張永珍 王珊珊 趙海靈 徐麗偉

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院）1檢驗科，2婦瘤科 （河南新鄉(xiāng) 453000）；3河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（河南開封 475000）

宮頸癌是女性相關(guān)癌癥死亡的主要原因之一，與宮頸癌發(fā)展相關(guān)的風(fēng)險因素包括高危人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus， hrHPV）感染、年齡、吸煙、分娩、口服避孕藥和飲食，其中持續(xù)感染hrHPV 是宮頸癌的主要危險因素［1-2］。目前早期宮頸癌患者主要采用手術(shù)治療，晚期患者為綜合治療，但部分患者預(yù)后較差、復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致臨床治療效果不佳［3］。宮頸癌的早期診斷可降低發(fā)病率和病死率，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查、HPV 檢測為主要檢測手段，但檢測較為麻煩，且特異度或靈敏度不高［4］。因此，尋找更簡單、更方便的檢測方法，如血清腫瘤標(biāo)志物檢測，對早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌，以改善宮頸癌的診斷和治療至關(guān)重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是20 ～ 22 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在生物過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，通過負(fù)向介導(dǎo)其靶基因調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化過程，有研究［5-6］表明具有致癌和腫瘤抑制功能的miRNA 參與包括宮頸癌在內(nèi)的癌癥的形成和進(jìn)展。已經(jīng)確定宮頸癌的多種miRNA 標(biāo)志物，miR-651 是一種癌癥相關(guān)miRNA，研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-651 抑制可以抑制宮頸癌的耐藥性，可能作為宮頸癌的治療劑［7］。miR-630 參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，研究［8］表明，miR-630在宮頸癌中低表達(dá)，與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。miR-651、miR-630均可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但二者在宮頸癌中的進(jìn)展及預(yù)后中的臨床價值鮮見報道。因此本研究通過檢測miR-651、miR-630 的水平變化，為臨床評估宮頸癌的進(jìn)展和預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017 年6 月至2020 年5 月入院治療的宮頸癌患者108 例為宮頸癌組，年齡36 ～ 72歲，平均（44.82 ± 5.61）歲，其中＜ 50歲49例，≥ 50 歲59 例；HPV 感染者70 例，無HPV 感染者38 例；FIGO 宮頸癌分期：Ⅰ-Ⅱ期61 例、Ⅲ-Ⅳ期47 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42 例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66 例；分化程度：低分化32 例，中高分化76 例；腫瘤直徑＜ 4 cm 者43 例、≥ 4 cm 者65 例。另選取在我院治療的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）患者100 例為CIN組，年齡33 ～ 70 歲，平均（45.63 ± 5.38）歲，以及同期在我院健康體檢者110 例為對照組，年齡33 ～75 歲，平均（43.95 ± 5.44）歲。3 組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)診斷為宮頸癌患者，且符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)［9］；（2）術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他嚴(yán)重疾病如免疫系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的婦女；（2）依從性差的婦女；（3）孕婦或哺乳期婦女；（4）合并其他宮頸疾病者；（5）既往腫瘤病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過（編號：2017032），研究對象及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清收集采集研究對象靜空腹脈血5 mL，離心分離出上清，保存于-80 ℃。

1.2.2 實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR， qRT-PCR）檢測血清miR-651、miR-630 水平使用TRIzol 試劑盒（美國Sigma 公司）提取血清中總RNA，對RNA 濃度定量后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）得到cDNA，隨后使用miRcute Plus miRNA qPCR Kit（北京天根生化科技有限公司）在ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）中進(jìn)行基因表達(dá)定量分析。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。miR-651、miR-630 以U6 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-651、miR-630 相對表達(dá)量。所有引物由上海生工公司合成。引物序列如下：miR-651：正向引物：5'-TGGGTAAAGTGCTTATAGTGC-3'，反向引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；miR-630：正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAGTATTCTGTACCA-3'，反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6：正向引物：5'-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3'，反向引物：5'-TGACGCTTGCCCAGCCTT-3'。

1.2.3 隨訪術(shù)后對所有患者進(jìn)行為期36 個月的隨訪，隨訪截止至2023 年5 月或患者死亡，以電話或復(fù)查形式記錄患者預(yù)后情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用例表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗；用（±s）表示計量資料，兩組間采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson 法。生存分析采用Kaplan-Meier 法。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組血清miR-651、miR-630 表達(dá)比較相比于對照組，宮頸癌組、CIN 組患者血清miR-651、miR-630 表達(dá)顯著下降（P＜ 0.05），相比于CIN 組，宮頸癌組患者血清miR-651、miR-630 表達(dá)顯著下降（P＜ 0.05）。見表1。

表1 3 組血清miR-651、miR-630 表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-651 and miR-630 expression in three groups ±s

表1 3 組血清miR-651、miR-630 表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-651 and miR-630 expression in three groups ±s

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與CIN組相比，#P ＜ 0.05

組別宮頸癌組CIN組對照組F值P值例數(shù)108 100 110--miR-651 0.32 ± 0.10*#0.68 ± 0.21*1.00 ± 0.32 239.305＜ 0.001 miR-630 0.41 ± 0.12*#0.73 ± 0.22*1.02 ± 0.34 168.773＜ 0.001

2.2 宮頸癌患者血清miR-651 與miR-630 表達(dá)相關(guān)性分析根據(jù)Pearson 相關(guān)性分析，血清miR-651與miR-630 呈正相關(guān)（r= 0.660，P＜ 0.05）。

2.3 宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達(dá)與HPV 感染、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期有關(guān)（P＜ 0.05），其中有HPV 感染、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期的宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達(dá)水平顯著低于無HPV 感染、中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期的患者（P＜ 0.05）；而與年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞ 0.05）。見表2。

表2 宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between serum miR-651， miR-630 expression and clinical features in patients with cervical cancer ±s

表2 宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between serum miR-651， miR-630 expression and clinical features in patients with cervical cancer ±s

臨床病理特征年齡＜ 50歲≥ 50歲HPV感染有無FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無分化程度低分化中高分化腫瘤大?。?4 cm≥ 4 cm例數(shù)49 59 70 38 61 47 42 66 32 76 43 65 miR-651相對表達(dá)量0.31 ± 0.10 0.33 ± 0.09 0.29 ± 0.06 0.38 ± 0.10 0.36 ± 0.08 0.27 ± 0.04 0.28 ± 0.06 0.35 ± 0.08 0.27 ± 0.06 0.34 ± 0.07 0.31 ± 0.05 0.33 ± 0.07 t值1.093 5.848 7.058 4.864 4.941 1.619 P值0.277＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 0.108 miR-630相對表達(dá)量0.40 ± 0.11 0.42 ± 0.12 0.35 ± 0.08 0.52 ± 0.14 0.45 ± 0.12 0.36 ± 0.10 0.34 ± 0.09 0.45 ± 0.13 0.33 ± 0.08 0.44 ± 0.09 0.40 ± 0.10 0.42 ± 0.12 t值0.895 8.041 4.149 4.797 5.987 0.904 P值0.373＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 0.368

2.4 血清miR-651、miR-630 表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系對所有的宮頸癌患者隨訪36 個月，108 例宮頸癌患者69 例生存，39 例死亡，總生存率為63.89%。分別以宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 相對表達(dá)量中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分為miR-651高表達(dá)患者54 例，miR-651 低表達(dá)患者54 例，miR-630 高表達(dá)患者54 例，miR-630 低表達(dá)患者54例。miR-651低表達(dá)患者總生存率（26/54，48.15%）明顯低于miR-651 高表達(dá)患者（43/54，79.63%）（χ2= 11.599，P= 0.001），miR-630 低表達(dá)總生存率（24/54，44.44%）明顯低于miR-630 高表達(dá)患者（45/54，83.33%）（χ2= 17.699，P＜ 0.001）。見圖1、2。

圖1 血清miR-651 表達(dá)與宮頸癌患者生存率的關(guān)系Fig.1 Relationship between serum miR-651 expression and survival of patients with cervical cancer

圖2 血清miR-630 表達(dá)與宮頸癌患者生存率的關(guān)系Fig.2 Relationship between serum miR-630 expression and survival of patients with cervical cancer

2.5 Cox 回歸分析影響宮頸癌患者預(yù)后的危險因素以宮頸癌患者生存情況（存活=0，死亡=1）為因變量，以HPV 感染（有=1，無=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=1，無=0）、FIGO 分期（Ⅰ-Ⅱ期=0、Ⅲ-Ⅳ期=1）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、miR-651（低表達(dá)=1，高表達(dá)=0）、miR-630（低表達(dá)=1，高表達(dá)=0）進(jìn)行Cox 生存回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV 感染、低分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期為Ⅲ-Ⅳ期、miR-651 低表達(dá)、miR-630 低表達(dá)，為宮頸癌患者預(yù)后的危險因素（P＜ 0.05）。見表3。

表3 Cox 回歸分析影響宮頸癌患者預(yù)后的危險因素Tab.3 Cox regression analysis of the risk factors affecting the prognosis of patients with cervical cancer

3 討論

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特性，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)病率和死亡率都很高，尤其是晚期患者5年生存率低于40%［10］。由于早期宮頸癌無明顯臨床癥狀，當(dāng)患者因陰道異常出血、盆腔疼痛或性交困難而確診時已處于晚期，且經(jīng)常伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，臨床干預(yù)手段有限，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。近些年從多方面對宮頸癌進(jìn)行診斷治療，推行宮頸癌篩查計劃，廣泛使用HPV 疫苗，放療技術(shù)的進(jìn)步也使宮頸癌治療相關(guān)毒性降低，但受復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的影響其發(fā)病率和病死率在一直上升。研究［11］發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的長期生存與腫瘤診斷時的臨床分期、分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，雖然遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO 分期可以預(yù)測宮頸癌患者的臨床結(jié)果，但它們可能不足以評估患者預(yù)后。因此，尋找更靈敏的早期診斷生物標(biāo)志物和更有效、更安全的治療方法，對宮頸癌的防治和預(yù)后都有重要意義。

miRNA 作為廣泛研究的腫瘤標(biāo)志物，是癌基因、腫瘤抑制因子或調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生途徑的重要組成部分，在腫瘤中異常表達(dá)，通過上調(diào)癌基因或下調(diào)腫瘤抑制因子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、周期進(jìn)程、凋亡，還與癌癥病因、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)［12-13］。miRNA失調(diào)影響宮頸癌疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移甚至預(yù)后，其中血清miRNA 較穩(wěn)定可作為宮頸癌早期診斷和預(yù)后的生物指標(biāo)［14］。miR-651 作為miRNA 家族的一員，在不同癌癥類型中充當(dāng)腫瘤抑制因子。研究［15］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-651-5p 通過靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白2 抑制紫外線輻射誘導(dǎo)的皮脂腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。miR-651-3p 在肝癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，可通過靶向自噬相關(guān)蛋白3（autophagy-related 3，ATG3）調(diào)節(jié)自噬，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對順鉑的敏感性［16］。還有研究［17］發(fā)現(xiàn)，miR-651-3p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中顯著下調(diào)，通過負(fù)向調(diào)節(jié)特異性蛋白2 表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生成形成，發(fā)揮腫瘤抑制基因作用。miR-651 在宮頸癌中也發(fā)揮重要作用，過表達(dá)miR-651 可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡并削弱增殖［7］。本研究顯示，宮頸癌患者血清中miR-651 表達(dá)水平顯著低于CIN 組、對照組，表明miR-651 參與宮頸癌的發(fā)病。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-651 表達(dá)水平與HPV 感染、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期有關(guān)。說明miR-651 低表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系?？赡苁怯捎趍iR-651 在宮頸癌中發(fā)揮抑癌功能，靶向負(fù)調(diào)節(jié)ATG3 進(jìn)而抑制ATG3 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖侵襲能力，促進(jìn)凋亡。因此，宮頸癌中miR-651 表達(dá)下降，導(dǎo)致其對ATG3 的抑制能力減弱，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性行為。

miR-630 是位于15q24.1 上的MIR630 基因，主要與免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)有關(guān)，在癌癥中發(fā)揮重要作用。miR-630 在不同癌癥類型中充當(dāng)癌基因或腫瘤抑制因子，miR-630 在非小細(xì)胞肺癌中下調(diào)，其模擬物抑制細(xì)胞遷移、侵襲和增殖，促進(jìn)凋亡［18］。miR-630 還在食管癌中低表達(dá)，其過表達(dá)可減少食管癌細(xì)胞侵襲和遷移［19］。研究［20］發(fā)現(xiàn)，miR-630 參與宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，可能作為宮頸癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點。還有研究［8］發(fā)現(xiàn)，miR-630 在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)降低，其通過靶向YES 相關(guān)蛋白1（Yes associated protein 1，YAP1）參與宮頸癌胞的增殖和遷移。本研究顯示，宮頸癌患者血清中miR-630 的表達(dá)水平顯著低于CIN 組、對照組，表明miR-630 參與宮頸癌發(fā)病。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清miR-630與有HPV 感染、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期Ⅲ-Ⅳ期顯著相關(guān)。說明miR-630 低表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。可能是由于在宮頸癌中miR-630 通過調(diào)節(jié)其靶基因YAP1，抑制YAP1的上調(diào)，進(jìn)而抑制其對腫瘤侵襲、遷移和發(fā)生的促進(jìn)作用。因此，在宮頸癌中miR-651 表達(dá)下降促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Pearson 相關(guān)性分析顯示，宮頸癌患者血清miR-651 與miR-630 呈正相關(guān)，表明二者共同調(diào)節(jié)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究Kaplan-Meier 生存曲線顯示，miR-651、miR-630 低表達(dá)患者3 年總生存率低于高表達(dá)患者，當(dāng)miR-651、miR-630 同時下調(diào)時，宮頸癌的預(yù)后生存更差。進(jìn)一步多因素Cox 回歸分析表明，miR-651、miR-630 低表達(dá)是影響宮頸癌患者不良預(yù)后的危險因素，表明宮頸癌不良預(yù)后與miR-651、miR-630 低表達(dá)有關(guān)，推測兩者表達(dá)可作為判斷宮頸癌者預(yù)后的標(biāo)志物，用于臨床輔助工作。

綜上所述，宮頸癌患者血清miR-651、miR-630水平降低，兩者與HPV 感染、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期及預(yù)后有關(guān)。然而miR-651、miR-630 在宮頸癌中發(fā)生發(fā)展的具體調(diào)控機(jī)制為深入探究，后續(xù)將增加動物實驗繼續(xù)研究。

【Author contributions】ZHANG Yongzhen performed the experiments and wrote the article. WANG Shanshan performed the experiments. ZHAO Hailing revised the article.XU Liwei designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.