張 倩，楊 波，羅瑞明，胡曉磊，畢永昭，陳雪妍，王金霞，李 榮，胡麗筠

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是磷酸化細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇的酶，根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)可分為3 類：I類PI3K、II類PI3K和III類PI3K[1]。其中，I類PI3K（PI3KI）調(diào)節(jié)內(nèi)分泌反應(yīng)，如細(xì)胞內(nèi)胰島素和生長(zhǎng)因子，并激活蛋白激酶B（protein kinase B，AKT），增強(qiáng)細(xì)胞葡萄糖攝取和刺激肌肉細(xì)胞合成糖原[2]。另外，AKT也能刺激蛋白質(zhì)合成并抑制肌肉中蛋白質(zhì)的降解[3]。由于PI3KI作為營(yíng)養(yǎng)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，并參與動(dòng)物和人類的肌肉生理過(guò)程，因此它與肌肉穩(wěn)態(tài)和生長(zhǎng)之間的關(guān)系已有較多的研究。PI3KI在肌肉萎縮中也具有重要作用，特別是與人類疾病相關(guān)的高脂血癥[4]。最近的研究表明，其他類的PI3K也會(huì)影響葡萄糖和蛋白質(zhì)代謝，并與人體的某些肌肉疾病有關(guān)[5-6]。PI3K/AKT信號(hào)通路利用多種調(diào)節(jié)因子調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及代謝等生物過(guò)程維持細(xì)胞和生物體的穩(wěn)態(tài)，如胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor，IGF）[7]。PI3K/AKT信號(hào)通過(guò)激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成等過(guò)程，這也受能量狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)物的調(diào)節(jié)。伴隨其在刺激蛋白質(zhì)合成和肌肉生長(zhǎng)中的重要合成代謝作用，PI3K/AKT途徑也可能在抑制動(dòng)物的蛋白質(zhì)降解中發(fā)揮作用[8]。

灘羊是寧夏重點(diǎn)特色養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，以其肉質(zhì)鮮嫩、無(wú)膻味、含脂率低、營(yíng)養(yǎng)含量豐富的獨(dú)特品質(zhì)而深受大眾喜愛[9]。截止到2021年，寧夏“鹽池灘羊”品牌價(jià)值已高達(dá)88.17億 元[10]。肌肉纖維內(nèi)蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡影響肌肉質(zhì)量和纖維大小，這兩個(gè)過(guò)程對(duì)營(yíng)養(yǎng)狀況和激素平衡等因素都有影響。在脊椎動(dòng)物中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)降解速率大于蛋白質(zhì)合成速率時(shí)，肌肉就會(huì)發(fā)生萎縮，導(dǎo)致質(zhì)量下降[11-12]。反之，會(huì)發(fā)生肥大，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量增加。由于PI3K/AKT信號(hào)通路在刺激蛋白質(zhì)合成和肌肉生長(zhǎng)中的重要合成代謝作用，并調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控及穩(wěn)態(tài)維持等重要生物學(xué)過(guò)程，在抗肌萎縮蛋白缺陷型肌肉等疾病中均能檢測(cè)到PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)基因的異常表達(dá)或蛋白的異常磷酸化[13]。近些年來(lái)，人們對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控和功能有了深入的了解。然而，PI3K/AKT途徑仍然很復(fù)雜，特別在冷卻灘羊肉中，對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的功能和代謝穩(wěn)態(tài)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的分子機(jī)制仍不清楚。因此，研究冷卻貯藏期間灘羊肉中PI3K/AKT信號(hào)通路的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。

隨著組學(xué)技術(shù)的興起，轉(zhuǎn)錄組學(xué)從RNA層次研究基因表達(dá)的情況，探索特定時(shí)期下生物體組織或器官的全部基因組轉(zhuǎn)錄情況及規(guī)律[14]。其中包含微陣列技術(shù)、基因表達(dá)序列分析、大規(guī)模平行測(cè)序和高通量測(cè)序等轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)[15]。而高通量測(cè)序以其檢測(cè)通量高、數(shù)字信號(hào)精確等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用[16-17]。近年來(lái)，中國(guó)鹽池灘羊基因組組裝已經(jīng)完成，并通過(guò)大規(guī)模全基因組重測(cè)序研發(fā)出了鑒別技術(shù)，為灘羊肉品質(zhì)改良和產(chǎn)地溯源提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障[18-19]。本研究旨在分析經(jīng)PI3K抑制劑（LY294002）注射處理后冷卻灘羊肉貯藏期間轉(zhuǎn)錄組的信息，揭示PI3K/AKT信號(hào)通路在灘羊肉代謝調(diào)控中的作用，有助于研究PI3K/AKT信號(hào)通路在冷卻灘羊中的復(fù)雜功能，為冷卻灘羊肉貯藏期間肉品質(zhì)量控制技術(shù)研發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊右后腿肉由寧夏鹽池縣大夏牧場(chǎng)食品有限公司提供。選取9 只體質(zhì)量相近的6 月齡閹割公灘羊，屠宰前統(tǒng)一管理。依據(jù)GB 12694—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 畜禽屠宰加工衛(wèi)生規(guī)范》要求屠宰，屠宰前無(wú)電刺激，屠宰后立即放入-20 ℃冰箱1 h，使其中心溫度降至0 ℃，密封托盤包裝后將其轉(zhuǎn)移至0～4 ℃冰箱貯藏。

HY-10108 LY294002溶液 美國(guó)MedChemExpress公司；TRIzol試劑盒 美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；GeneReadTM 試劑盒德國(guó)Qiagen 公司；NEB fragmentation buffer 美國(guó)NEB公司；dNTPs 美國(guó)Thermo公司；DNA聚合酶I、RNase H 美國(guó)TaKaRa生物公司；AMPure XP beads 美國(guó)Beckman Coultier公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoPhotometer納米光度計(jì) 德國(guó)Implen公司；2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；Qubit 2.0熒光計(jì)上海Life Technologies公司；Illumina高通量測(cè)序儀中國(guó)Novogene公司；SW-CJ-1G超凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)公司；ScanSpeed MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國(guó)Scan Speed公司；Thermo Scientific Forma 994 -80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司；GeneAmp PCR system 9700普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Life公司；BA-200 Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選用寧夏鹽池縣大夏牧區(qū)的灘羊作為實(shí)驗(yàn)材料，采集在0～4 ℃條件貯藏的冷卻灘羊右后腿肉（從腰椎與薦椎連接處斬下的右后腿部位肌肉）。將取下的灘羊右后腿剔除可見脂肪及結(jié)締組織后迅速取約50 g 樣本作為0 d 樣品。其余樣品切成大小均一的塊狀，每塊約50 g，隨機(jī)分為對(duì)照組（命名為C）和LY294002組，共18 組。對(duì)照組不做任何處理，LY294002組以料液比10∶1注射10 μmol/L LY294002溶液。置0～4 ℃、相對(duì)濕度85%條件下，分別采集貯藏0、4、8 d后樣品各6 g封裝于滅菌冷凍管中，用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)于不便立即測(cè)定的指標(biāo)，在采樣點(diǎn)取下樣品后迅速置于液氮中冷凍并轉(zhuǎn)移至-0 ℃冰箱保存待用。每組樣本分別進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

LY294002注射組和對(duì)照組的樣品按照制造商的說(shuō)明使用TRIzol試劑盒進(jìn)行RNA提取[20]。使用NanoPhotometer納米光度計(jì)和2100生物分析儀檢測(cè)RNA樣品的數(shù)量和質(zhì)量。樣品檢測(cè)合格后，通過(guò)GeneReadTM試劑盒去除rRNA。隨后加入NEB fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶I和RNase H合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫(kù)[21]。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0熒光計(jì)進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1.5 ng/μL，隨后使用2100生物分析儀對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后，使用實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞2 nmol/L），以保證文庫(kù)質(zhì)量。文庫(kù)制備物在Illumina HiSeq平臺(tái)上測(cè)序。

1.3.3 質(zhì)量控制、轉(zhuǎn)錄組組裝和基因功能注釋

fastq格式的Raw reads首先通過(guò)內(nèi)部perl腳本進(jìn)行處理。在該步驟中，通過(guò)從Raw reads（原始序列）中去除接頭序列、包含poly-N的讀數(shù)和低質(zhì)量讀數(shù)，獲得Clean reads（過(guò)濾序列）。同時(shí)，計(jì)算Q20、Q30、GC含量和過(guò)濾序列重復(fù)水平。所有下游分析都基于Clean reads。使用拼接軟件Trinity（version: r20140413p1）基于left.fq和right.fq完成轉(zhuǎn)錄組組裝，其中min_kmer_cov默認(rèn)設(shè)置為2，所有其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置。基因功能基于以下數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋：非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Non-redundant Protein Sequence Database，Nr）、核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Nucleotide Sequence Database，Nt）、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Swiss-Prot）、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Families，Pfam）、基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）。

1.3.4 差異表達(dá)基因（differential genes，DEGs）分析和功能富集

使用DESeq（2012）軟件包對(duì)兩個(gè)條件/組進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用Benjamini和Hochberg控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的方法調(diào)整所得的P值。用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq進(jìn)行差異分析，Padj＜0.05和|log2FC|＞1（FC表示差異倍數(shù)（fold chang））的基因被指定為差異表達(dá)[22]。通過(guò)微生信數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）實(shí)施DEGs的GO富集分析和KEGG途徑分析。0 d對(duì)比4 d組記為0/4 d組，4 d對(duì)比8 d組記為4/8 d組。

1.3.5 real-time PCR驗(yàn)證

real-time PCR用于驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果。隨機(jī)選取FC＞2或＜0.5且P＜0.01的6 個(gè)DEGs進(jìn)行real-time PCR，GAPDH基因用作內(nèi)部參考基因。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)用于real-time PCR的引物，列于表1中。擴(kuò)增程序根據(jù)以前的方法：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)[23]。通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)率。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和LY294002處理組。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

1.3.6 肌纖維直徑和間距測(cè)定

每組的肌肉組織用4%多聚甲醛固定液固定樣本，隨后進(jìn)行脫水、修剪、包埋、切片、染色、鏡檢[24]；采用數(shù)碼三目攝像顯微鏡觀察切片，測(cè)量肌纖維直徑和肌纖維間距，每個(gè)樣本共測(cè)量5 組數(shù)據(jù)，取平均值分別記為該樣本的肌纖維直徑和間距[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和de novo組裝

對(duì)來(lái)自對(duì)照組的9 個(gè)cDNA文庫(kù)和來(lái)自LY294002組的9 個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序[26]。共獲得115.50 Gb的序列，包括254941108 個(gè)Raw reads和248253912 個(gè)Clean reads。其中，96525684 個(gè)和151728228 個(gè)過(guò)濾序列分別來(lái)自對(duì)照組和LY294002組。對(duì)照組和LY294002組的堿基測(cè)序錯(cuò)誤率分別為0.03%和0.02%。詳細(xì)信息如表2所示。18 個(gè)文庫(kù)過(guò)濾序列的從頭組裝產(chǎn)生62215 個(gè)單基因，總長(zhǎng)度為183401678 bp，其中N50為1562 bp。從頭組裝詳細(xì)信息如表3所示。

2.2 基因功能注釋

對(duì)Nr、Nt、Swiss-Prot、Pfam、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步搜索，共組裝62215 個(gè)單基因。其中，獲得功能注釋信息的單基因分別為25459（26.48%）、42157（58.14%）、18908（19.15%）、24130（24.87%）、25067 個(gè)（31.15%）和11487 個(gè)（14.52%）?？偣?863 個(gè)（6.42%）單基因可以與所有數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，48129 個(gè)（58.41%）單基因至少與一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配（表4）。

表4 灘羊肉轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果Table 4 Results of function annotation of Tan mutton transcriptome

根據(jù)GO分析，25067 個(gè)單基因被分為3 個(gè)功能類別：生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能類別。0/4 d組這3 個(gè)功能類別中最主要的分別是單一生物代謝過(guò)程、細(xì)胞外隙和結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)（圖1A），4/8 d組這3 個(gè)功能類別中最主要的分別是線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)、MHC II類蛋白復(fù)合體和氧化還原酶活性（圖1B）。表明0～4 d期間，位于細(xì)胞外隙的基因參與單一生物代謝過(guò)程等，這些基因編碼的蛋白質(zhì)具備結(jié)構(gòu)分子活性等功能。4～8 d期間，位于MHC II類蛋白復(fù)合體的基因參與調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程，這些基因編碼的蛋白質(zhì)具備氧化還原酶活性等功能。此外，KEGG分析顯示，10049 個(gè)單基因被映射到27 個(gè)通路上，這些通路可分為新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程和生物體系統(tǒng)五大類。其中，0/4 d組富集DEGs較多的是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、碳水化合物代謝（圖2A）；4/8 d組富集DEGs較多的是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯（圖2B）。在所有途徑中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是富集到DEGs最多的途徑。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)通路篩選后，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路、氧化磷酸化通路、叉頭框蛋白O（forkhead box O，F(xiàn)OXO）信號(hào)通路以及mTOR信號(hào)通路在兩組DEGs中顯著富集。

圖1 單基因的GO分類Fig.1 GO classification of unigenes

圖2 KEGG分類Fig.2 KEGG classification

2.3 差異表達(dá)分析和富集分析

為了比較0、4、8 d對(duì)照組和LY294002組之間的差異表達(dá)，使用DESeq（2012）軟件包識(shí)別DEGs，以Padj＜0.05、log2FC＞1或log2FC＜-1為篩選條件，共發(fā)現(xiàn)583 個(gè)DEGs。其中，0 d對(duì)照組和LY294002組中發(fā)現(xiàn)474 個(gè)DEGs，包括320 個(gè)上調(diào)基因和154 個(gè)下調(diào)基因（圖3A），BAD基因極顯著上調(diào)可能是由于AKT活性受到抑制而促進(jìn)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動(dòng)子（Bcl-2asociated death promoter，BAD）與Bcl-2基因的結(jié)合，從而減弱Bcl-2基因抑制凋亡的作用。另外，Caspase-9蛋白水解酶被激活，促使Caspase-9降解肌肉結(jié)構(gòu)蛋白并影響肌肉嫩度；4 d對(duì)照組和LY294002組中發(fā)現(xiàn)96 個(gè)DEGs，包括44 個(gè)上調(diào)基因和52 個(gè)下調(diào)基因（圖3B），AS160表達(dá)顯著下調(diào)會(huì)使下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporter，GLUT）4蛋白降解，誘發(fā)骨骼肌攝取葡萄糖能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖代謝紊亂。CHI3L1基因表達(dá)下調(diào)可能是PI3K/AKT通路受到抑制后，激活了下游與碳水化合物分解代謝和蛋白質(zhì)磷酸化酶等有關(guān)；8 d對(duì)照組和LY294002組中發(fā)現(xiàn)13 個(gè)DEGs，包括2 個(gè)上調(diào)基因和11 個(gè)下調(diào)基因（圖3C），上調(diào)基因與肌肉組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，包括肌球蛋白重鏈7B和肌鈣蛋白C1基因，下調(diào)的基因MYH7B、MYOZ2、RRAD與糖酵解受到抑制和鈣通道調(diào)節(jié)有關(guān)。

圖3 對(duì)照組和LY294002組DEGs分布趨勢(shì)火山圖Fig.3 Volcano maps of the distribution trends of DEGs between the control and LY294002 groups

為深入了解LY294002注射組可能差異調(diào)節(jié)的生物學(xué)過(guò)程，選用0/4 d LY294002組進(jìn)行GO注釋分析。發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要富集在30 個(gè)GO條目中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞外區(qū)和受體結(jié)合分別是生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能類別中富集最多的亞類（圖4A）。下調(diào)基因也主要富集在30 個(gè)GO項(xiàng)，氨基聚糖代謝、胞外區(qū)和受體結(jié)合分別是生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能中富集最多的亞類（圖4B）。

圖4 0/4 d LY294002組DEGs的GO注釋結(jié)果Fig.4 GO annotation results of DEGs in LY294002 group on days 0 versus 4

為進(jìn)一步探索DEGs可能參與哪些信號(hào)通路，使用微生信在線軟件（http://www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行了KEGG通路富集分析，F(xiàn)DR≤0.05被視為富集通路，結(jié)果見圖5。

圖5 前20 DEGs的KEGG分類Fig.5 KEGG classification of top 20 DEGs

圖5A顯示了關(guān)于0/4 d LY294002組上調(diào)基因的最重要的前20 條途徑。在前20 條途徑中，精氨酸和脯氨酸代謝、ECM受體交互作用、PPAR信號(hào)通路、黏附斑激酶信號(hào)通路和甘油脂類代謝受到LY294002處理的影響。下調(diào)的基因在細(xì)胞衰老、糖酵解/糖異生、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、氨基酸的生物合成和自噬途徑中顯著富集（圖5B）。KEGG分析結(jié)果表明，PI3K/AKT途徑在肌肉的氨基酸、葡萄糖和脂類代謝以及細(xì)胞命運(yùn)中起著重要作用。

2.4 real-time PCR驗(yàn)證

為證實(shí)RNA-Seq的結(jié)果，選擇涉及cAMP信號(hào)通路、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、細(xì)胞凋亡、甘油脂類代謝和MAPK信號(hào)通路的6 個(gè)代表性DEGs（表5），并應(yīng)用real-time PCR測(cè)定這些基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，這些基因的表達(dá)與來(lái)自RNA-Seq結(jié)果的FPKM值一致（圖6），這表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

圖6 6 個(gè)DEGs的相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relative expression levels of six DEGs

表5 6 個(gè)代表性DEGsTable 5 Six representative DEGs

2.5 組織切片分析

為了研究LY294002抑制劑對(duì)肌纖維的影響，石蠟切片觀察貯藏0 d時(shí)對(duì)照組和LY294002注射組的肌纖維。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LY294002注射組的肌纖維直徑顯著減小，肌纖維之間的間距顯著增加（表6）。此外，與對(duì)照組相比，LY294002注射組的細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物明顯減少（圖7），和肌肉萎縮的特征相似。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，表明LY294002抑制PI3K/AKT信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致肌肉細(xì)胞代謝失衡，進(jìn)而影響肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致肌肉發(fā)生萎縮。

圖7 貯藏0 d對(duì)照組和LY294002組的灘羊肉組織切片F(xiàn)ig.7 Tissue sections of Tan mutton in the control and LY294002 groups

表6 0 d對(duì)照組和LY294002組肌纖維對(duì)比Table 6 Comparison of muscle fibers between the control and LY294002 groups on day 0

3 討論

PI3K/AKT信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和代謝控制等生物學(xué)功能產(chǎn)生影響[27]。為揭示PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏過(guò)程中的作用，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究LY294002處理后冷卻貯藏期間灘羊肉轉(zhuǎn)錄組的變化。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，總共組裝了62215 個(gè)單基因，N50為1562 bp，其中62.57%可以被注釋。為進(jìn)一步研究PI3K抑制劑（LY294002）對(duì)冷卻灘羊肉的影響，采用GO和KEGG富集分析對(duì)583 個(gè)基因進(jìn)行了分類。GO分析表明DEGs主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程和胞外區(qū)。KEGG富集分析表明，PI3K-AKT信號(hào)通路、氧化磷酸化通路、FOXO信號(hào)通路及mTOR信號(hào)通路為不同貯藏期間DEGs共同注釋到的代謝通路，這些途徑是肌肉細(xì)胞功能的關(guān)鍵部分。其中，胰島素受體通過(guò)參與PI3K-AKT途徑作用，發(fā)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的多效級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激葡萄糖的吸收、增殖和蛋白質(zhì)合成，并通過(guò)招募大量PI3K相關(guān)蛋白與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接。因此，對(duì)灘羊肉品質(zhì)特性如保水性及嫩度具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。氧化磷酸化是肌肉運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生ATP的有效途徑，Jiang Shengwang等[28]研究表明，氧化磷酸化與糖酵解、脂肪酸代謝、細(xì)胞凋亡和肌肉收縮有關(guān)，對(duì)宰后肉品質(zhì)形成具有重要的影響。FOXO信號(hào)通路在肌肉中的部分作用是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，通過(guò)響應(yīng)胰島素或IGF-1激活A(yù)KT誘導(dǎo)FoxO轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。此外，F(xiàn)oxO控制著肌肉中萎縮相關(guān)基因，包括Fbxo32和Trim63以及自噬基因，F(xiàn)oxO的缺失可以防止肌肉萎縮，貯藏期間肌肉能量代謝的差異可能與該通路變化有關(guān)。mTOR信號(hào)通路受到抑制時(shí)，肌肉代謝發(fā)生變化，包括氧化代謝受損，線粒體調(diào)節(jié)改變以及與AKT過(guò)度激活相關(guān)的糖原積累。Risson等[29]研究也表明，骨骼肌中的mTOR缺乏會(huì)導(dǎo)致代謝變化，從而導(dǎo)致糖原積累。因此，宰后肌肉代謝的轉(zhuǎn)換和肉品質(zhì)變化均與貯藏期間肌肉轉(zhuǎn)錄水平的變化密切相關(guān)。

肌纖維是由蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)降解維持動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)過(guò)程[30]。PI3K/AKT途徑不僅在蛋白質(zhì)合成和肌肉生長(zhǎng)中起重要作用，而且在抑制蛋白質(zhì)降解中也發(fā)揮著作用[31]。Dong Jun等[32]研究發(fā)現(xiàn)PI3K信號(hào)通路能顯著促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)，通過(guò)其下游的β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞并加快骨折愈合。PI3K/AKT也受分泌型糖蛋白（Wnt配體）調(diào)控，參與Wnt配體誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞功能。該研究闡明了Wnt/PI3K/AKT/β-連環(huán)蛋白在成骨細(xì)胞中的功能聯(lián)系，突出了PI3K/AKT和Wnt/β-連環(huán)蛋白之間復(fù)雜的相互作用，它們?cè)诠钦塾现衅鹬陵P(guān)重要的作用。王欣悅等[33]研究綿羊胚胎骨骼肌蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，具有調(diào)控綿羊胚胎骨骼肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育作用的PI3K/AKT信號(hào)通路在骨骼肌纖維直徑增大的第105天顯著富集，AKT2是調(diào)控該信號(hào)通路的重要候選蛋白，并對(duì)骨骼肌纖維發(fā)育及分化產(chǎn)生影響。PI3K和mTOR的抑制劑對(duì)瘦素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)分解顯著的抑制作用，這說(shuō)明PI3K-AKTmTOR信號(hào)通路活化是瘦素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分解所必需的[8]。PI3K/AKT信號(hào)可以使FOXO轉(zhuǎn)錄因子磷酸化抑制蛋白質(zhì)分解，F(xiàn)OXO轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)參與肌肉萎縮基因的表達(dá)降低肌肉質(zhì)量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)PI3K信號(hào)被LY294002抑制時(shí)，F(xiàn)OXO的表達(dá)顯著增加，這表明肌纖維中的蛋白質(zhì)降解水平提高。組織學(xué)分析的結(jié)果顯示，肌纖維直徑減少和肌纖維之間的間距顯著增加，這與肌肉萎縮的特征相似[34]。Ang II能夠通過(guò)抑制PI3K/AKT/FOXO1信號(hào)通路的磷酸化，抑制蛋白的合成，誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞萎縮[34]。Liu Lingyu等[35]研究發(fā)現(xiàn)福莫諾?。╢ormononetin，F(xiàn)MN）顯著抑制了大鼠肌肉生長(zhǎng)抑制素α的表達(dá)。另外，F(xiàn)MN顯著增加了PI3K、AKT和FOXO3a的磷酸化以及CKD大鼠和C2C12肌管肌肉中肌源性增殖和分化標(biāo)志物，促進(jìn)了肌源性分化因子D和肌生成蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明，PI3K/AKT/FOXO途徑調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解和合成之間的平衡，從而介導(dǎo)肌肉萎縮和維持骨骼肌質(zhì)量。從刺激到細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的過(guò)程，PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原合成介導(dǎo)肌肉代謝[12]。在本研究中，DEGs的KEGG途徑富集分析表明糖酵解/糖異生、碳水化合物代謝過(guò)程、甘油脂類代謝和脂類途徑的反應(yīng)均受到影響。這些結(jié)果表明，PI3K/AKT通路的正向功能對(duì)于冷卻灘羊肉代謝控制是必不可少的，其功能障礙可能導(dǎo)致糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)受損。

PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)在生物體生長(zhǎng)和關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程（如細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞生長(zhǎng)和存活）期間介導(dǎo)生長(zhǎng)因子信號(hào)，在細(xì)胞生理學(xué)中發(fā)揮重要作用[36]。MAPK也是關(guān)鍵信號(hào)通路，其激活對(duì)于肌肉細(xì)胞增殖是不可或缺的[37]。由于PI3K/AKT途徑的功能與Ras/MAPK途徑相似，所以發(fā)現(xiàn)這兩種途徑之間存在一定程度的相互作用[38]。在對(duì)這兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用的初步研究中，發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑可以降低MAPK的活性。Mano等[39]研究表明小鼠中的p38 MAPK信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬的激活。p38激活劑通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路的激活導(dǎo)致肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，PI3K活性對(duì)Ras/MAPK通路活性有非常重要的誘導(dǎo)作用。鑒于相互作用的復(fù)雜性，肌肉中PI3K/AKT途徑和Ras/MAPK途徑之間的真實(shí)關(guān)系尚未完全揭示。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，一些上調(diào)基因富集在MAPK信號(hào)通路中，表明PI3K/AKT通路可能對(duì)MAPK信號(hào)通路有抑制作用。而湯崇輝等[40]發(fā)現(xiàn)作為PI3K/AKT抑制劑的渥曼青霉素對(duì)大鼠腦細(xì)胞中MAPK的活化有抑制作用。這些結(jié)果表明PI3K/AKT途徑和MAPK途徑之間的相互作用在不同的細(xì)胞類型和細(xì)胞分化的不同階段可能是不同的。

4 結(jié)論

本研究利用PI3K抑制劑LY294002對(duì)貯藏期間冷卻灘羊肉處理后進(jìn)行高通量測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組信息鑒定了583 個(gè)DEGs。0～4 d，DEGs富集較多的途徑是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝及碳水化合物代謝；4～8 d富集DEGs較多的是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和翻譯過(guò)程。不同貯藏時(shí)間DEGs對(duì)肌肉代謝存在不同程度的調(diào)控作用，轉(zhuǎn)錄水平的變化主要通過(guò)氨基酸的生物合成、糖酵解/糖異生能力、甘油脂類代謝、MAPK信號(hào)通路的激活等過(guò)程參與調(diào)控肌肉代謝的轉(zhuǎn)換，為進(jìn)一步闡明冷卻灘羊肉肌肉中PI3K/AKT代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制提供了方向。從應(yīng)用的角度來(lái)看，建議控制PI3K活性在適當(dāng)水平以維持冷卻灘羊肉的代謝穩(wěn)態(tài)。