陳燦偉 廖壯文 范子文 黃帥 黃彥 陳斌偉

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨科（廣州 510260）

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性第二大的惡性腫瘤之一，合并骨轉移是PCa 患者的主要死因，研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性PCa 患者的5 年相對生存率為99%，而遠處骨轉移灶患者的5 年相對生存率不超過30%。此外，當PCa 轉移到骨后會引起包括高鈣血癥、頑固性劇烈疼痛、病理性骨折或神經(jīng)壓迫綜合征等相關并發(fā)癥［1-3］。溶酶體相關膜蛋白3（lysosome-associated membrane protein 3，LAMP3）是一種調控腫瘤細胞溶酶體功能的特異性膜蛋白，LAMP3 在骨肉瘤、卵巢癌、直腸癌及食管癌中發(fā)揮重要調控作用，但國內外關于LAMP3在PCa 骨轉移的研究目前尚未見報道［4-7］。因此本研究將重點探索LAMP3 對PCa 骨轉移細胞的影響及機制，為其作為潛在的治療靶點之一提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人PC-3細胞購于ATCC細胞庫，HUVEC細胞及ECM 培養(yǎng)基購于ScienCell 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清雙抗購自美國Gbico 公司；Matrigel 基質膠購自美國BD Biosciences 公司，CCK8 試劑盒購自美國AbMole 公司；單克隆體體LAMP3、VEGF、GAPDH 均購自美國Elabscience 公司，cyclin D1、c-myc、p-AKT、AKT 購自美國CST 公司，BCA 蛋白檢測試劑盒、ECL 發(fā)光液購于碧云天公司，ELISA 檢測試劑盒購自美國 R&D system，Trizol 購于美國Invitrogen 公司，Prime ScriptTMRT Master Mix 試劑盒、SYBR?Select Master Mix 試劑盒購于日本Takara 公司。

1.2 細胞轉染將PC-3 細胞以1 × 105個/孔的密度接種至6 孔平板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%時，使用Lipofectamine 3000 轉染試劑將Vector 及LAMP3-siRNA（序列如下5'-CACGAUGGCAGUCAAAUGATT-3' 和5'-UCAUUUGACUGCCAUCGUGTT-3'）質粒轉染入PC-3 細胞中，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉染48 h后添加G418繼續(xù)篩選，24 h 后停止篩選繼續(xù)培養(yǎng)及傳代。

1.3 CCK-8 檢測細胞增殖將轉染后的PC-3 細胞制成單細胞懸液并以4 × 103個/孔接種至96 孔板，貼壁后每孔加入100 μL CCK8稀釋液（含10 μL CCK8 原液），孵育2 h 后在490 nm 波長處測定細胞吸光度，設置5 個副孔并重復3 次。

1.4 劃痕試驗將轉染后的細胞按1 × 105個/孔接種至6 孔板中，待細胞匯合到80%時用200 μL無菌移液器尖端劃痕，培養(yǎng)基洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后通過使用顯微鏡拍照并使用Image J 軟件測量和計算間隙寬度。

1.5 Transwell 實驗用無血清培養(yǎng)基將轉染的PC-3 細胞重懸后，以5 × 105個/孔的密度接種至Transwell 上室中，下室加入含20% FBS 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2 次用0.1%結晶紫染色20 min，拍照后隨機選擇5 個視野計數(shù)。

1.6 條件培養(yǎng)液制備及血管分化試驗取轉染si-LAMP3 后繼續(xù)培養(yǎng)2 代的PC-3 細胞，胰酶消化后分瓶培養(yǎng)至70 %時各取培養(yǎng)液6 mL，3 000 r/min離心15 min后收集上清液，制備條件培養(yǎng)基Vector-CM 及LAMP3-CM，使用孔徑為0.22 μm 的濾過膜濾過后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。血管分化在Matrigel基質膠上進行，將預冷的Matrigel 膠預涂至96 孔板上并放入培養(yǎng)中聚合30 min，然后HUVEC 細胞以1 × 104個接種至培養(yǎng)孔中，然后分別每孔加入100 μL 上述條件培養(yǎng)基。24 h 后在顯微鏡下拍照并進行計數(shù)分析。

1.7 ELISA使用 ELISA 檢測試劑盒定量測定條件培養(yǎng)基中的MMP9 和VEGF 表達，根據(jù)說明書檢測 TGF-β1 和 VEGF 的表達，使用96 孔酶標儀在450 nm 處進行檢測，每個檢測組設置4 個副孔，結果取平均值并表示為 pg/mL。

1.8 RT-qPCR提取細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒以1 μg 經(jīng)RNase 活性的DNA 酶預處理的RNA作為模板制備cDNA 文庫，然后使用實時PCR 試劑盒進行PCR擴增共40個循環(huán)。以GAPDH作為對照，通過2-ΔΔCq法計算LAMP3、VEGF、AKT 及p-AKT的mRNA 表達量。

1.9 Western blot將離心后的細胞PBS 洗滌后加入含有PMSF 和RIPA 的裂解液提取總蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度。將樣品在10%的SDSPAGE 中電泳2 h，PVDF 膜電轉1.5 h 后用5%脫脂牛奶中封閉60 min。將PVDF 膜放在相應的一抗（1∶1 000）中過夜孵育。搖床低速震蕩1 h 后TBST洗膜液洗滌3 次，放入二抗（1∶5 000）中低速震蕩1 h，孵育完成后TBST 液洗滌3 次，然后用ECL 發(fā)光液曝光條帶。

1.10 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)由SPSS 進行統(tǒng)計分析和GraphPad 作圖，計量資料表示為均數(shù)±標準差，使用t檢驗評估組間差異，檢驗水準為α = 0.05，P ＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LAMP3 在PCa 細胞中的表達高于前列腺上皮細胞PCa 細胞LNCaP、C4-2B 及PCa 骨轉移細胞PC-3 中LAMP3 的表達水平明顯高于前列腺上皮細胞REPE-1，且PCa 骨轉移細胞PC-3 中LAMP3的表達水平最高（P ＜0.05，圖1）。

圖1 PCa 細胞與正常細胞中LAMP3 的表達水平Fig.1 The expression levels of LAMP3 were determined in prostate cancer cells compared with normal prostate epithelial cells

2.2 LAMP3 抑制PC-3 細胞的增殖我們構建了穩(wěn)定沉默LAMP3 的PC-3 細胞，WB 結果表明成功沉默PC-3 細胞中LAMP3 基因表達，下調LAMP3能抑制與細胞周期相關的基因cyclin D1、c-myc 的表達（圖2A）。進一步檢測LAMP3 對PC-3 細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)與對照組及空載對照組相比，沉默LAMP3 明顯抑制PC-3 細胞的增殖能力（P＜0.01，圖2B）。

圖2 沉默LAMP3 抑制PC-3 細胞的增殖Fig.2 LAMP3-silencing inhibited the cell proliferation of PC-3 cells

2.3 LAMP3 抑制PC-3 細胞的遷移與對照組及空載組相比，沉默LAMP3 的PC-3 細胞培養(yǎng)24 h后，細胞的遷移能力明顯被抑制（P ＜0.01，圖3）。

圖3 沉默LAMP3 抑制PC-3 細胞的遷移亡（× 50）Fig.3 LAMP3-silencing inhibited the cell migration of PC-3 cells

2.4 LAMP3 抑制PC-3 細胞的侵襲為了探索LAMP3 對PC-3 細胞侵襲的影響，我們使用了Transwell試驗進行檢測，結果表明與對照組及空載對照組相比，沉默LAMP3的PC-3細胞培養(yǎng)24 h后，PC-3細胞的侵襲能力明顯被抑制（P ＜0.01，圖4）。

圖4 沉默LAMP3 抑制PC-3 細胞的侵襲（× 50）Fig.4 LAMP3-silencing inhibited the cell invasion of PC-3 cells

2.5 LAMP3 抑制血管生成因子表達及血管生成為了探索LAMP3 對腫瘤誘導血管生成的影響，我們用沉默LAMP3 的PC-3 細胞制備的條件培養(yǎng)基si-LAMP3-CM 處理HUVEC 并在Matrigel 基質膠模型中培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)LAMP3 抑制了HUVEC的血管生成（圖5A），ELISA 結果也表明條件培養(yǎng)基si-LAMP3-CM 中血管內皮生長因子VEGF、MMP9 的分泌明顯減少（P ＜0.05，圖5B-D）。

圖5 沉默LAMP3-CM 抑制MMP9、VEGF 表達及HUVEC 細胞的血管生成（× 50）Fig.5 Angiogenesis of HUVEC and the expression of both VEGF and MMP9 is inhibited under si-LAMP3-CM

2.6 LAMP3 通過下調VEGF/AKT 通路抑制LAMP3 的促血管生成作用為了探索LAMP3 對血管生成影響的分子機制，我們檢測了條件培養(yǎng)基si-LAMP3-CM 處理HUVEC 后相關分子的表達，結果表明LAMP3 抑制了VEGF 的表達，并下調AKT 的磷酸化，提示LAMP3 通過下調VEGF/AKT抑制了HUVEC 的血管生成（P ＜0.05，圖6）。

圖6 LAMP3 抑制PC-3 細胞的VEGF 及AKT 通路的表達Fig.6 LAMP3 inhibited the expression of VEGF and AKT signaling pathway in PC-3 cells

3 討論

前列腺癌是全球男性常見的惡性腫瘤之一，遠處骨轉移是PCa 患者死亡的主要原因，盡管局部PCa 的治療取得了實質性進展，但轉移性PCa仍無法治愈，因此探索PCa 轉移的潛在機制對于尋找PCa 骨轉移的預防或治療策略至關重要［8-9］。LAMP3 作為一種溶酶體相關膜蛋白，最初發(fā)現(xiàn)其參與感染反應過程中成熟樹突細胞 （CD208、DCLAMP）的抗原呈遞，是形成溶酶體和維持溶酶體功能的關鍵蛋白［10-11］。此外，LAMP3 還與細胞自噬密切相關，如可通過誘導溶酶體膜透化或組織蛋白酶重分布而引發(fā)細胞自噬性死亡［12-14］。最近的研究表明LAMP3 作為一種腫瘤相關特異性蛋白與腫瘤遷移、侵襲及耐藥有關，WU 等［15］發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常組織相比，LAMP3 在喉部鱗狀細胞癌組織中的表達顯著升高，體內外研究表明LAMP3可調控LAMP3/LAMC2/TNC通路抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，且LAMP3 與喉癌患者的不良預后相關。LIU 等［16］發(fā)現(xiàn)下調LAMP3 能增加抑癌基因TP53 在骨肉瘤細胞中的表達并促進骨肉瘤細胞凋亡，抑癌基因TP53是LAMP3下游的關鍵調控基因。在本研究中，我們通過PCR及WB實驗發(fā)現(xiàn)了LAMP3在PCa 細胞中的表達明顯高于正常前列腺上皮細胞，其中以PC-3 及C4-2B 細胞上調最為明顯。隨后我們構建了siRNA 以抑制LAMP3 在PC-3 細胞的表達并進行了細胞增殖試驗、劃痕試驗及Transwell 試驗，結果發(fā)現(xiàn)下調LAMP3后PC-3的增殖、遷移和侵襲能力均明顯被抑制，與其他LAMP3 調控腫瘤的研究結果相似，該結果提示LAMP3 可能在PCa 骨轉移中起重要調控作用。

腫瘤誘導的異常血管生成是腫瘤快速發(fā)生發(fā)展的病理基礎，在腫瘤細胞增殖過程中會分泌大量促血管生成因子并募集內皮細胞形成異常的新生血管，這些新生血管會誘發(fā)缺氧微環(huán)境以促進腫瘤細胞的侵襲并阻礙免疫細胞的殺傷，因此腫瘤誘導的新生血管是腫瘤轉移的關鍵因素和治療靶點［17-19］。Matrigel 基質已廣泛應用于體外研究血管內皮細胞的血管生成，其主要是通過Matrigel 基質膠構建生物培養(yǎng)平臺，以模擬血管內皮細胞在組織間的遷移和誘導形成管狀血管樣結構，在體外可根據(jù)小管形成率和管樣結構評估血管生成效果［20-21］。在本研究中，我們首先收集了沉默LAMP3 后PC-3細胞的上清液并制備成條件培養(yǎng)基LAMP3-CM，然后利用Matrigel 培養(yǎng)平臺在體外檢測了條件培養(yǎng)基LAMP3-CM 對HUVEC 細胞血管生成的影響，結果表明條件培養(yǎng)基LAMP3-CM 可明顯抑制HUVEC 細胞的血管生成，與對照組相比LAMP3-CM組HUVEC 細胞的血管樣小管數(shù)量明顯減少，該結果提示LAMP3 可能是抑制PC-3 細胞誘導血管生成的靶點之一。

研究發(fā)現(xiàn)多種關鍵生成因子和信號通路調控腫瘤誘導的血管生成，其中由血管內皮生長因子VEGF 及AKT 信號通路尤為重要［22-23］。AKT 信號通路中多個基因是誘導血管生成和維持血管通透性的重要分子，如VEGF、HIF-1α 與MMP9 是調節(jié)血管生成的關鍵基因，在多種基因和細胞因子的誘導下會刺激內皮細胞增殖并誘導形成新血管［24-25］。DUAN 等［26］在發(fā)現(xiàn)穿心蓮內酯可能通過激活PI3K/AKT-eNOS 信號通路傳導參與調節(jié)高糖誘導的血管內皮細胞損傷模型中的血管生成。YU 等［27］發(fā)現(xiàn)山奈酚通過下調VEGF/AKT 信號通路以抑制LPS 和TNF-α 誘導的大鼠腸道血管內皮細胞的炎癥反應，同時AKT 和VEGF 形成自分泌回路來調節(jié)內皮細胞的血管生成。在本研究中，我們的結果表明LAMP3 不僅下調了PC-3 細胞中VEGF 的分泌和表達，同時下調了AKT 的磷酸化水平從而抑制了血管內皮細胞的血管生成。

綜上所述，LAMP3 通過下調VEGF/AKT 通路抑制PC-3 細胞的增殖、遷移、侵襲及血管生成，表明LAMP3 對PCa 的進展具有重要的調控作用，但該結果僅為體外實驗結果，LAMP3 對其他PCa 細胞如C4-2B 的影響及其在體內的抑制作用尚未探索，因此下一步將在體內進一步驗證其抗瘤活性，為LAMP3 作為新的PCa 轉移瘤治療靶點提供實驗依據(jù)。

【Author contributions】CHEN Canwei wrote the article. CHEN Canwei， LIAO Zhuangwen and FAN Ziwen performed the experiments.HUANG Shuai and HUANG Yan collected data. CHEN Binwei designed the study. All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.