李小琴 汪樂新 馬小軍 李娜 盧冠軍， 張智涵 張鵬程

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科 （銀川 750004）；2寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 （銀川 750004）；3吳忠市人民醫(yī)院護(hù)理部 （寧夏吳忠 751100）；4浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 （杭州 310000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney diseases，CKD）是一種以腎功能進(jìn)行性損害為特征的疾病，已成為全球關(guān)注的主要健康問題［1］，其具有不可逆、進(jìn)行性且早期癥狀不明顯等特點(diǎn)，是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd-stage renal disease， ESRD）和腎功能衰竭的主要病因之一［2］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種源自蛋氨酸代謝而來的含硫氨基酸，主要在腎臟代謝；Hcy 的積累即高同型半胱氨酸血癥（high homocysteine，HHcy），被認(rèn)為是CKD 發(fā)生發(fā)展的罪魁禍?zhǔn)祝?-4］。它主要通過觸發(fā)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等方式促進(jìn)CKD 的發(fā)生發(fā)展，隨時間推移可能導(dǎo)致ESRD［4-5］。課題組前期已證實(shí)HHcy 會造成腎損傷［6-7］。但目前為止還沒有降低Hcy 的有效策略。因此，明確Hcy 引起腎損傷的致病機(jī)制，對預(yù)防或治療與Hcy 相關(guān)的ESRD 至關(guān)重要。

足細(xì)胞是腎臟濾過屏障中獨(dú)特的終末分化上皮細(xì)胞，足細(xì)胞功能的喪失被認(rèn)為是腎小球疾病早期發(fā)展的關(guān)鍵因素。近年來，廣受關(guān)注的瞬時受體電位-6 通道（TRPC6）是一種廣泛表達(dá)在足細(xì)胞的非選擇性高通透Ca2+通道［8］，越來越多的研究［9-11］證實(shí)TRPC6 與腎小球疾病的發(fā)病密切相關(guān)，TRPC6 是一種重要的足細(xì)胞膜蛋白且對維持足細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。據(jù)報道［12］稱，TRPC6過度激活可導(dǎo)致足細(xì)胞和系膜細(xì)胞損傷，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腎小球細(xì)胞中TRPC6 異常開放發(fā)生細(xì)胞損傷的主要原因；然而，TRPC6 是否參與了Hcy引起腎損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

鐵死亡是一種與鐵離子相關(guān)的氧化死亡方法，主要以細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）堆積、過度的氧化反應(yīng)和膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)為特征的非細(xì)胞凋亡形式的細(xì)胞死亡，它主要受Xc-系統(tǒng)（主要為SLC7A11）以及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的調(diào)節(jié)［13］，SLC7A11 和GPX4 活性降低導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力下降和脂質(zhì)ROS 積累，進(jìn)而發(fā)生鐵死亡［14-15］。很多CKD 患者都存在不同程度的鐵代謝和脂質(zhì)代謝紊亂?？紤]到Hcy 對腎臟的損害以及Hcy、TRPC6、鐵死亡之間的潛在聯(lián)系，我們推測TRPC6 和鐵死亡可能參與了Hcy 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。因此，本研究以TRPC6 的分子調(diào)控為切入點(diǎn)，從腎小球足細(xì)胞鐵死亡的視角闡明Hcy 致病機(jī)制，為進(jìn)一步研究CKD 的發(fā)生與發(fā)展提供了必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器小鼠腎足細(xì)胞株（MPC-5）購自中國華拓生物；Hcy 細(xì)粉購買于美國Sigma；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清均購買于美國Gibco 公司；TRPC6、GPX4、SLC7A11 購買于美國Abcam；NFκb 購自中國Affinity；兔二抗購買于中杉金橋；MDA 檢測試劑盒購買于南京建成；蛋白質(zhì)提取試劑盒購自中國凱基生物；總RNA 提取試劑盒購買于北京TianGen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光PCR 試劑盒均購自日本TaKaRa；TRPC6 上下游引物由上海生工合成；TRPC6 干擾片段購自上海吉瑪公司；Lipofectamine2000 助轉(zhuǎn)劑購于美國invirogen；凋亡檢測試劑盒購于美國BD；全自動酶標(biāo)儀和凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析儀來自美國Bio-Rad；普通 PCR 擴(kuò)增儀和實(shí)時熒光定量PCR 儀購于德國Analytik Jena；電轉(zhuǎn)、電泳儀來自美國，BioRad；流式細(xì)胞儀來自美國，BD；激光共聚焦購自美國Zeiss；超凈工作臺為中國安泰公司；CO2培養(yǎng)箱、微型離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)購自美國Eppendorf；BS1105 型精密天平購于德國Sartorius 公司。

1.2 細(xì)胞干預(yù)及分組在 DMEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，將其置于37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中，連續(xù)2 d 進(jìn)行傳代，計算對數(shù)增長并選擇第3 - 4 代進(jìn)行試驗(yàn)。參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］，80 μmol/L 的Hcy 濃度為最佳干預(yù)濃度。因此，待細(xì)胞長到70%時，用80 μmol/L Hcy 干預(yù)作為Hcy 組，對照組不作任何處理，待干預(yù)達(dá)48 h 后采集細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組參考LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染si-TRPC6 和si-NC 到腎足細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前1 d，向6 孔板中每個孔接種2 × 105個細(xì)胞，待培養(yǎng)至70%匯合時。 a 液：將250 μL DMEM 與5 μL si-TRPC6 均勻混合。b 液：250 μL DMEM 與6 μL LipofectamineTM2000 均勻混合，放置5 min 后，輕輕混合a、b 液，室溫20 min。慢慢地將a/b 混合液添加到培養(yǎng)液中，添加普通的新鮮培養(yǎng)基到3.5 mL，搖動均勻，在37 ℃的溫度箱中放置6 ～ 8 h，將轉(zhuǎn)染液吸走，換上普通的培養(yǎng)液，在48 h 后采集細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR 檢測TRPC6 基因參考總RNA 試劑盒說明書，逐步提取每一組細(xì)胞的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。借助NCBI 網(wǎng)站查出鼠源TRPC6和GAPDH 基因序列，引物交給上海生工生物有限公司設(shè)計和合成；TRPC6 上游引物：5′-CTGATCCTCAGATCATCTCT-3′；下游引物：5′-GAGTAAAGGTTGAACATTCC-3′；PCR 在以下條件下進(jìn)行：在95 ℃下30 s，在95 ℃下5 s，在59.2 ℃下34 s，共計45 個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3 次。以GAPDH 為內(nèi)參，采用相對定量法（2-ΔΔCT法）計算TRPC6 的相對表達(dá)量。

1.5 Western blot 檢測TRPC6、GPX4、SLC7A11、NF-κB 蛋白表達(dá)吸棄培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 漂洗細(xì)胞2 次，將細(xì)胞收集到離心管中，在預(yù)冷4 ℃離心機(jī)5 000 r/min，離心5 min，吸棄上層液；參考凱基試劑盒說明進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取，BCA 方法測定其含量，加入200 mL loading buffer，震蕩搖勻，95 ℃沸騰10 min；根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小，用SDS-PAGE 在8%和12%的凝膠上離析，離析開的蛋白質(zhì)按分子大小裁剪并轉(zhuǎn)移到PVD膜上，用5%的脫脂牛奶在25 ℃下封閉120 min，PBST 液漂洗3次，每次10 min；參考抗體說明書用通用抗體稀釋液按1∶1 000 配制TRPC6、GPX4、SLC7A11、NFκb 抗體稀釋液，將洗好的 PVD 膜放入一抗孵育盒內(nèi)，4 ℃冰箱恒溫?fù)u床過夜，次日將PVD 膜浸泡于PBST 內(nèi)清洗3 次，10 min/次；后按1∶5 000 比例配制兔二抗稀釋液，25 ℃搖床孵120 min。后PBST 漂洗3 次，10 min/次。在避光情況下，使用ECL 發(fā)光A 液、B 液按1∶1 配制，將膜浸泡于發(fā)光液內(nèi)10 s 后，通過凝膠成像系統(tǒng)可視化蛋白質(zhì)條帶。使用Image Lab 對蛋白條帶進(jìn)行半定量，以β-action 作為內(nèi)參對照。

1.6 免疫熒光檢測TRPC6 蛋白表達(dá)將狀態(tài)良好的腎足細(xì)胞培養(yǎng)于20 mm 激光共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，Hcy 刺激48 h 后自培養(yǎng)箱內(nèi)取出；吸去培養(yǎng)基，用4 ℃ PBS 清洗細(xì)胞，室溫?fù)u床慢搖5 min，共3 次，棄PBS；用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定兩組細(xì)胞0.5 h，PBS 搖床慢搖3 次，每次5 min，吸去PBS；每個培養(yǎng)皿加入100 μL 山羊血清，室溫封閉30 min；吸去山羊血清，加入相對的TRPC6 一抗抗體（1∶400），在4 ℃條件下避光孵育12 h 后取出，室溫條件下放置0.5 h，PBS 清洗3 次，每次5 min，在避光條件下，每個皿加入100 μL熒光二抗（1∶100），37 ℃孵育1 h后PBS清洗；避光條件下，加入100 μL DAPI 染核5 min 后PBS 漂洗；后每個皿滴入100 μL防熒光淬滅劑封固，把染色后的細(xì)胞放于暗盒內(nèi)，在激光共聚焦顯微鏡下將細(xì)胞調(diào)至視野范圍內(nèi)進(jìn)行觀察照相。

1.7 細(xì)胞流式術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平胰酶消化采集足細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，用PBS 清洗2 次，每次5 min，12 000 r/min 離心5 min，用500 μL 1×Annexinv 結(jié)合細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexinv-FITC和PI 染色并標(biāo)記單染管，雙染管，空白管，在單染管只加PI，雙染管加Annexinv-FITC 和PI，空白對照管不加，放置20 min 后在流式細(xì)胞儀上測定細(xì)胞凋亡水平。設(shè)置雙參數(shù)散點(diǎn)圖（PI：縱坐標(biāo)，Annexinv-FITC：橫坐標(biāo)），劃分4 個部分，即左上方為機(jī)械性損傷細(xì)胞率，而右上方為凋亡較晚的細(xì)胞率；左下方為正常活體細(xì)胞率，右下方為凋亡較早的細(xì)胞，以右上方細(xì)胞比率+右下方細(xì)胞比率計算細(xì)胞凋亡率。

1.8 MDA 檢測采集各組細(xì)胞的上清液，標(biāo)記，14 000 r/min 離心5 min，取上層液，嚴(yán)格參考MDA試劑盒說明書測定各組細(xì)胞中MDA 含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法使用prism 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組細(xì)胞間的差異，使用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）分析多組細(xì)胞間的差異。當(dāng)P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高同型半胱氨酸誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞鐵死亡同Control 組比較，Hcy 組GPX4、SLC7A11 表達(dá)水平均降低（P＜ 0.05），同時Hcy 組凋亡率增加、MDA 表達(dá)水平增高，兩組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。綜合分析，Hcy 可引起氧化自由基的累積，是足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的重要依據(jù)之一（圖1 和表1）。

表1 兩組間MDA 水平的比較Tab.1 Comparison of MDA levels between the two groups

圖1 高同型半胱氨酸致足細(xì)胞鐵死亡Fig.1 High homocysteine induced iron death in podocytes

2.2 高同型半胱氨酸誘導(dǎo)了腎小球足細(xì)胞中TRPC6及NFκb的表達(dá)同Control組對比，足細(xì)胞中的TRPC6蛋白及mRNA表達(dá)量均升高（P＜ 0.05）；Western blot 結(jié)果表明，與對照組相比，NF-κb 信號通路蛋白表達(dá)增加（P＜ 0.05）。上述結(jié)果提示：Hcy 上調(diào)了TRPC6 及NF-κb 的表達(dá)（圖2）。

圖2 Hcy 上調(diào)TRPC6 及NF-κB 的表達(dá)Fig.2 Homocysteine increasing the expression of TRPC6 and NF-κB

2.3 轉(zhuǎn)染TRPC6 干擾片段后TRPC6 mRNA 表達(dá)情況為進(jìn)一步研究TRPC6 在腎小球足細(xì)胞鐵死亡中的作用，將TRPC6 干擾片段及TRPC6 NC 轉(zhuǎn)染后分組為Control、si-NC及si-TRPC6（si-TRPC6-1、si-TRPC6-2、si-TRPC6-3）組，通過qRT-PCR 檢測TRPC6 mRNA 表達(dá)量，結(jié)果提示：與Control 組比較，si-NC 的TRPC6 mRNA 表達(dá)沒有差異；與si-NC組相對比，si-TRPC6（si-TRPC6-1、si-TRPC6-2、si-TRPC6-3）組中TRPC6 的mRNA 表達(dá)水平降低，其中si-TRPC6-3 干擾效果最強(qiáng)（P＜ 0.05），后續(xù)則選擇si-TRPC6-3 干擾片段用于實(shí)驗(yàn)，這也提示干擾TRPC6 的模型構(gòu)建成功（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染干擾TRPC6 后TRPC6 mRNA 的表達(dá)Fig.3 Expression of TRPC6 mRNA after transfection interferes with TRPC6

2.4 轉(zhuǎn)染TRPC6 干擾片段后鐵死亡相關(guān)蛋白、TRPC6 及NF-κb 的表達(dá)情況為了揭示TRPC6/NF-κb 是否參與Hcy 誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的過程，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6 干擾片段及TRPC6 NC 后給予Hcy 干預(yù)，Western blot 分組為Control、Hcy、si-NC+Hcy、si-TRPC6+Hcy，采用Western blot 檢測鐵死亡相關(guān)蛋白、TRPC6及NF-κb的表達(dá)，結(jié)果提示：與Hcy組相比，si-NC+Hcy 組的GPX4、ALC7A11、TRPC6以及NF-κB 表達(dá)均無差異；與si-NC+Hcy 組相對比，si-TRPC6+Hcy 組中鐵死亡相關(guān)蛋白：GPX4、ALC7A11 表達(dá)增加（P＜ 0.05）；TRPC6 及NF-κb 蛋白表達(dá)減低（P＜ 0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染干擾TRPC6 后細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果提示：與Hcy 組對比，si-NC+Hcy 組中凋亡率無明顯差異；與si-NC+Hcy 組相比，si-TRPC6+Hcy 組中凋亡水平有所下降（P＜ 0.05），提示TRPC6/NF-κb 參與了Hcy 誘導(dǎo)腎足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的過程（圖4）。

圖4 TRPC6/NF-κB 參與了Hcy 誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞鐵死亡Fig.4 TRPC6/NF-κB is involved in Hcy induced renal podocyte iron death

3 討論

腎功能的損害已影響了全世界超過10%的人口，大多數(shù)腎臟疾病的特征是腎小球?yàn)V過屏障的破壞。而足細(xì)胞是構(gòu)成腎臟濾過屏障的主要部分，其受損破壞了腎小球?yàn)V過屏障的完整性，進(jìn)而引起蛋白尿和腎臟損害。HHcy 已被認(rèn)為是ESRD進(jìn)展和與ESRD 相關(guān)的心血管并發(fā)癥發(fā)展的獨(dú)立危險因素［3-4］。有研究［16］報道，在ESRD 患者中，發(fā)生HHcy 的概率高達(dá)85% ～ 100%。課題組前期已經(jīng)證實(shí)HHcy 會造成腎小球足細(xì)胞損傷［6-7］，但Hcy在腎臟疾病中的復(fù)雜機(jī)制尚未被完全闡明。因此，本研究旨在探討Hcy 誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞的損傷機(jī)制并尋求新的治療靶點(diǎn)來緩解腎臟疾病的進(jìn)展。

HHcy 最初被報道為動脈粥樣硬化的危險因素［17］。后來，大量的流行病學(xué)和臨床病例對照研究［18-19］發(fā)現(xiàn)血漿Hcy 水平與心血管疾病之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。有學(xué)者回顧此類研究發(fā)現(xiàn)腎臟病患者血清肌酐和Hcy 濃度之間也存在明顯的正相關(guān)［20］。雖然很多證據(jù)提示HHcy 與CKD 致病機(jī)制密切相關(guān)，但是其在CKD 發(fā)生和發(fā)展中的作用總是缺少令人信服的證據(jù)。研究［21］顯示，HHcy可以直接作用于腎小球細(xì)胞，引起腎小球功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致ESRD，并且氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥等參與了Hcy 引起腎損害的過程，特別是氧化應(yīng)激越來越受到關(guān)注。已有研究［22］提示Hcy 主要通過觸發(fā)局部組織或細(xì)胞中的氧化應(yīng)激來參與足細(xì)胞的自噬與凋亡，但Hcy 誘導(dǎo)足細(xì)胞鐵死亡的方式至今未見相關(guān)報道。鐵死亡是一種鐵離子依賴性的氧化死亡方式，主要以細(xì)胞內(nèi)ROS 堆積，過度的氧化反應(yīng)和膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)為特征的非細(xì)胞凋亡形式的細(xì)胞死亡。目前研究表明，鐵死亡主要受Xc-系統(tǒng)以及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）調(diào)節(jié)［23］。其發(fā)生的主要原因是谷胱甘肽（GSH）合成減少以及GPX4 活性被抑制。GSH 是GPX4 發(fā)揮活性的關(guān)鍵輔助因子，而半胱氨酸是GSH 合成的重要原料，主要來源于Hcy 代謝。如果GPX4 的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞對鐵死亡更敏感；而GPX4 的功能活性與Hcy 代謝密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用80 μmol/L Hcy 刺激腎小球足細(xì)胞48 h 后，檢測發(fā)現(xiàn)SLC7A11、GPX4 表達(dá)下調(diào)，這提示Hcy 可以引起足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。而MDA 是脂質(zhì)的最終過氧化產(chǎn)物，它的表達(dá)量能夠反映機(jī)體內(nèi)ROS的含量，是機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的一個重要指標(biāo)。于是我們通過檢測兩組間MDA 水平發(fā)現(xiàn)Hcy 組MDA 水平較對照組明顯增加。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Hcy 可能通過觸發(fā)氧化應(yīng)激引起ROS 累積，進(jìn)而誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

TRPC6 是一種Ca2+滲透性陽離子通道，它是構(gòu)成腎臟足細(xì)胞裂隙膜結(jié)構(gòu)的重要蛋白之一，并且在維持腎小球基底膜正常濾過功能中發(fā)揮重要作用［8］。該通道已被證明是腎臟疾病期間足細(xì)胞消耗的主要參與者［24-26］。REISER 等［25］研究表明，TRPC6 在遺傳性腎小球硬化、微小病變及膜性腎臟疾病中的表達(dá)明顯升高。另有報道［26］稱TRPC6高表達(dá)導(dǎo)致大鼠足細(xì)胞損傷及蛋白尿增加。以上證據(jù)表明TRPC6 在足細(xì)胞損傷中起著關(guān)鍵作用。因此抑制TRPC6 的表達(dá)水平可能會成為未來有效保護(hù)足細(xì)胞的重要方法。然而，TRPC6 在Hcy 致足細(xì)胞鐵死亡中的作用及機(jī)制目前尚不清楚。據(jù)研究［27］發(fā)現(xiàn)，TRPC6 是一個氧化還原敏感通道，它是ROS 致腎臟損害的新靶點(diǎn)［28］，其作用機(jī)制與Ca2+內(nèi)流引起腎功能損害密切相關(guān)。在動物模型和人類受試者中，ROS 的過量產(chǎn)生和TRPC6 通道的功能障礙都與腎損傷有關(guān)［28-30］。有文獻(xiàn)報道TRPC6 敲低后，ROS 和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平均降低，且可減少腎性蛋白尿［29］；且越來越多的證據(jù)表明，TRPC6 在足細(xì)胞中的表達(dá)和功能受到ROS 的控制［29-30］。筆者推測TRPC6 可能參與了Hcy 誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的過程，為驗(yàn)證這一假說，本研究檢測了 TRPC6 在Control 組和Hcy 組的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與Control 組比較，Hcy 組TRPC6 蛋白及mRNA 呈現(xiàn)高表達(dá)，提示Hcy上調(diào)了TRPC6的表達(dá)。進(jìn)而我們通過Xc-系統(tǒng)-GPX4軸探討TRPC6 在Hcy 誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了3 個TRPC6 的干擾片段并轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，我們選擇了干擾效率最好的si-TRPC6-3 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；在Hcy 刺激的同時加入TRPC6 干擾片段，Western blot 結(jié)果顯示si-TRPC6+Hcy 組較si-NC+Hcy 組比較，鐵死亡相關(guān)蛋白SLC7A11 和GPX4 表達(dá)增加，凋亡率下降，而與Hcy 組比較，轉(zhuǎn)染陰性對照組對誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡率及鐵死亡相關(guān)蛋白無明顯影響。以上研究提示，干預(yù)TRPC6 可減輕Hcy 引起的足細(xì)胞鐵死亡。此外，NFκB 是機(jī)體炎性反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路，有文獻(xiàn)［31］報道TRPC6可調(diào)節(jié)NF-κB 信號來增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡；另有學(xué)者［32］報道了NF-κB 可能參與了腎損傷。故我們檢測了Hcy 組NF-κB 蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示，較對照組相比，Hcy 組NF-κB 蛋白表達(dá)增加；干擾TRPC6 后NF-κB 表達(dá)降低，表明在Hcy 誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的過程中，TRPC6 可能具有調(diào)控NF-κB 的作用。MA 等人［28］通過系統(tǒng)性綜述TRPC6 在糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷的作用時，也證實(shí)了這一結(jié)果；他發(fā)現(xiàn)線粒體ROS 能增加NFκB 的活化，NF-κB 可促進(jìn)TRPC6 的表達(dá)，而TRPC6 升高則又加劇Ca2+超載，正反饋性加重腎小球足細(xì)胞的損傷。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了Hcy 可能通過觸發(fā)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，并證明了TRPC6/NF-κB 參與了Hcy 誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞鐵死亡這一過程。這些發(fā)現(xiàn)可能為臨床防治Hcy 導(dǎo)致的腎臟損傷提供新的藥物作用靶點(diǎn)和新的治療思路，并有助于我們進(jìn)一步闡明CKD 的發(fā)病機(jī)制。另外，ROS 調(diào)控TRPC6 介導(dǎo)的Ca2+信號仍需進(jìn)一步的研究來確定潛在的分子機(jī)制，希望ROS/TRPC6 通路將為CKD 的治療提供新的治療策略。

【Author contributions】LI Xiaoqin made experimental operation，data collation ， statistical analysis and paper writing. WANG Lexing made study guidance and paper revision. MA Xiaojun and LI Na made proofreading of data and articles. LU Guanjun， ZHANG Zhihan and ZHANG Pengcheng designed the project. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.