李萍 湯拓 鄭皚雪 張魯平 王濤 洪鮮 鄧志會

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院 （黑龍江齊齊哈爾 161006）

DNA 復(fù)制是一個受到精確調(diào)控的生命過程，以確保真核生物每個細(xì)胞周期只發(fā)生一次復(fù)制，維持基因組的穩(wěn)定［1］。微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance，MCMs）是AAA + ATP酶蛋白超級家族成員，在真核生物中由MCM2-7六個蛋白組成復(fù)合物，發(fā)揮DNA 解旋酶作用，參與DNA復(fù)制的起始和延伸［2］。在M期晚期和G1期，在CDC6（cell division cycle 6）和CDT1（chromatin licensing and DNA replication factor 1）的協(xié)助下，MCM2-7 被招募到復(fù)制起點，形成復(fù)制前復(fù)合物（pre-replicative complex，pre-RC）［3］。但是，這時MCMs 還沒有DNA 解旋酶活性，為非激活狀態(tài)。隨著細(xì)胞周期進(jìn)入S 期，在DDK（Dbf4-dependent kinase）和CDK（cyclin dependent kinase）兩個重要激酶作用下，CDC6 和CDT1 從pre-RC 中釋放，CDC45 和GINS 加載到MCM2-7 中形成活化的DNA解旋酶復(fù)合物（CMG 復(fù)合物），解開DNA 的雙螺旋鏈，啟動DNA 復(fù)制［4］。

異常的DNA 復(fù)制導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，誘發(fā)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。MCM2 作為真核生物中DNA 解螺旋酶的核心成員，在DNA 復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究顯示，MCM2 可作為腫瘤的生物標(biāo)記物，在多種類型的惡性腫瘤中檢查出高表達(dá)，包括宮頸癌［6-7］、乳腺癌［8］、直腸癌［9］、肝癌［10］等。此外，MCM2 也被認(rèn)為是腫瘤預(yù)后、化療藥物反應(yīng)性的一種靈敏的生物標(biāo)記物［11］。

宮頸癌是威脅全球女性健康的惡性腫瘤之一，晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者的治療方案有限，治療效果甚微，且易復(fù)發(fā)［12］。目前，關(guān)于MCM2在宮頸癌中的生物學(xué)功能研究較少。CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）系統(tǒng)是一種高效的基因編輯技術(shù)，通過sgRNA（single-guide RNA）介導(dǎo)Cas9 蛋白對基因組DNA 進(jìn)行特異性雙鏈切割，斷裂的DNA 隨機修復(fù)造成目的基因堿基片段缺失，實現(xiàn)穩(wěn)定的基因敲除［13］。本研究以人宮頸癌HeLa 細(xì)胞為模型，通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立誘導(dǎo)性敲除MCM2 基因的細(xì)胞系，探討MCM2 對HeLa 細(xì)胞DNA 復(fù)制及復(fù)制壓力的影響，為MCM2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展及藥物反應(yīng)性中的作用及調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑人宮頸癌HeLa 細(xì)胞和人胚胎腎細(xì)胞HEK293T 購買于國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺。DMEM 和鏈霉素青霉素購自Gibco；胎牛血清購自Clark Bioscience；轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）購自Polysciences；CCK-8 試劑購自Med Chem Express；總RNA 提取、質(zhì)粒小提、質(zhì)粒大提、Bradford 蛋白定量試劑盒購自天根生化科技有限公司，BeyoClickTMEdU-647 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生化科技有限公司；PowerUp? SYBR?Green Master Mix 購自ABI 公司；DNA 連接酶和BsmBI 內(nèi)切酶購自New England Biolabs；抗MCM2兔多克隆抗體購自Bethyl Laboratories；抗GAPDH 鼠單克隆抗體和抗MCM5 多克隆抗體購自Proteintech Group；抗MCM4兔多克隆抗體購自AssayGenie；抗MCM6 兔多克隆抗體、Alexa Fluor 568TM goat anti mouse lgG（H+L）和Hoechst33342 購自Thermo Fisher scientific；抗MCM3 和MCM7 鼠多克隆抗體及HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz；抗phospho-Histone H2A.X（Ser139）購自Millipore。碘化丙啶和羥基脲來自索萊寶科技有限公司，強力霉素來自阿拉丁，嘌呤霉素鹽酸鹽來自Gene Operation，引物合成及質(zhì)粒測序由上海生工生物工程有限公司完成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9 敲除系統(tǒng)TLCV2 sgRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建TLCV2質(zhì)粒購于Addgene（Addgene#87360），是在LentiCRISPR v2 基礎(chǔ)上進(jìn)一步修飾加上強力霉素誘導(dǎo)表達(dá)Cas9-2A-eGFP 的基因敲除系統(tǒng)［14］。通過UCSC Genome Browser 數(shù)據(jù)庫下載人源MCM2（ENST00000265056.12）的基因序列，選擇第2 外顯子作為敲除位點，利用E-CRISPR 在線工具（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/）在靶標(biāo)DNA區(qū)域中設(shè)計2 個sgRNA 序列；同時，設(shè)置隨機打亂、不靶向人類基因的Scramble-gRNA 序列作為陰性對照。在每條sgRNA 序列的正義鏈5′端添加CACCG，反義鏈5′端添加AAAC和3′端加上一個C，便于與酶切后的載體連接（表1）。將不同sgRNA的合成引物變性、退火后，使用T4 連接酶將其連接至BsmBI 酶切后純化的TLCV2 載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至stable3 感受態(tài)細(xì)胞，涂板篩選陽性克隆，小提質(zhì)粒送公司測序。

表1 sgRNA 寡核苷酸序列Tab.1 Oligonucleotide sequence of sgRNA

1.2.2 MCM2 誘導(dǎo)性基因敲除HeLa 細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定使用PEI 轉(zhuǎn)染試劑，將測序正確的帶有g(shù)RNA 序列的TLCV2 質(zhì)粒（Scramble 對照、MCM2.KO1和MCM2.KO2）分別與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G 共同轉(zhuǎn)染人HEK293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染3 h后更換為新鮮的完全DMEM 培養(yǎng)基，48 ～ 72 h 后收集病毒上清并用0.45 μm 濾器過濾，濾液分裝-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?shù)生長期的人HeLa 細(xì)胞接種到6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，往培養(yǎng)基中加入1 mL各組病毒溶液以及終濃度為8 μg/L 的polybrene。病毒感染24 h 后換成含2 mg/L 嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選，連續(xù)篩選8 d 后備用。將篩選后的細(xì)胞中加入終濃度1 μg/mL 的強力霉素誘導(dǎo)Cas9-gRNAeGFP 表達(dá)，48 h后用熒光顯微鏡檢測eGFP，72 h后利用Western blot 檢測MCM2 的表達(dá)，鑒定是否成功建立MCM2 基因敲除的細(xì)胞系。

1.2.3 Western blot 檢測細(xì)胞中MCM 蛋白的表達(dá)取強力霉素誘導(dǎo)后的3 組細(xì)胞：Scramble 對照組（Control）、MCM2 敲除1 組（MCM2 KO1）和敲除2 組（MCM2 KO2），用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取30 μg蛋白樣品，SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)PVDF 膜，4% BSA 室溫封閉30 min，經(jīng)過常規(guī)Western blot 操作，利用AI680 多功能成像系統(tǒng)（GE Healthcare）進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影。以GAPDH為內(nèi)參對照，觀察目的條帶的變化。

1.2.4 EdU 摻入實驗檢測DNA 合成利用Beyo-Click? EdU-647 細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測DNA 合成。取對數(shù)生長期的各組HeLa 細(xì)胞接種到6 孔板，待細(xì)胞融合度為70% ～ 80%左右加入終濃度為10 μmol/L 的EdU 作用2 h。接下來胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞固定、洗滌和通透，然后根據(jù)說明書進(jìn)行Click 反應(yīng)。最后，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的EdU 的熒光信號，并利用FlowJo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 Real-Time qPCR檢測DNA復(fù)制相關(guān)蛋白的表達(dá)取對數(shù)生長期的各組HeLa 細(xì)胞接種于6 孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度到達(dá)70% ～ 80%進(jìn)行總RNA 提取，并用微量分光光度計測量總RNA 濃度。取等量RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測目標(biāo)基因的mRNA 表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參，通過目的基因的CT 值，以2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列參照已發(fā)表文獻(xiàn)［15］。

1.2.6 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的各組HeLa 細(xì)胞系，利用Cellometer Mini 細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，以4 000 個細(xì)胞的濃度將細(xì)胞接種到96 孔板，每組3 個復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后，分別加入不同濃度的羥基脲誘導(dǎo)DNA 復(fù)制壓力，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入10 μL CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm波長檢測相應(yīng)的OD值，繪制增殖曲線。

1.2.7 微核形成實驗檢測基因組穩(wěn)定性將對數(shù)生長的各組細(xì)胞接種于24 孔板中，培養(yǎng)過夜，加入終濃度為2 mmol/L的HU作用48 h，利用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.15% Triton X-100 通透，Hoechst 33342 染細(xì)胞核，然后常規(guī)封片。采用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM-710）拍照，計算微核形成的比例。

1.2.8 免疫熒光γH2AX 染色檢測DNA 損傷修復(fù)取對數(shù)生長的各組細(xì)胞接種于圓形蓋玻片（直徑15 mm）上培養(yǎng)過夜，加入終濃度為2 mmol/L的HU 作用2 h，更換新鮮DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、封閉，用γH2AX 一抗孵育過夜，洗滌后用熒光標(biāo)記的二抗（Alexa Fluor 568TM goat anti mouse lgG （H+L）孵育1 h，洗滌后利用Hoechst 33342 染細(xì)胞核。采用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM-710）拍照，并利用Image J 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過Student′st檢驗分析組間差異，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)性MCM2 敲除HeLa 細(xì)胞系對構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行提取測序，測序結(jié)果顯示sgRNA 被成功插入空載質(zhì)粒（圖1A）。將測序正確的三組質(zhì)粒包裝成慢病毒顆粒，并感染HeLa 細(xì)胞，用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選后，再加入強力霉素誘導(dǎo)Cas9-gRNA-eGFP 的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，在強力霉素誘導(dǎo)48 h 后，在熒光顯微鏡下就能看到三組細(xì)胞表達(dá)較強的綠色熒光（圖1B），說明慢病毒已經(jīng)整合到細(xì)胞基因組，并成功誘導(dǎo)Cas9 和sgRNA 的表達(dá)。Western blot 結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，在強力霉素誘導(dǎo)后，兩個KO 組細(xì)胞中的MCM2 蛋白表達(dá)明顯降低（圖1C），證明誘導(dǎo)性MCM2基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建成功。同時，在MCM2 敲除的細(xì)胞中，MCM2-7 復(fù)合物的其他蛋白表達(dá)量也顯著降低，表明MCM2 對MCM2-7 復(fù)合物蛋白穩(wěn)定性至關(guān)重要（圖1D）。

圖1 MCM2 誘導(dǎo)性敲除細(xì)胞系的構(gòu)建Fig. 1 Establishment of MCM2 inducible knockout HeLa cell lines

2.2 MCM2 對細(xì)胞DNA 復(fù)制的影響通過EdU摻入實驗，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測DNA 合成。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，MCM2 敲除細(xì)胞EdU 陽性的細(xì)胞比例和EdU 的熒光強度顯著下降（圖2AC），說明MCM2 缺失導(dǎo)致細(xì)胞在正常情況下DNA復(fù)制能力下降，S 期細(xì)胞減少，提示引起細(xì)胞周期阻滯。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測EdU 摻入評價DNA 復(fù)制Fig.2 Flow cytometry detects DNA replication through EdU incorporation

2.3 MCM2 對DNA 復(fù)制相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)的影響研究顯示，MCM2-7 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)影響細(xì)胞周期進(jìn)程。qPCR 結(jié)果顯示：敲除MCM2顯著性地降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin A1、Cyclin E1、CDK4 的mRNA 表達(dá)，但是對Cyclin B1、Cyclin D1、p53、CDT1 和CDC6 的mRNA 表達(dá)沒有顯著影響（圖3）。這些結(jié)果說明，MCM2 可能通過調(diào)節(jié)部分細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，參與細(xì)胞周期進(jìn)程。

圖3 qPCR 檢測MCM2 敲除對HeLa 細(xì)胞DNA 復(fù)制相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 qPCR was used to examine the effect of MCM2 knockout on the mRNA expression of DNA replication related factors

2.4 MCM2 對復(fù)制壓力下細(xì)胞存活能力的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，在羥基脲誘導(dǎo)DNA復(fù)制壓力后，MCM2 敲除細(xì)胞的存活能力下降，在2 mmol/L的濃度下顯著低于對照細(xì)胞（圖4），說明MCM2 缺失增加了細(xì)胞對羥基脲的敏感性。

圖4 CCK-8 法檢測在復(fù)制壓力下MCM2 敲除對HeLa 細(xì)胞存活能力的影響Fig.4 CCK-8 assay was used to examine the effect of MCM2 knockout on cell viability under DNA replication stress

2.5 MCM2 對基因組穩(wěn)定性和DNA 損傷修復(fù)的影響精確的DNA 復(fù)制對于基因組的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。微核形成實驗顯示，MCM2 敲除后，細(xì)胞微核的比率明顯高于對照組（圖5A、B）。羥基脲誘導(dǎo)復(fù)制壓力后，各組細(xì)胞的微核數(shù)量明顯增多（圖5B），說明DNA 復(fù)制壓力導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。與對照細(xì)胞相比，MCM2 敲除細(xì)胞在羥基脲作用后微核的比例顯著增高（圖5B）。這些結(jié)果表明，MCM2 缺失造成正常條件下和DNA 復(fù)制壓力下的基因組不穩(wěn)定。

圖5 MCM2 敲除對基因組穩(wěn)定性和DNA 損傷修復(fù)的影響Fig.5 The effects of MCM2 knockout on genomic stability and DNA damage repair

DNA 損傷是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的重要因素。磷酸化的H2AX（γH2AX）是DNA 損傷的生物學(xué)標(biāo)記物，是評價DNA 損傷的常用方法。免疫熒光結(jié)果顯示，MCM2 敲除對細(xì)胞生理條件下γH2AX 的表達(dá)并沒有顯著影響，但是在羥基脲誘導(dǎo)DNA 復(fù)制壓力后，MCM2 敲除顯著增加細(xì)胞內(nèi)γH2AX 聚點（foci）數(shù)量（圖5C、D）。這些結(jié)果提示，在復(fù)制壓力下，MCM2 缺失導(dǎo)致DNA 損傷的積累，可能與細(xì)胞存活能力下降和基因組不穩(wěn)定性增加有關(guān)。

3 討論

MCM2-7 是細(xì)胞增殖的生物學(xué)標(biāo)志物，在多種類型腫瘤中過表達(dá)。多項研究［6-7，16］證實，MCM2在宮頸癌中高表達(dá)，并與臨床預(yù)后相關(guān)。為了進(jìn)一步探討MCM2 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，利用誘導(dǎo)性基因編輯系統(tǒng)具有的敲除時間可控、避免基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞死亡等優(yōu)勢，本研究成功地在宮頸癌HeLa 細(xì)胞中誘導(dǎo)性敲除MCM2 基因。結(jié)果顯示，敲除MCM2 顯著性地降低DNA 復(fù)制和細(xì)胞增殖能力；在復(fù)制壓力下，MCM2 敲除增加基因組不穩(wěn)定性，降低細(xì)胞的存活和DNA 損傷修復(fù)能力。

MCM2 是MCM2-7 復(fù)合物中的重要成員，在DNA 復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在G1/S 期，染色質(zhì)結(jié)合的MCM2 被DDK 磷酸化，增強MCM2-7 復(fù)合物的ATP 酶活性，對DNA 復(fù)制的起始發(fā)揮至關(guān)重要的作用［17］。研究表明，MCM2-7 復(fù)合物通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌細(xì)胞中，沉默MCM2 可降低部分細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［18-19］。此外，瞬時敲低MCM3、MCM6 和MCM7 也發(fā)現(xiàn)降低細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除MCM2 使HeLa 細(xì)胞中Cyclin A1、Cyclin E1 和CDK4 的mRNA 表達(dá)下降，提示MCM2 可能通過影響部分細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖而參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

在多種惡性腫瘤中，MCM2 也被用于預(yù)測抗腫瘤藥物的反應(yīng)性。研究顯示，低表達(dá)MCM2 的小細(xì)胞肺癌患者對抗程序性死亡受體1（PD-1）和順鉑的治療更敏感［23］。同時，與對照細(xì)胞比較，沉默MCM2 增加小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性［24］。此外，在卵巢癌A2780 細(xì)胞中下調(diào)MCM2 表達(dá)，能夠增加細(xì)胞對卡波鉑的反應(yīng)性［25］。這些結(jié)果提示，MCM2 是一種化療反應(yīng)性的預(yù)測標(biāo)記物。本研究顯示，MCM2 敲除降低羥基脲作用后DNA 損傷修復(fù)的效率，增加宮頸癌HeLa 細(xì)胞對羥基脲的敏感性。羥基脲通過抑制DNA 合成發(fā)揮抗腫瘤作用，在臨床上用于性粒細(xì)胞白血病、黑色素瘤、腎癌、頭頸部等惡性腫瘤的治療。本研究提示MCM2 在臨床上預(yù)測宮頸癌對化療藥物敏感性上可能具有潛在的應(yīng)用價值。

綜上所述，MCM2 促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞的DNA 復(fù)制和細(xì)胞增殖能力，并在復(fù)制壓力下維持DNA 損傷修復(fù)能力和基因組穩(wěn)定性、增強細(xì)胞存活能力，提示MCM2 有望成為宮頸癌診斷和治療的潛在靶點。實驗尚存在不足之處：（1）未在其他類型的宮頸癌細(xì)胞中驗證本研究結(jié)果；（2）沒有檢測MCM2 對鉑類等化療藥物的敏感性。因此，下一步的工作重點將針對這些不足，進(jìn)一步探討MCM2 在宮頸癌中對化療藥物反應(yīng)性的影響。

【Author contributions】LI Ping， TANG Tuo， ZHENG Aixue，ZHANG Luping and WANG Tao performed the experiments and analyzed the results. HONG Xian and DENG Zhihui conceived and designed the study. LI Ping， HONG Xian and DENG Zhihui wrote and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.