魏丕喜 鄧玉 趙彩玲 徐柳 張敏

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院（濟南 271199）

宮頸癌（cervical cancer， CA）以侵襲性細胞生長和轉(zhuǎn)移為特征，發(fā)病率逐年上升［1］。在過去的幾十年里，得益于HPV 疫苗接種和篩查策略的結(jié)合，CA 的發(fā)病率和病死率在世界大部分地區(qū)都有所下降［2-3］。但是，由于腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，晚期CA的生存率仍然很低［4-5］。因此，研究CA 發(fā)生發(fā)展的分子機制，可靠有效的分子標志物，以及更有效的方法來阻礙和控制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和增殖，促進腫瘤細胞的凋亡是至關(guān)重要的。WD40 重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白在人類蛋白質(zhì)組中廣泛表達，并在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷感知與修復(fù)、細胞凋亡、細胞生長與分裂、表觀遺傳調(diào)控、免疫調(diào)控以及不同疾病的發(fā)生與維持等多種生物活動中發(fā)揮著重要作用［6］。WD 重復(fù)域蛋白5（WD repeat-containing protein 5，WDR5）是WD40 蛋白家族的成員，不僅在脊椎動物的發(fā)育中起著重要作用，而且在多器官腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起著重要作用［7］。但WDR5 在CA 進展中的機制尚不明確。本研究通過對CA 組織中WDR5 水平的測定，探討其與臨床病理特征的關(guān)系，為CA 臨床中的研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象納入2018 年1 月至2020 年3 月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院接收的CA 患者（105 例）為研究對象，收集新鮮CA 組織標本和非癌癥的鄰近宮頸組織樣本（距離腫瘤邊緣＞ 5 cm），并由有經(jīng)驗的婦科病理學(xué)家診斷。所有臨床病理診斷均由兩名病理學(xué)家根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）分類指南確認。納入標準：（1）均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；（2）術(shù)前所有入組患者均未接受化療或放療；（3）患者均知情、同意。排除標準：（1）有子宮切除史、放療或化療史、免疫抑制劑史或其他腫瘤史；（2）嚴重的系統(tǒng)性疾病或精神疾病的患者；（3）臨床病歷不完整的；（4）妊娠期或哺乳期患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核（編號：JN2018091）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測WDR5表達CA組織切片在85 °C 的烤箱中水平和垂直烘烤60 min，然后脫蠟、脫苯、水化?？乖崛『螅昧姿猁}緩沖鹽水（phosphate-buffered saline， PBS）清洗3 次，在3%的H2O2溶液中孵化以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性后，將樣品與正常山羊血清孵化20 min，在室溫下阻斷非特異性結(jié)合。隨后，將樣品與WDR5抗體（貨號：CSB-PA097823，武漢益普生物科技有限公司）在4 ℃下孵育過夜。用PBS 清洗后，將樣品與二抗在室溫下孵育30 min，用3，3-二氨基鹽酸聯(lián)苯胺（DAB）和蘇木精進行染色。最后，用蓋玻片覆蓋進行顯微鏡觀察。

由兩位經(jīng)驗豐富的病理學(xué)家使用顯微鏡在隨機選擇的5 個代表性區(qū)域進行觀察。評分標準是基于染色強度和被染色細胞的百分比。表達分數(shù)按照以下公式計算：染色細胞的百分比分數(shù)（0，無染色；1，＜ 25 個陽性染色細胞；2，25% ～ 50%的陽性染色細胞；3，＞ 50%的陽性染色細胞）×染色強度得分（0，無染色；1，微弱；2，中等；3，強烈）。表達分數(shù)被分為陰性（0-2）或陽性（≥ 2）。最終得分是上述兩個指標的乘積?？偡郑?4 為陰性，總分在4 ～ 9 為陽性。

1.2.2 Western blot法檢測組織中WDR5水平使用組織蛋白提取試劑提取蛋白質(zhì)。蛋白濃度采用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：PC0020）測定。蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠分離并電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。膜在室溫下用5%的脫脂牛奶阻斷2 h，然后在4 ℃下用一級抗體孵育過夜：抗WDR5（1∶1 000，貨號：600-401-FY0，艾美捷科技有限公司），抗GAPDH（1∶1 000，貨號：ab8245，深圳海思安生物技術(shù)有限公司）。然后將膜與辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的二抗（貨號：ZB-2301，南京賽泓瑞生物科技有限公司）在室溫下孵育1 h，蛋白質(zhì)用ECL 化學(xué)發(fā)光法進行可視化，并用Image J進行量化。GAPDH被用作內(nèi)部對照，WDR5相對水平=目的蛋白/內(nèi)參灰度值。

1.3 預(yù)后隨訪患者均于治療后隨訪36 個月。第1 次隨訪在治療后1 個月進行，然后每3 個月進行1 次電話或門診聯(lián)系。記錄并計算患者的總生存率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用IBM SPSS Statistics 22.0 進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例（%）表示，采用χ2檢驗進行分析；計量資料以（±s）表示，兩組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性通過t檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier 法；患者預(yù)后影響因素通過Cox 回歸進行分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫進行驗證，發(fā)現(xiàn)WDR5 在CA 組織中表達升高（P＜ 0.05），見圖1A。WDR5 陽性表達患者的總生存期與陰性表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖1B。

圖1 數(shù)據(jù)庫分析CA 中WDR5 的表達及與總生存時間的關(guān)系Fig.1 Database analysis of WDR5 expression in cervical cancer and its relationship with overall survival time

2.2 CA 組織及癌旁組織WDR5 陽性表達率比較105 例CA 組織標本中，WDR5 的陽性表達率（WDR5 陽性例數(shù)/癌組織總例數(shù)）為68.57%（72/105）高于癌旁組織22.86%（24/105），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 44.211，P＜ 0.05），見圖2。

圖2 WDR5 在CA 組織及癌旁組織中的表達（過氧化物酶-抗過氧化物酶法，× 400）Fig.2 Expression of WDR5 in cervical and paracancer tissues （peroxide-antiperoxidase method × 400）

2.3 CA 組織及癌旁組織中WDR5 表達水平比較相較于癌旁組織（1.00 ± 0.11），WDR5 的表達量在CA 組織（4.66 ± 0.98）中較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =38.030，P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 WDR5 在CA 及癌旁組織中的表達Fig.3 The expression of WDR5 in CA and adjacent tissues

2.4 臨床病理特征WDR5 表達量與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜ 0.05），見表1。

表1 臨床病理特征Tab.1 Clinicopathological characteristics 例（%）

2.5 生存分析CA 患者3 年隨訪期間死亡28 例，無失訪病例。WDR5 陽性表達的生存率65.28%（47/72）低于陰性表達90.91%（30/33），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log rank χ2= 6.732，P= 0.009）。見圖4。

圖4 CA 組織中WDR5 陽性表達與陰性表達患者的生存曲線Fig.4 Survival curves of patients with positive and negative WDR5 expression in cervical cancer tissues

2.6 Cox 回歸分析經(jīng)多因素Cox 回歸分析，TNM 分期、WDR5、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05），見表2。

表2 Cox 回歸分析Tab.2 Cox regression analysis

3 討論

CA 發(fā)病率僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌［8］。據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計，CA 全球每年有超過50 萬例新發(fā)病例，每年造成約30 萬例死亡，其中85%發(fā)生在發(fā)展中國家，且發(fā)病率逐年增加，發(fā)病年齡逐年降低，嚴重影響婦女的生存質(zhì)量［9-11］。CA 的發(fā)生由社會因素、遺傳易感性因素、生理因素、生物學(xué)因素等多種因素共同引起的，是一個多階段、多步驟的復(fù)雜過程［12-13］。目前，手術(shù)聯(lián)合放化療是CA 治療的重要手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)仍是CA患者預(yù)后不良的重要原因［14-16］。腫瘤細胞的局部侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤進展的重要途徑。然而，目前臨床對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制的認識仍十分有限，進一步闡明腫瘤細胞的靶向調(diào)控機制將為CA 的治療提供新的方向［17］。因此，尋找與其關(guān)系密切的生物標志物十分重要。

WDR5 是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物SET1/MLL的一個重要組成部分，它主要催化組蛋白3 賴氨酸4 甲基化。組蛋白3 賴氨酸4 甲基化是最重要的表觀遺傳修飾之一，其主要功能是增強底物的轉(zhuǎn)錄和表達［18］。WDR5 已被發(fā)現(xiàn)在胰腺導(dǎo)管腺癌、肺腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膽管癌、乳腺癌等多種實體腫瘤中過表達，促進腫瘤發(fā)生［19-22］。此外，更多的證據(jù)表明，WDR5 除了調(diào)節(jié)組蛋白3 賴氨酸4 甲基化外，還可以促進基因轉(zhuǎn)錄，例如與原癌基因（C-myc）結(jié)合從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［23］。C-myc 是一種眾所周知的腫瘤驅(qū)動癌蛋白，在超過一半的人類惡性腫瘤中過表達。據(jù)估計，多達1/3 的癌癥死亡歸因于異常的c-Myc 表達，包括CA［24］。研究［25］顯示，WDR5 通過與c-Myc 的直接相互作用增強c-Myc 在染色體上的招募，從而促進了膽管癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。因此，推測WDR5 在CA 的發(fā)展過程中也扮演重要角色。

與既往研究結(jié)果一致［26］，本研究中WDR5 水平在CA 組織中較高。且其與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)，上述結(jié)果表明，WDR5 在CA中顯示出促進腫瘤的作用，WDR5 在細胞增殖、腫瘤發(fā)生和惡性進展中起著重要作用，提示W(wǎng)DR5可作為重要的癌基因和新的CA 生物標志物。推測其作用機制可能是WDR5 通過與c-Myc 互相作用，促進CA 細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等，從而影響CA 的發(fā)展進程，但其在CA 疾病中的具體作用機制尚需進一步完善實驗方案進行深入研究。WDR5 陽性表達的3 年生存率較低，這一觀察結(jié)果表明，WDR5 可能是CA 患者有希望的預(yù)后生物標志物，控制WDR5 表達可能是CA 治療的一個有前途的靶點。本研究中TNM 分期、WDR5、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是患者預(yù)后的影響因素，進一步證明WDR5 作為癌基因發(fā)揮作用，影響腫瘤患者的預(yù)后和生存。因此，它可以作為癌癥患者精準治療的潛在靶點。這些數(shù)據(jù)也表明WDR5 是一種新的CA 預(yù)后生物標志物。

綜上所述，WDR5 在CA 組織中的表達高于鄰近正常組織，WDR5 的上調(diào)與某些臨床特征和較差的生存率相關(guān)?？傊?，本研究結(jié)果表明，WDR5在CA 中充當致癌基因，因此有可能作為診斷和預(yù)后的生物標志物以及治療靶點。但本次研究樣本量有限，且為單中心研究。未來，將開展分子及細胞研究，全面分析WDR5 在CA 中的作用機制，進一步探索和明確其作用機制。

【Author contributions】WEI Pixi performed the experiments and wrote the article. DENG Yu performed the experiments. ZHAO Cailing and XU Liu revised the article. ZHANG Min designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.