姚元勇，張 萌，陳仕學(xué)

（銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，銅仁市中藥民族藥現(xiàn)代化研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 銅仁 554300）

高尿酸血癥作為常見的代謝性疾病之一，是引發(fā)多種潛在疾病的重要因素，如痛風(fēng)、高血壓、慢性腎病等［1-3］。目前，高尿酸血癥的發(fā)生機(jī)制已相對(duì)明確，主要?dú)w因于人體內(nèi)的黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD） 的生物催化作用。XOD 是一種專一性不高的黃素蛋白酶，廣泛存在于生物體內(nèi)，可有效催化黃嘌呤 （Xan） 或次黃嘌呤（Hxan），生成尿酸，且伴隨著超氧陰離子（O2.-） 的生成［4］。因此，在針對(duì)治療高尿酸血癥醫(yī)藥研發(fā)方面，抑制XOD 生物活性與O2.-的清除成為研究者們的關(guān)注焦點(diǎn)之一［5-7］。

二氫楊梅素是一種雙手性、富電子體系的多酚類化合物，主要存在于顯齒蛇葡萄科藤本植物葉中，含量高達(dá)25%以上［8］。近年來，有關(guān)天然黃酮類化合物抑制XOD 生物活性的研究報(bào)道屢見不鮮，如2011 年，陳君課題組［9］報(bào)道了金銀花中的黃酮類成分槲皮素和木犀草素對(duì)體外XOD具有較強(qiáng)的抑制作用。隨后，張晶等［10］報(bào)道了多種黃酮類化合物單體，在體外XOD 生物活性抑制評(píng)價(jià)過程中，發(fā)現(xiàn)木犀草素、槲皮素、芹菜素和山柰酚均對(duì)XOD 具有較強(qiáng)的抑制作用，其中木犀草素IC50值為42.02 μmol/L，遠(yuǎn)小于別嘌呤醇（126.57 μmol/L）。

然而，有關(guān)天然手性小分子黃酮醇類化合物抑制XOD的研究工作報(bào)道相對(duì)較少，且作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)以天然手性小分子黃酮醇類化合物--二氫楊梅素為研究對(duì)象，通過XOD 體外模型構(gòu)建評(píng)價(jià)二氫楊梅素的抑制作用，再結(jié)合課題組前期有關(guān)二氫楊梅素的基礎(chǔ)研究［11-14］，分析二氫楊梅素抑制XOD 生物活性的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 UV-759S 型紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)儀器有限公司）； YQ-020A 型超聲清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）； FA124 型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑 黃嘌呤氧化酶（9.6 U/mg）、尿酸、黃嘌呤（分析純，上海源葉生物科技有限公司）； EDTA、磷酸、別嘌呤醇（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。焦磷酸鈉緩沖溶液 （0.1 mol/L） 為自制。水為二次蒸餾水。

2 方法

2.1 溶液配制 0.1 mol/L 焦磷酸鈉緩沖溶液： 準(zhǔn)確稱量焦磷酸鈉5.318 g、EDTA 0.017 5 g，置于200 mL 量瓶中，超聲溶解于純凈水，定容至刻度，磷酸調(diào)pH 至7.5 或8.5，現(xiàn)用現(xiàn)配。

0.125 mg/mL 尿酸母液： 精密稱取0.002 5 g 固體尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于20 mL 二次蒸餾水中。

不同梯度濃度尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液： 分別量取尿酸母液溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL 的尿酸溶液。

2.2 尿酸工作曲線繪制 采用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)不同梯度濃度的尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，在290 nm 波長(zhǎng)處對(duì)其吸光度進(jìn)行測(cè)定。

曲線工作方程：Y＝0.049 7X＋0.005 7，R2＝0.999 3。

2.3 黃嘌呤氧化酶生物活性體外測(cè)試模型構(gòu)建 參考謝濤、史坤等［15-16］報(bào)道，在0.1 mol/L 焦磷酸鈉緩沖溶液（0.4 mL，pH 7.5 或8.5） 中加入1.0 mmol/L Xan 溶液（1.0 mL），同時(shí)加入0.01 mg/mL XOD 溶液（1.6 mL），混勻，分別將反應(yīng)體系置于37 ℃的水浴中恒溫15 min，利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，記錄290 nm 波長(zhǎng)處吸光度，參比液為2 mL 緩沖液＋1 mL 1.0 mmol/L Xan 溶液。

2.4 黃嘌呤氧化酶體外活性抑制測(cè)試 參照“2.3” 項(xiàng)下方法，將不同濃度的待測(cè)溶液（0.4 mL） 和1.0 mmol/L Xan 溶液（1.0 mL） 依次加入反應(yīng)器皿中，再加入0.01 mg/mL XOD 溶液（1.6 mL），混勻，水浴恒溫37 ℃，作用15 min，采用紫外可見分光光度計(jì)作全波長(zhǎng)掃描，記錄290 nm 波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算抑制率，參比液為0.4 mL 各濃度待測(cè)液＋1.6 mL 緩沖液＋1 mL 1.0 mmol/L Xan 溶液。

ΔA0，290為未加入抑制劑，290 nm 波長(zhǎng)處的吸光度；ΔA1，290為加入抑制劑，290 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。

2.5 二氫楊梅素自氧化速率測(cè)試 量取0.5 mL 0.2 mg/mL二氫楊梅素溶液，轉(zhuǎn)移至弱堿性（pH 7.5） 緩沖液（1.5 mL） 中，混勻，室溫反應(yīng)不同時(shí)間。隨后，采用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，記錄不同時(shí)間點(diǎn)325 nm 波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算反應(yīng)速率v。

ΔA1，325為二氫楊梅素自氧化作用不同時(shí)間點(diǎn)在325 nm波長(zhǎng)處吸光度，ΔA0，325為二氫楊梅素在325 nm 波長(zhǎng)處吸光度，t為反應(yīng)作用時(shí)間。

2.6 數(shù)據(jù)分析 采用OriginPro 8.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性或非線性回歸法擬合。

3 結(jié)果

3.1 二氫楊梅素體外抑制黃嘌呤氧化酶生物活性評(píng)價(jià) 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素在堿性溶液中處于不穩(wěn)定狀態(tài)，易發(fā)生自氧化作用，導(dǎo)致自身分子結(jié)構(gòu)骨架被破壞，從而可能喪失原有結(jié)構(gòu)的生物活性特征［12］。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同堿性環(huán)境的黃嘌呤氧化酶體外測(cè)試模型對(duì)天然手性小分子二氫楊梅素生物活性的影響，采用pH 7.5 或8.5 的堿性環(huán)境體外黃嘌呤氧化酶測(cè)試模型，分別對(duì)不同濃度的二氫楊梅素和對(duì)照藥別嘌呤醇抑制黃嘌呤氧化酶生物活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并加以對(duì)比分析。結(jié)果表明，不同濃度的二氫楊梅素和對(duì)照藥劑別嘌呤醇在pH 7.5 或8.5的堿性環(huán)境體外酶測(cè)試模型中，均可明顯地觀察到二氫楊梅素和別嘌呤醇對(duì)黃嘌呤氧化酶生物活性具有一定的抑制作用，且與藥劑濃度在一定的范圍內(nèi)成正比關(guān)系，見圖1。值的注意的是，不同濃度的別嘌呤醇在pH 7.5 或8.5 的堿性環(huán)境體外酶測(cè)試模型中呈現(xiàn)相近的抑制作用，說明堿性環(huán)境因素對(duì)別嘌呤醇的生物活性影響較小，可以忽略不計(jì)。然而，二氫楊梅素結(jié)果呈現(xiàn)出較大的差異性，不同濃度的二氫楊梅素藥劑在pH 7.5 的堿性環(huán)境體外酶測(cè)試模型中生物活性抑制率最高可達(dá)48.47%，而且均高于在pH 8.5 的堿性環(huán)境中的所對(duì)應(yīng)濃度藥劑的抑制率。由此可知，堿性因素對(duì)二氫楊梅素抑制黃嘌呤氧化酶生物活性的影響較大，可直接導(dǎo)致其抑制率降低。

圖1 堿性因素對(duì)二氫楊梅素的抑制作用的影響

3.2 二氫楊梅素堿性溶液中自氧化速率分析 結(jié)合課題組前期對(duì)二氫楊梅素在堿性溶液中自氧化作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素在不同堿性水溶液中的自氧化程度區(qū)別較大。因此，將0.5 mL 二氫楊梅素溶液（0.2 mg/mL） 分別轉(zhuǎn)移至堿性（pH 7.5 或8.5） 緩沖液（1.5 mL） 中，室溫作用0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 min，并采用紫外光譜儀記錄325 nm 波長(zhǎng)處吸光度（二氫楊梅素自氧化特征峰，如圖2a所示），從而考察其自氧化速率。結(jié)果表明，二氫楊梅素在pH 8.5 的堿性水溶液中各時(shí)間點(diǎn)自氧化速率總體上呈下降趨勢(shì)，但均高于在pH 7.5 的堿性水溶液中，見圖2b。由此說明，二氫楊梅素在pH 8.5 的堿性環(huán)境中自氧化程度較高，其分子結(jié)構(gòu)變化速率相對(duì)較快，喪失自身原有分子結(jié)構(gòu)的生物活性也相對(duì)較快，從而進(jìn)一步佐證了相同濃度的二氫楊梅素藥劑。另外，在pH 7.5 的堿性環(huán)境體外酶測(cè)試模型中作用相同時(shí)間時(shí)，表現(xiàn)出的生物活性抑制率較高。

圖2 二氫楊梅素在堿性環(huán)境中的自氧化速率

3.3 黃嘌呤氧化酶抑制作用機(jī)制分析 據(jù)報(bào)道，黃嘌呤氧化酶是由一個(gè)包含2 個(gè)鐵硫中心的N 端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸輔基FAD 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C 端的鉬蝶呤蛋白結(jié)構(gòu)域組成［17］。次黃嘌呤或黃嘌呤在C 端的鉬蝶呤蛋白結(jié)構(gòu)域中，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成相對(duì)應(yīng)的黃嘌呤或尿酸，同時(shí)釋放出自由電子（e-）。自由電子經(jīng)N 端結(jié)構(gòu)域中鐵硫［2Fe-2S］ 中心傳遞至FAD 結(jié)構(gòu)域，此時(shí)，溶液中的游離氧分子（O2） 作為電子受體，在FAD 結(jié)構(gòu)域中發(fā)生單電子還原反應(yīng)，形成超氧陰離子自由基（O2.-） 或過氧化氫（H2O2），見圖3。

圖3 黃嘌呤氧化酶生物催化次黃嘌呤或黃嘌呤過程

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步結(jié)合了課題組前期關(guān)于二氫楊梅素與超氧陰離子自由基的研究［14］，證實(shí)了二氫楊梅素在清除超氧陰離子自由基能力方面表現(xiàn)良好，其原因在于其分子結(jié)構(gòu)中C 環(huán)中手性C-H 的存在，對(duì)超氧陰離子自由基清除具有重大貢獻(xiàn)。也就是說，二氫楊梅素與超氧陰離子自由基發(fā)生有效碰撞，C 環(huán)中手性3-C 上的氫原子與自由基發(fā)生串聯(lián)式氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)向楊梅素分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該結(jié)論在課題組多項(xiàng)研究中被證實(shí)［11-12，14］，見圖4。

圖4 二氫楊梅素在超氧陰離子自由基參與下轉(zhuǎn)化為楊梅素過程

二氫楊梅素在黃嘌呤氧化酶體外測(cè)試模型中表現(xiàn)出的良好抑制活性，可能存在楊梅素分子結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)。為了佐證楊梅素結(jié)構(gòu)對(duì)黃嘌呤氧化酶生物活性抑制的貢獻(xiàn)度，本實(shí)驗(yàn)采用二氫楊梅素、楊梅素及楊梅素與二氫楊梅素不同濃度配比混合物（nMY/nDMY），分別進(jìn)行黃嘌呤氧化酶生物活性抑制體外測(cè)試。結(jié)果，在pH 7.5 堿性的黃嘌呤氧化酶體外測(cè)試模型中，單體二氫楊梅素或楊梅素在濃度為500 μmol/L 時(shí)，其抑制率分別為38.33%、89.89%，見圖5。但當(dāng)nMY/nDMY分別為5/495、10/490、15/485、20/480 和25/475 時(shí)，混合物濃度均為500 μmol/L，其對(duì)黃嘌呤氧化酶的生物活性抑制作用隨著楊梅素含量的增加，呈遞增趨勢(shì)，其抑制率均高于相同濃度二氫楊梅素，低于相同濃度楊梅素。因此，楊梅素分子結(jié)構(gòu)的存在對(duì)二氫楊梅素的抑制率提升具有一定的貢獻(xiàn)度。

圖5 二氫楊梅素與楊梅素混合藥劑對(duì)黃嘌呤氧化酶的生物活性抑制作用

基于以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)二氫楊梅素在弱堿性環(huán)境中抑制黃嘌呤氧化酶生物活性的作用機(jī)制進(jìn)行合理的分析，見圖6。黃嘌呤氧化酶在生物催化次黃嘌呤或黃嘌呤過程中，生成尿酸并釋放出超氧陰離子自由基（O2.-），二氫楊梅素在超氧陰離子自由基的作用下，可實(shí)現(xiàn)部分向楊梅素分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，形成二氫楊梅素和楊梅素的混合物。二氫楊梅素是非平面雙手性分子結(jié)構(gòu)，而楊梅素屬于平面分子結(jié)構(gòu)，因此該混合物在黃嘌呤氧化酶結(jié)合位點(diǎn)選擇時(shí)，可能出現(xiàn)一定的差異性，形成協(xié)同作用，從而表現(xiàn)出高效的酶抑制作用，其抑制率高于相同濃度的單體二氫楊梅素。

圖6 二氫楊梅素抑制黃嘌呤氧化酶作用機(jī)制

3.4 構(gòu)效關(guān)系分析 基于上述天然二氫楊梅素對(duì)XOD 活性抑制評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了以二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的天然黃酮類化合物單體對(duì)XOD 活性抑制作用，并分析其構(gòu)效關(guān)系。二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)可分為3 個(gè)部分，A環(huán)上接入2 個(gè)酚羥基（分別位于5-和7-），并與C 環(huán)上的C＝O 發(fā)生π-π 共軛作用。另外，C 環(huán)上羰基鄰位碳屬于手性碳原子，為R型，且連接1 個(gè)羥基，同時(shí)C 環(huán)上2-碳原子也屬于R型手性碳原子，并與芳香B 環(huán)連接。在B 環(huán)上，3 個(gè)相鄰的酚羥基分別位于3’-，4’-，5’-，并與苯環(huán)發(fā)生p-π 共軛作用。鑒于此結(jié)構(gòu)特征，本實(shí)驗(yàn)選取了具有類似特征的黃酮類化合物單體楊梅素、槲皮素和山柰酚，探討其與XOD 活性抑制構(gòu)效關(guān)系。從分子結(jié)構(gòu)上分析，相比二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)而言，天然楊梅素分子結(jié)構(gòu)近似于平面分子，其中，A、B、C 三環(huán)存在良好的π-π 共軛效應(yīng)，且C 環(huán)上2，3-碳原子上氫原子因消除形成碳碳雙鍵，見圖7。槲皮素和山柰酚雖然也具有近似于平面的分子結(jié)構(gòu)，但在其B 環(huán)上分布的官能團(tuán)羥基數(shù)存在一定的差異性，它們分別為2 個(gè)羥基（3’-和3’-） 和1 個(gè)羥基（4’-）。在體外XOD 活性抑制評(píng)價(jià)方面，雖然楊梅素、槲皮素及山柰酚的XOD 活性抑制率在一定范圍內(nèi)存在濃度依賴性，但它們的IC50值存在顯著差異性。楊梅素的IC50值為20.73 μmol/L，最大抑制率為91.33%； 槲皮素的IC50值為203.61 μmol/L，遠(yuǎn)高于楊梅素，說明B 環(huán)上3’-OH 對(duì)XOD 活性抑制具有顯著貢獻(xiàn)，見表1。另外，手性分子二氫楊梅素和平面分子山柰酚的最大抑制率分別為48.47%、12.76%，但未能計(jì)算出IC50值。由此可知，黃酮類分子結(jié)構(gòu)趨近于平面狀態(tài)有助于提高體外XOD 活性抑制作用，且其貢獻(xiàn)度可能大于B環(huán)上羥基數(shù)的貢獻(xiàn)度。

表1 黃酮類化合物XOD 活性抑制率及IC50

4 結(jié)論

二氫楊梅素作為天然手性黃酮醇類化合物，在分子結(jié)構(gòu)上，具有獨(dú)特的潛在生物活性特征。本實(shí)驗(yàn)以天然二氫楊梅素為研究對(duì)象，探究其在不同堿性環(huán)境中對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用，并進(jìn)行科學(xué)的分析評(píng)價(jià)。另外，結(jié)合課題組前期關(guān)于二氫楊梅素與超氧陰離子自由基的研究成果，發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素在超氧陰離子自由基的作用下可轉(zhuǎn)化為楊梅素，進(jìn)一步分析二氫楊梅素對(duì)黃嘌呤氧化酶生物活性抑制的作用機(jī)制，從而首次揭示了二氫楊梅素與楊梅素對(duì)黃嘌呤氧化酶生物活性抑制的具有協(xié)同增效作用。該研究可為研究天然手性小分子化合物抑制黃嘌呤氧化酶提供重要參考依據(jù)。