武周游 李婷 張騰偉 房巧燕 楊劉 黎巧

湖南省婦幼保健院新生兒一科（長沙 410008）

急性肺損傷（acute lung injury， ALI）是常見的膿毒癥臨床并發(fā)癥，具有較高的發(fā)病率和死亡率，其特征是肺的上皮層和內(nèi)皮層均受損，導(dǎo)致肺水腫和急性呼吸衰竭［1-2］。因此，內(nèi)皮細(xì)胞（epithelial cells， ECs）損傷或死亡被認(rèn)為是ALI 的主要病理特征之一。目前，越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞焦亡與ALI 有關(guān)。細(xì)胞焦亡由炎癥小體（NLRP3）觸發(fā)，并依賴于胱天蛋白酶-1（Caspase-1）激活和gasdermin D （GSDMD）裂解，誘導(dǎo)IL-1β 和IL-18 成熟［3］。臨床研究［4］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者外周單核細(xì)胞中Caspase-1 的表達(dá)顯著增加，并與膿毒癥的發(fā)生和不良預(yù)后相關(guān)。此外，激活的NLRP3 炎性小體通過直接激活Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦磷酸轉(zhuǎn)移和間接釋放的促炎細(xì)胞因子而加重膿毒癥小鼠肺損傷［5-6］。因此，細(xì)胞焦亡被認(rèn)為是維持肺內(nèi)皮完整性和治療ALI 的潛在治療靶點。最近的數(shù)據(jù)［7］表明，內(nèi)源性脂質(zhì)或其氧化產(chǎn)物可以激活或抑制 NLRP3 的組裝。在由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的活性醛中，4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal， HNE）是最豐富的終產(chǎn)物。已證實，HNE 產(chǎn)生有益的效果，包括刺激內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制、抑制炎癥和巨噬細(xì)胞焦亡［8］。然而，尚不清楚HNE 是否有助于減輕新生兒膿毒癥誘導(dǎo)的ALI。在本研究中，我們通過盲腸漿液（cecal slurry， CS）在野生型和GSDMD-/-新生小鼠中建立了ALI 模型，并通過腹腔注射HNE 治療，結(jié)果顯示HNE 可以通過下調(diào)NLRP3/caspase-1 信號來抑制ECs 細(xì)胞焦亡，進(jìn)而有助于減輕肺部損傷。

1 材料與方法

1.1 動物和分組新生（5 ～ 7 d）C57BL/6J 雄性小鼠（野生型）和C57 GSDMD-/-雄性小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。小鼠飼養(yǎng)于SPF級實驗動物中心，室溫保持在大約22 ℃。研究經(jīng)湖南省婦幼保健院倫理委員會審批通過（編號：2021-012-05）。將它們隨機(jī)分成5 只小鼠/籠，在12 h 的晝夜循環(huán)中正常喂食和飲水。將所有小鼠隨機(jī)分為5 組：（1）假手術(shù)組（Sham 組）；（2）假手術(shù)小鼠接受HNE 治療組（Sham+HNE 組）；（3）盲腸漿液（cecal slurry，CS）處理組（CS 組）；（4）CS 處理的GSDMD-/-小鼠組（CS + GSDMD-/-組）；（5）CS 小鼠接受HNE 治療組（CS + HNE 組）。根據(jù)文獻(xiàn)［9］描述的方法建立了CS 模型以誘導(dǎo)新生兒膿毒癥。具體操作為：處死成年小鼠，收集盲腸內(nèi)容物并與5%葡萄糖溶液混合以產(chǎn)生CS 溶液（80 mg/mL）。在Sham 組和Sham + HNE 組中，小鼠接受0.9%鹽水的腹膜內(nèi)注射。在其他組中，小鼠接受濃度為1.3 mg/g 體質(zhì)量（BW）的CS 腹膜內(nèi)注射。在CS +HNE 組，小鼠接受了腹腔注射CS 和6 μmol/L HNE（美國Sigma 公司）［8］。每12 h 記錄1 次小鼠的存活狀態(tài)，計算72 h 內(nèi)小鼠的存活率，存活小鼠使用過量（150 mg/kg BW）的戊巴比妥鈉處死。收集肺組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色，以評估膿毒癥小鼠肺的病理損傷，從而確定建模是否成功。

1.2 肺組織病理學(xué)將肺組織固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中，切成5 μm 厚的切片，然后用H&E 染色。使用RX51 顯微鏡（日本Olympus 公司）進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)評估肺損傷評分［10］。從每個切片中隨機(jī)選擇6 個區(qū)域，根據(jù)5 個標(biāo)準(zhǔn)評估肺損傷的嚴(yán)重程度：（1）肺泡中性粒細(xì)胞積聚；（2）間質(zhì)中性粒細(xì)胞積聚；（3）透明膜形成；（4）肺泡蛋白滲出；（5）肺泡間隔厚度。每個項目的得分為0 - 4，如下所示：0，無損傷；1，輕傷；2，中度損傷；3，重傷；4，非常嚴(yán)重的損傷。累積損傷的分?jǐn)?shù)定義為ALI 的總分?jǐn)?shù)。

1.3 肺濕/干重量比分離新鮮肺并稱重以測量濕重。然后，將它們在80 ℃的烘箱中干燥48 h，稱重以確定干重。最后，計算肺濕/干重比來評估肺水腫。

1.4 CT 圖像每組隨機(jī)抽取5 只小鼠，胸部CT掃描由廣州瑞舒生物科技有限公司完成。選擇在獲得的連續(xù)圖像中具有最小冠狀心包陰影圖像的橫截面圖像。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法用含有放射免疫沉淀分析緩沖液（美國Thermo Fisher 公司）的蛋白酶抑制劑混合物提取總肺蛋白，用BCA 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）測定濃度。將蛋白質(zhì)濃度稀釋至3 μg/μL，并在100 ℃的恒溫水浴中煮沸10 min，使蛋白質(zhì)樣品完全變性。使用8% ～ 12% SDSPAGE 凝膠分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到0.45 μm 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將PVDF 膜與第一抗體在4 ℃下孵育過夜，用含吐溫緩沖液的Tris 緩沖鹽水沖洗后，膜與第二抗體在室溫下孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光過氧化物酶底物（美國Millipore 公司）觀察蛋白質(zhì)條帶。利用Image J 軟件進(jìn)行定量光密度分析。本研究中使用了以下抗體：抗HNE、抗NLRP3、抗Caspase-1、抗GSDMD-N、抗IL-1β、抗IL-18、山羊抗兔IgG、β-Actin 和GAPDH（均購自英國Abcam 公司）。

1.6 RNA 測序和生物信息學(xué)分析使用RNAiso Plus（日本Takara 公司）從CS 組和CS + HNE 組小鼠的肺組織中提取總RNA。在定量和定性后，每個樣品1 μg RNA 用作RNA 樣品制備的輸入材料。使用NEB next ultraTMRNA Library Prep Kit（美國NEB 公司）在Illumina 系統(tǒng)上生成測序文庫。索引代碼被添加到每個樣品的屬性序列中。然后使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBotHS 在cBot-Cluster 生成系統(tǒng)上對索引編碼的樣品進(jìn)行聚類。在Illumina Novaseq 平臺上對文庫制備物進(jìn)行測序，產(chǎn)生了150 bp 的成對末端讀數(shù)。

用fastp（版本0.19.8）檢測和修剪接頭序列，然后進(jìn)行原始閱讀質(zhì)量過濾。通過HISAT2（版本2.1.0）將處理后的讀數(shù)與參考基因組（ENSEMBL基因組）進(jìn)行比對。從ENSEMBL 數(shù)據(jù)庫的GTF file 下載創(chuàng)建用于描述基因組特征的模型。在R中使用DEseq2 分析差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes， DEG）。在R 中使用kohonen 軟件包（版本3.0.10）進(jìn)行聚類分析。使用R 軟件包clusterprofler（版本3.14.3）進(jìn)行基因本體（GO）分析和基因集合富集分析（GSEA）。校正P＜ 0.05 的GO 術(shù)語或基因集分別認(rèn)為是顯著富集的術(shù)語和途徑。

1.7 肺ECs 培養(yǎng)和分組在膿毒癥小鼠麻醉后，用無菌PBS 緩沖液灌注右心室，直到肺無血。隨后，將肺切成1 mm 的小片，用0.25%胰蛋白酶在37 ℃溶解45 min。用血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1包被的磁珠分選所得細(xì)胞懸液。將分離的肺ECs鋪在纖連蛋白包被的T-25 燒瓶上。此外，用Dulbecco 氏改良Eagle 培養(yǎng)基培養(yǎng)ECs。使用流式細(xì)胞儀用抗CD-31 鑒定ECs，細(xì)胞＞ 90%未被污染。將ECs 分為Ctrl 組、LPS + ATP 組、LPS + ATP +HNE-L 組和LPS + ATP + HNE-H 組。除Ctrl 組外，其他組細(xì)胞用LPS（100 ng/mL，美國Sigma 公司）預(yù)處理細(xì)胞3 h，然后加入ATP（2 mmol/L，美國Sigma 公司）處理細(xì)胞60 min。對于LPS + ATP +HNE-L 組。

LPS + ATP + HNE-H組，在細(xì)胞暴露于LPS時，同時分別加入0.3 μmol/L HNE 或3 μmol/L HNE。Ctrl 組加入等量的DMSO 溶媒處理［8］。

1.8 免疫熒光將肺冷凍切片用甲醇固定。對于培養(yǎng)的細(xì)胞，將細(xì)胞鋪在蓋玻片上并用4%多聚甲醛固定。用山羊血清封閉后，將初級抗體加入切片中，在4 ℃孵育過夜。隨后，將切片在黑暗中與含有DAPI 和第二抗體的封閉緩沖液一起溫育2 h。使用RX51 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）獲得圖像。本研究中使用了以下抗體：抗HNE、抗GSDMD、抗Caspase-1 和Cy3 綴合的山羊抗兔IgG（均購自英國Abcam 公司）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過方差分析和Newman-Keuls 檢驗分析組間差異。通過Kaplan-Meier 檢驗繪制生存曲線，通過log-rank檢驗分析組間差異。P＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥小鼠肺組織中HNE水平顯著增加CS小鼠肺組織中的HNE 以時間依賴性方式逐漸降低。此外，我們在CS 小鼠中腹腔注射HNE，結(jié)果顯示小鼠肺組織中HNE 水平明顯增加（圖1）。

2.2 HNE 對CS 小鼠肺病變和死亡率的影響H&E 染色顯示，與CS 組相比，CS + HNE 組和CS +GSDMD-/-組小鼠的肺組織評分顯著降低（P＜ 0.05）（圖2A）。計算機(jī)斷 層掃描證實了HNE 和GSDMD基因缺失可以減輕肺損傷，并且CS + HNE 組和CS + GSDMD-/-組小鼠肺組織的濕和干重量比顯著低于CS 組（圖2B-C）。小鼠72 h 存活率觀察結(jié)果顯示，與CS 組相比，CS + HNE 組和CS + GSDMD-/-組小鼠的存活率顯著提高（P＜ 0.05）。

圖2 HNE 對CS 小鼠肺病變和死亡率的影響Fig.2 The effect of HNE on lung disease and mortality in CS mice

2.3 小鼠肺的 RNA 測序分析對標(biāo)準(zhǔn)化的基因計數(shù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，以確定各組之間的DEG。圖3A 顯示了CS 組和CS + HNE 組中P＜ 0.05 且差異倍數(shù)≥ 1.0 的DEG。在GSEA 研究中發(fā)現(xiàn)HNE下調(diào)了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激（圖3B-C）。DEG 的GO 分析揭示了HNE 在膿毒癥誘導(dǎo)的ALI 中的保護(hù)作用機(jī)制涉及細(xì)胞焦亡通路（圖3D）。

圖3 小鼠肺組織的RNA 測序分析Fig. 3 RNA sequencing analysis of mouse lung tissue

2.4 HNE 對 CS 小鼠肺細(xì)胞焦亡的影響CS 顯著上調(diào)小鼠肺組織中GSDMD 的表達(dá)，而HNE 顯著下調(diào)CS 小鼠肺組織中GSDMD 的表達(dá)（圖4A）。與Sham 組相比，CS 組肺ECs 中GSDMD-N 表達(dá)（GSDMD 的活性形式）顯著增加（P＜ 0.05）。CS +HNE組和CS + GSDMD-/-組小鼠的肺ECs中GSDMDN表達(dá)顯著低于CS組（P＜ 0.05）（圖4B）。與Sham組相比，CS 組肺ECs 中C-caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β表達(dá)顯著增加（P＜ 0.05）。CS + HNE 組和CS+ GSDMD-/-組小鼠的肺ECs中C-caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β 表達(dá)顯著低于CS 組（P＜ 0.05）（圖4C、D）。

圖4 HNE 對膿毒癥小鼠細(xì)胞焦亡激活的影響Fig.4 Effect of HNE on activation of cell apoptosis in septic mice

2.5 HNE 對ECs 細(xì)胞焦亡的影響在細(xì)胞實驗中，與Ctrl 細(xì)胞相比，LPS + ATP 顯著降低細(xì)胞活力（P＜ 0.05），和增加了GSDMD、C-caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β的蛋白表達(dá)（P＜ 0.05），而這些作用也被HNE 抑制（圖5），表明HNE 通過NLRP3/Caspase-1 途徑調(diào)節(jié)ECs 細(xì)胞的焦亡作用。

圖5 HNE 在體外抑制了ECs 的細(xì)胞焦亡Fig.5 HNE inhibited the cell death of ECs in vitro

3 討論

ALI 是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一，病死率高。嚴(yán)重感染可導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮屏障破壞，最終導(dǎo)致感染性ALI 的高死亡率［2］。因此，有效維持膿毒癥時ECs 的功能仍然是一個亟待解決的問題。先前研究［8］發(fā)現(xiàn)，HNE 不僅是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，而且還作為信號分子發(fā)揮重要作用，通過調(diào)節(jié)NLRP3 炎癥小體的激活抑制炎癥。在這項研究中，HNE 在CS 誘導(dǎo)的新生膿毒癥小鼠肺組織中的表達(dá)顯著降低。體內(nèi)和體外研究表明，HNE 通過抑制ECs 細(xì)胞焦亡減少ALI。

HNE 是一種多效性脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物，其能夠干擾誘導(dǎo)炎癥的主要生物分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和活性并充當(dāng)自由基的第二信使，因此參與各種病理生理過程［11］。最近的數(shù)據(jù)［8］表明，當(dāng)細(xì)胞在LPS 刺激前用高劑量HNE（25 μmol/L）處理時，HNE 通過單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的NF-κB 信號調(diào)節(jié)IL-1β分泌，減輕肺損傷。近年來，在各種炎癥疾病模型中發(fā)現(xiàn)HNE 在調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［12-13］。這項研究發(fā)現(xiàn)，HNE 表達(dá)在膿毒癥小鼠肺組織中顯著降低，通過腹腔注射HNE 可在CS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠模型中發(fā)揮保護(hù)作用。

細(xì)胞焦亡被認(rèn)為是ALI 中內(nèi)皮功能損傷的重要機(jī)制，也是ALI 治療的重要靶點［5］。因此，本研究分析了GSDMD 缺失和HNE 對膿毒性ALI 的影響。結(jié)果顯示，HNE 和GSDMD 基因缺失顯著減輕了ALI肺組織損傷，并提高了膿毒癥小鼠的存活率。通過對小鼠肺的RNA 測序分析，我們發(fā)現(xiàn)HNE 在膿毒癥誘導(dǎo)的ALI 中的保護(hù)作用機(jī)制涉及細(xì)胞焦亡通路。研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度（3 μmol/L）的HNE阻斷了nigericin 和ATP 誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡［8］。此外，HNE 可顯著降低肺組織中促炎細(xì)胞因子水平和ECs 焦亡，并通過抑制Cas-11 的表達(dá)來減輕潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀并改善的預(yù)后［14］。根據(jù)上述結(jié)果，我們推測HNE 通過抑制細(xì)胞焦亡在ALI 中發(fā)揮保護(hù)作用。

炎癥性胱天蛋白酶的激活是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵途徑［15-17］。NLRP3/Caspase-1 依賴型細(xì)胞焦亡在ALI 中起重要作用，并被認(rèn)為是ALI 的潛在治療靶點［18-19］。LPS 可以通過TLR4-NLRP 3 信號通路誘導(dǎo)ECs 中Caspase-1 的激活［20］。研究［21-22］表明，Caspase-1 的激活不僅誘導(dǎo)ECs 焦亡，而且誘導(dǎo)IL-1β 產(chǎn)生，IL-1β 是增加毛細(xì)血管通透性和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的重要因素。值得注意的是，最近研究證實HNE 是NLRP3 炎癥小體激活和隨后炎癥的一種新的內(nèi)源性抑制劑，調(diào)節(jié) HNE 的形成可能是抑制NLRP3 炎癥小體激活、IL-1β 分泌和組織炎癥的一種新的治療方法［8］。在這項研究中，HNE 的表達(dá)水平降低可能通過NLRP3/Caspase-1 途徑促進(jìn)細(xì)胞焦亡。在體外研究中，我們采用LPS + ATP聯(lián)合刺激的方法模擬肺ECs 膿毒癥。與LPS + ATP組相比，HNE 抑制了NLRP3/Caspase-1 的激活以及GSDMD、IL-1β 的成熟，并增加了ECs 的活性。因此，HNE 可以阻止細(xì)胞焦亡，從而保護(hù)ECs 的完整性，維持屏障功能，抵抗致病因子的入侵。

總之，我們的結(jié)果表明，HNE 的表達(dá)在膿毒癥新生小鼠中降低，其可以通過抑制NLRP3/caspase-1信號傳導(dǎo)來抑制肺ECs 細(xì)胞焦亡，并改善小鼠的ALI。這些發(fā)現(xiàn)揭示了內(nèi)源性脂質(zhì)或其氧化產(chǎn)物在保護(hù)新生兒ALI 中的作用，提示了一種新的潛在治療策略。然而，這項研究并不是全面的，需要進(jìn)一步研究以揭示內(nèi)源性脂質(zhì)或其氧化產(chǎn)物的深層調(diào)控機(jī)制，如HNE 的其他靶信號作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

【Author contributions】WU Zhouyou performed the experiments and wrote the article. LI Ting and ZHANG Tengwei performed the experiments. FANG Qiaoyan and YANG Liu revised the article. LI Qiao designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.