SF/BC)及對(duì)照組(醫(yī)用紗布)樣品在兩側(cè)去毛區(qū)域進(jìn)行貼敷并做包扎處理,貼敷持續(xù)4 h后,移除樣品。移除樣品后分別于1、24、48 h和72 h觀察動(dòng)物皮膚紅斑和水腫反應(yīng)并按照皮膚反應(yīng)記分表進(jìn)行記分。

2 結(jié)果與討論

2.1 Gel/SF管狀多孔支架在不同預(yù)凍溫度下的多孔結(jié)構(gòu)

圖2為不同預(yù)凍溫度下制備的Gel/SF管狀多孔支架截面SEM圖像及孔徑分布。圖2顯示:預(yù)凍溫度為-20 ℃的Gel/SF管狀多孔支架為大孔結(jié)構(gòu),孔洞之間連通性較好,孔徑為(141±78)μm(圖2(a));隨著預(yù)凍溫度降低至-80 ℃,Gel/SF多孔結(jié)構(gòu)的孔徑變小,且孔洞周圍分布有閉合的凹陷結(jié)構(gòu),孔洞之間的連通性較差,孔徑為(23±18)μm(圖2(b));在-20 ℃和-80 ℃下,Gel/SF管狀多孔支架孔徑大小以及結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)在恒定溫度場(chǎng)下,冰晶顆粒生長(zhǎng)至最終定型時(shí)的尺寸隨著溫度降低而變小,冷凍干燥升華從而形成具有不同孔徑的多孔結(jié)構(gòu);-196 ℃的Gel/SF支架的多孔結(jié)構(gòu)類似于一種取向結(jié)構(gòu),孔徑為(88±23)μm(圖2(c))。研究發(fā)現(xiàn),-196 ℃下的多孔結(jié)構(gòu)孔徑并沒(méi)有隨著溫度的下降而減小。這是因?yàn)楣枘z模具自身的低導(dǎo)熱性,在冷凍時(shí)一維方向上存在溫度場(chǎng)(即-196 ℃到室溫35 ℃),冰晶沿著一維方向的溫度場(chǎng)而生長(zhǎng),導(dǎo)致冷凍干燥所形成的多孔結(jié)構(gòu)會(huì)存在取向結(jié)構(gòu),且不同位置處截面的多孔結(jié)構(gòu)及孔徑大小存在差異[10-11]。由于人尿道脫細(xì)胞基質(zhì)海綿體層孔徑大小為100～300 μm,因此,在-20 ℃的冷凍條件制備的Gel/SF管狀多孔支架更適合作為尿道組織修復(fù)支架。

圖2 不同溫度下Gel/SF支架的SEM圖及孔徑分布圖

2.2 Gel/SF/BC雙層支架微觀形貌分析

圖3為-20 ℃預(yù)凍溫度下所制備的Gel/SF/BC雙層支架SEM圖像。Gel/SF/BC內(nèi)側(cè)是單純BC形成的致密層,外側(cè)是以Gel/SF管狀多孔支架為骨架復(fù)合BC納米纖維的多孔疏松層,多孔疏松層是由微米級(jí)的多孔結(jié)構(gòu)組成,孔與孔之間相互連通,孔徑的大小為(143±40)μm(圖3(a)),與同條件下制備的Gel/SF管狀多孔支架孔徑一致。

圖3 Gel/SF/BC雙層支架多級(jí)結(jié)構(gòu)SEM圖及孔徑、納米纖維分布圖

進(jìn)一步對(duì)多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)壁同一位置進(jìn)行分級(jí)觀察,在微米級(jí)多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)壁存在BC三維納米網(wǎng)絡(luò)纖維,納米級(jí)纖維直徑為(78±24)nm(圖3(b))。

觀察Gel/SF/BC雙層支架的致密層,其內(nèi)表面擁有致密的細(xì)菌纖維素層,厚度為(29±4)μm,納米纖維相互交錯(cuò)形成的蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu),構(gòu)成蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)的納米纖維直徑在(44±8)nm(見(jiàn)圖3(c))。納米纖維的分布呈現(xiàn)蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu),是由于Gel/SF管狀多孔支架與木醋桿菌在培養(yǎng)液中的靜電作用力,改變了木醋桿菌的聚集狀態(tài),進(jìn)而影響到納米纖維的自組裝過(guò)程,最后呈現(xiàn)出不同形貌結(jié)構(gòu)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)[12]。靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素為三維無(wú)序納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而通過(guò)靜電作用力的控制可得到特殊的蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)或樹枝狀結(jié)構(gòu)[13]。在雙層支架的多尺度結(jié)構(gòu)中,納米級(jí)纖維占比為87.5%,亞微米級(jí)纖維占比12.5%。因此,BC的納米纖維貫穿于Gel/SF管狀多孔支架的內(nèi)壁及其內(nèi)表面。

對(duì)比原位發(fā)酵法所制備的Gel/SF/BC雙層支架與人尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的多尺度結(jié)構(gòu),結(jié)果如表1所示。由表1可知,Gel/SF/BC雙層支架與尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的厚度近乎一致,雙層支架的疏松多孔層平均孔徑(143±40)μm,其內(nèi)壁納米纖維直徑為(78±24)nm,致密層納米纖維直徑(44±8)nm。而人尿道的脫細(xì)胞基質(zhì)海綿體層孔徑(146±39)μm,納米纖維直徑(30±7)nm,致密層納米纖維直徑(25±5)nm。因此,Gel/SF/BC雙層支架的多尺度結(jié)構(gòu)接近于人體尿道脫細(xì)胞基質(zhì)。

表1 Gel/SF/BC雙層支架和尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的多級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 Gel/SF/BC雙層支架化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖4 不同樣品的FT-IR和XRD圖譜

2.4 Gel/SF/BC雙層支架孔隙率及吸水量

組織工程支架應(yīng)具有較高的孔隙率及相互連通的多孔結(jié)構(gòu),這對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移以及新陳代謝等有著重要的影響[18]。對(duì)不同樣品孔隙率及吸水量進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知Gel/SF支架和Gel/SF/BC雙層支架的孔隙率都在80%以上,對(duì)于尿道組織工程而言已基本滿足[19]。Gel/SF多孔支架孔隙率為85.8%,Gel/SF/BC雙層支架的孔隙率為81.3%,雙層支架的孔隙率相對(duì)Gel/SF較低,是因?yàn)镚el/SF多孔結(jié)構(gòu)的孔壁上原位生長(zhǎng)的BC對(duì)其孔隙率有一定的影響。Gel/SF/BC雙層支架的吸水量為16.1,是Gel/SF的1.1倍,兩者由于其多孔結(jié)構(gòu)存在,均具有較強(qiáng)的吸水性能。但Gel/SF/BC雙層支架的多孔結(jié)構(gòu)里原位生長(zhǎng)了納米級(jí)BC,并具有更小孔徑的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使得該雙層支架的吸水性能較Gel/SF具有明顯的提升。

圖5 不同樣品孔隙率及吸水量

2.5 Gel/SF/BC雙層支架力學(xué)性能分析

天然BC本身具有良好的力學(xué)性能,其應(yīng)用于支架材料的制備可使材料的力學(xué)性能得到改善[20]。對(duì)不同樣品的拉伸性能進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如圖6所示。Gel/SF/BC雙層支架在72.5 kPa處發(fā)生材料的斷裂(見(jiàn)圖6(a)),其斷裂強(qiáng)度與斷裂伸長(zhǎng)率分別是Gel/SF的1.3倍和1.1倍(見(jiàn)圖6(b)),這表明Gel/SF/BC雙層支架具有更好的抵抗外力拉伸形變能力,原位發(fā)酵生長(zhǎng)的BC為Gel/SF支架帶來(lái)力學(xué)性能上的提升。

圖6 不同樣品的拉伸性能

新生的組織需要適當(dāng)?shù)膲嚎s力學(xué)性能提供支撐,以提供和維護(hù)細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的空間環(huán)境,并維持一定時(shí)間直至新生組織具有一定的自身生物力學(xué)特性[21-22]。對(duì)不同樣品進(jìn)行壓縮性能的比較,結(jié)果如圖7所示。Gel/SF/BC雙層支架第一次循環(huán)壓縮的應(yīng)力-應(yīng)變曲線所對(duì)應(yīng)的最大應(yīng)力為88.2 kPa,楊氏模量為127.7 kPa,在經(jīng)過(guò)第十次循環(huán)壓縮后其最大壓縮應(yīng)力降低為83.1 kPa,楊氏模量降低為90.9 kPa,其第一次循環(huán)壓縮對(duì)應(yīng)的最大壓縮應(yīng)力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.6倍,經(jīng)過(guò)第十次循環(huán)壓縮對(duì)應(yīng)的最大壓縮應(yīng)力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.7倍(見(jiàn)圖7(c)—(d))。這表明Gel/SF/BC雙層支架具有更好的耐壓縮性能,Gel/SF/BC雙層支架上原位生長(zhǎng)的BC含有大量羥基,與Gel/SF形成氫鍵,提高了雙層支架的力學(xué)性能。

圖7 不同樣品的壓縮性能

2.6 雙層支架細(xì)胞毒性測(cè)試

采用二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法,用各實(shí)驗(yàn)組的浸提液培養(yǎng)L-929細(xì)胞,并對(duì)其增殖情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)后,對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)組的吸光度,結(jié)果如圖8所示。陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)比其他組的吸光度較低,顯微鏡觀察L-929細(xì)胞幾乎沒(méi)有增長(zhǎng),這表明在含0.5%苯酚的DMEM培養(yǎng)液中細(xì)胞無(wú)法正常增殖生長(zhǎng)。對(duì)比陽(yáng)性組,空白樣品、陰性對(duì)照組及Gel/SF/BC浸提液(100%),實(shí)驗(yàn)組的吸光度相對(duì)較強(qiáng),說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀況較好。對(duì)比實(shí)驗(yàn)組的吸光度(OD值),發(fā)現(xiàn)Gel/SF/BC實(shí)驗(yàn)組樣品浸提液OD值(0.218±0.002)稍低于空白對(duì)照組(0.324±0.012)。按照標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定空白對(duì)照組對(duì)應(yīng)的存活率為100%,則實(shí)驗(yàn)組Gel/SF/BC的存活率為86.7%。對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察,僅觀察到輕微的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象,推測(cè)Gel/SF/BC雙層支架在采用曲拉通 X-100浸泡處理去除內(nèi)毒素后,存在微量的殘留,從而影響了細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞存活率為86.7%,高于標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)胞存活率應(yīng)不小于70%的要求,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)樣品Gel/SF/BC對(duì)L-929無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

圖8 24 h后不同樣品的吸光度

2.7 雙層支架皮膚致敏性與皮膚刺激性測(cè)試

皮膚致敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Gel/SF/BC樣品與陰性對(duì)照組樣品評(píng)分均為0(無(wú)明顯改變),陽(yáng)性對(duì)照組評(píng)分為2(致敏物為2,4-二硝基氯苯,中度融合性紅斑),說(shuō)明Gel/SF/BC樣品無(wú)皮膚致敏性。

皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Gel/SF/BC樣品實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組原發(fā)性刺激指數(shù)均為0(極輕微刺激性),陽(yáng)性組(20%十二烷基硫酸鈉)原發(fā)性刺激指數(shù)均為4.1(中等微刺激性),說(shuō)明Gel/SF/BC樣品無(wú)皮膚刺激性。

3 結(jié) 論

本文采用原位發(fā)酵法將BC與Gel/SF管狀多孔支架復(fù)合,得到具有模擬尿道組織多尺度結(jié)構(gòu)的Gel/SF/BC雙層支架。Gel/SF/BC雙層支架表現(xiàn)出良好的力學(xué)性能、吸水性能及生物相容性,在尿道組織工程材料具有一定的應(yīng)用前景。主要結(jié)論如下:

a)制備的Gel/SF/BC雙層支架,實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿道組織宏觀形貌、微米級(jí)多孔、納米級(jí)纖維的結(jié)構(gòu)模擬。Gel/SF/BC雙層支架宏觀形貌長(zhǎng)度為9.3 mm,平均孔隙率為83.1%,其中:內(nèi)側(cè)致密層由直徑為(44±8)nm的單純BC構(gòu)成,外側(cè)多孔疏松層以孔徑為(143±40)μm的Gel/SF多孔支架為骨架,直徑為(78±24)nm的BC納米纖維在其孔壁表面分布。

b)Gel/SF/BC雙層支架其力學(xué)強(qiáng)度相比于Gel/SF多孔支架有所提升,Gel/SF/BC斷裂強(qiáng)度為72.5 kPa,是Gel/SF的1.3倍。Gel/SF/BC經(jīng)過(guò)10次循環(huán)壓縮對(duì)應(yīng)的最大壓縮應(yīng)力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.7倍。Gel/SF/BC雙層支架相比于Gel/SF多孔支架吸水量有所提升,為Gel/SF的1.1倍。

c)Gel/SF/BC雙層支架無(wú)細(xì)胞毒性、無(wú)皮膚致敏與皮膚刺激反應(yīng),具有較好的生物相容性,能夠應(yīng)用于尿道組織工程。