張東方，魯曉光

（南陽市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，河南 南陽 473059）

小兒感冒顆粒由廣藿香、菊花、板藍(lán)根、連翹等10 味中藥組成，具有疏風(fēng)解毒、清熱解毒功效，用于治療小兒風(fēng)熱感冒，發(fā)熱重、頭脹痛，咳嗽痰黏、咽喉腫痛，流感等［1-5］，方中連翹、板藍(lán)根清熱解毒，菊花疏散風(fēng)熱，為主要藥味，但在2020年版《中國藥典》 一部中［6］該制劑無含量測定項，無法有效控制其質(zhì)量。檢索文獻(xiàn)［7-16］ 發(fā)現(xiàn)，綠原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸是菊花藥效成分，尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春是板藍(lán)根抗病毒有效成分，連翹苷、連翹酯苷A 是連翹重要抗菌成分，并且任菲菲等［17］同時測定綠原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡?？鼘幩岷?，陳寶國等［18］采用多波長法同時測定（R，S） -告依春、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 含量，楊薇等［19］采用多波長法同時測定連翹酯苷A、連翹苷、（R，S） -告依春、綠原酸、異綠原酸A 含量，但均未涉及板藍(lán)根中核苷類成分。因此，本實驗建立HPLC 法同時測定小兒感冒顆粒中尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春、綠原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡?？鼘幩?、連翹苷、連翹酯苷A 的含量，以期為全面完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，也為兒童用藥安全作出保障。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2996 型高效液相色譜儀，配置PDA 檢測器（美國Waters 公司）； BP211D 型電子天平（德國Sartorious 公司）； WT-1200 型超聲波清洗器（濟(jì)寧萬通超聲儀器設(shè)備廠）。

1.2 試劑與藥物 尿苷（批號110887-202104，純度99.6%）、鳥苷 （批號111977-201501，純度93.6%）、腺苷 （ 批號 110731-201116，純度99.7%）、（R，S） -告依春（批號111753-201304，純度99.9%）、綠原酸（批號110753-201817，純度96.8%）、連翹酯苷A （批號111810-201707，純度97.2%）、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?（批號111782-201807，純度94.3%）、4，5-O-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?11894-202104，純度95.1%）、木犀草苷（批號111720-201408，純度94.9%）、連翹苷（110821-201514，純度93.5%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。小兒感冒顆粒購自4個廠家，編號S1 ～S4，方中藥材均為市售，經(jīng)南陽市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心專家鑒定為正品。乙腈為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Welchrom C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.2%冰醋酸（B），梯度洗脫（0 ～20 min，2% ～8% A； 20 ～35 min，8% ～20%A； 35 ～45 min，20% ～25%A； 45 ～55 min，25% ～40% A； 55 ～60 min，40% ～70% A；60～70 min，70% A； 70 ～75 min，70% ～2% A）；體積流量0 ～45 min 0.8 mL/min，45 ～75 min 1.0 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測波長0 ～25 min 254 nm，25～51 min 327 nm，51 ～75 min 230 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇溶解制成貯備液，精密量取適量，甲醇稀釋成每1 mL 分別含尿苷3.49 μg/mL、鳥苷3.90 μg/mL、腺苷4.25 μg/mL、（R，S） -告依春15.51 μg/mL、綠原酸28.19 μg/mL、連翹酯苷A 317.84 μg/mL、木犀草苷32.58 μg/mL、3，5-二咖啡?？鼘幩?4.26 μg/mL、4，5-二咖啡?？鼘幩?17.82 μg/mL、連翹苷37.20 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，精密稱取5 g，置于棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按2020 年版《中國藥典》一部處方和工藝，分別制成缺菊花、缺連翹、缺板藍(lán)根陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性考察和專屬性試驗 取“2.2”項下對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分理論塔板數(shù)均大于7 000，分離度均大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、4.0、10.0、20.0 mL，置于20 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春、綠原酸、連翹酯苷A、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡?？鼘幩?、連翹苷峰面積RSD 分別為1.56%、1.62%、1.40%、1.06%、1.58%、1.96%、1.14%、1.22%、1.49%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（S1） 適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春、綠原酸、連翹酯苷A、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡?？鼘幩帷⑦B翹苷峰面積RSD 分別為1.06%、1.52%、1.43%、1.36%、1.68%、1.86%、1.64%、1.72%、1.69%、1.31%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取本品 （S1） 適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春、綠原酸、連翹酯苷A、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡?？鼘幩?、連翹苷含量RSD 分別為1.26%、1.42%、1.03%、1.56%、1.78%、1.99%、1.34%、1.79%、1.63%、1.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取本品（S1） 6 份，每份約2.5 g，精密稱定，置于棕色具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春、綠原酸、連翹酯苷A、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩幔?，5-二咖啡?？鼘幩?、連翹苷平均加樣回收率分別為96.53%、97.70%、98.05%、96.09%、96.90%、96.81%、93.68%、97.97%、97.55%、98.08%，RSD 分別為1.13%、1.86%、1.32%、1.14%、1.34%、1.40%、1.62%、1.32%、0.90%、1.29%。

2.9 樣品含量測定 取4 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.2 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長選擇 本實驗通過紫外掃描吸收光譜發(fā)現(xiàn)，尿苷、鳥苷、腺苷在254 nm 處吸收最大；（R，S） -告依春、連翹苷在230 nm 處吸收最大，但前者在254 nm 處吸收也很強(qiáng)； 綠原酸、連翹酯苷A、木犀草苷、3，5-二咖啡?？鼘幩?，4，5-二咖啡酰奎寧酸在327 nm 處吸收強(qiáng)，雜質(zhì)干擾小，基線穩(wěn)定。參考文獻(xiàn)［17-23］ 報道結(jié)合目標(biāo)峰響應(yīng)強(qiáng)、分離度好，雜質(zhì)峰干擾和基線噪音小等因素，最終確定0 ～25 min 在254 nm 波長處測定尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春，25 ～51 min在327 nm 波長處測定綠原酸、連翹酯苷A、木犀草苷、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩幔?1 ～75 min 在230 nm 波長處測定連翹苷。

3.2 流動相選擇 本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.3% 磷酸、乙腈-0.2% 磷酸、乙腈-0.2%冰醋酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2% 冰醋酸梯度洗脫時分離效果良好，保留時間適宜，色譜峰峰形理想。另外，由于小兒感冒顆粒成分復(fù)雜，故經(jīng)反復(fù)考察最終確定體積流量、洗脫比例，此時各成分色譜峰均能得到很好的分離。

3.3 提取方法選擇 本實驗考察了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇或乙醇，發(fā)現(xiàn)在甲醇中各成分提取充分。再分別考察了加熱回流提取、超聲提取30、60、90 min，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min 時各成分有效溶出，并且綠原酸損失、雜質(zhì)成分也較少。最終確定，提取方法為甲醇超聲提取30 min。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC 法同時測定小兒感冒顆粒中尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S） -告依春、綠原酸、木犀草苷、3，5-二咖啡酰奎寧酸，4，5-二咖啡?？鼘幩?、連翹苷、連翹酯苷A 的含量，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂和提升提供參考，也能為其臨床藥理研究提供基礎(chǔ)。