胡麗筠，馬旭華，李亞蕾，羅瑞明

（寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏 銀川 750000）

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是分子質量為10～110 ku的一種多基因超家族，是細胞內最主要的分子伴侶，它與其他蛋白可逆地相互作用，避免非特異性蛋白的聚集，幫助細胞蛋白獲得其天然結構以維持細胞穩(wěn)態(tài)，并協助這些蛋白的形成、折疊和跨膜運輸[1]。在眾多HSPs中，對HSP60/70/90家族的研究最多。HSP70作為一種保守的分子伴侶蛋白，在原核生物和真核生物中普遍表達，具有保守的結構特征，在蛋白質質量控制和蛋白質折疊中充當管家，以防止蛋白質積累和修復錯誤折疊的蛋白質[2]。多年來，有關HSP70的研究多集中在人和鼠的疾病方面，而在家畜中的研究尚不充分。楊莉等[3]采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應和酶聯免疫吸附測定方法檢測發(fā)現冷應激后湖羊肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結組織中HSP70mRNA表達量顯著增加。最近研究發(fā)現HSP70家族的蛋白質與肉嫩度有關。Sugimoto等[4]在荷斯坦-弗里西亞牛的膈肌中發(fā)現，HSP70的缺乏導致能量相關的蛋白質發(fā)生錯誤折疊，可能引起蛋白質聚集和肌肉纖維變性。此外，Crawford等[5]的研究表明，熱休克伴侶蛋白HSP90和HSP70是肌原纖維各個組裝步驟中所必需的。Thakur等[6]的研究表明HSP70等熱休克蛋白通過幫助維持蛋白質正常的結構和功能對肌肉蛋白質穩(wěn)態(tài)起重要作用。這些研究表明HSP70有利于維持骨骼肌的結構、超微結構和功能特性。

牛HSPA6作為HSP70家族中一個特征不佳的成員，是哺乳動物中部分保守的可誘導蛋白，在嚴重的細胞應激后被誘導，其中熱應激不僅不利于動物的生產和繁殖，而且嚴重損害畜種的健康。HSPA6作為一種不同于其他基因的新型HSP70基因，在許多生物體中都有表達[7]。HSPA6的同源基因已在棉頭狨猴、豬、牛和人類中發(fā)現[8-10]，并且已經確定牛和山羊的HSPA6在熱應激條件下具有更高的表達[7-8]，這可能是因為嚴重的壓力條件導致HSPA6進化為維持生物基本功能的基因[11]。因此，研究HSPs相關基因、提高熱應激穩(wěn)定性是畜產品發(fā)展亟待解決的問題。

牛作為我國畜牧業(yè)重要的家畜，其肉營養(yǎng)豐富，蛋白含量高。嫩度和顏色作為兩個重要的牛肉品質特征，與消費者滿意度直接相關。HSPs具有抗凋亡的功能，影響宰后肉的品質，其表達量的差異與肉的質量特征如嫩度、顏色和持水能力有重要關系[12]。HSPA6作為HSP70家族成員之一，與宰后貯藏期間肉品質的具體作用機制尚不明確，且其與牛肉品質相關性的研究較少。本研究利用多重生物信息學方法，研究牛HSPA6蛋白結構和功能特性對宰后肉品質的影響，旨在進一步為其功能機制提供思路和依據。

1 方法

1.1 牛HSPA6蛋白序列的獲得與系統(tǒng)進化樹構建

使用牛HSPA6蛋白登錄號信息（F1MWU9）是通過使用關鍵詞“HSPA6+Bos taurus”搜索UniProt（https://www.uniprot.org/）蛋白質數據庫獲得的。以該蛋白序列搜索不同生物的同源蛋白序列。山羊（A0A452G2N5）、長江江豚（A0A341C0G7）、馬（A0A3Q2HF81）、羊駝（A0A6I9IS04）、人（P17066）、北方白頰長臂猿（G1SBW1）、棉頂羅望子（Q9N1U2）、豚鼠（A0A286XYQ5）、豬（Q04967）、三行地松鼠（I3ND33）、黑鱈魚（A0A6I9N6M6）、犬蛔蟲（A0A0B2VDJ4）的基因組庫，并獲得不同物種中HSPA6的同源蛋白質序列。使用Mega 11.0軟件中的Meighbor-Joining（NJ）方法構建系統(tǒng)進化樹，并將Bootstrap分析重復數設置為1000。

1.2 牛HSPA6理化性質分析方法

利用ExPASy數據分析系統(tǒng)的ProtParam工具（http://www.expasy.org/tools/protparam）對HSPA6的分子式、分子質量、酸堿性、理論等電點、帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）、帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）、親水性總平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）、不穩(wěn)定性指數（II）及脂肪族指數等理化性質進行分析。牛HSPA6蛋白氨基酸序列從NCBI中獲得。

1.3 牛HSPA6蛋白親疏水區(qū)域、蛋白質跨膜域及信號肽分析方法

通過ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析牛HSPA6親疏水性；通過TMHMM Server 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0）分析H S PA 6 是否存在跨膜現象及其區(qū)域；通過SignalP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）分析HSPA6信號肽及切割位點。

1.4 牛HSPA6結構域、磷酸化位點及糖基化位點分析方法

通過NCBI網站中的Consered Domains工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析預測牛HSPA6蛋白保守域；通過NetPhos3.1 Server（http://www.geneinfinity.org/sp/sp_proteinptmodifs.html）分析牛HSPA6表達時是否可能發(fā)生磷酸化修飾；通過NetNGlyc（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）預測牛HSPA6蛋白的N-糖基化位點。

1.5 牛HSPA6亞細胞定位預測

使用PSORTII軟件（https://wolfpsort.hgc.jp/）預測牛HSPA6的亞細胞定位。

1.6 牛HSPA6蛋白高級結構預測

通過SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測牛HSPA6蛋白的二級結構。通過SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）預測牛HSPA6蛋白的三級結構。

1.7 牛HSPA6蛋白互作網絡預測

通過STRING數據庫（https://cn.string-db.org/），最低要求互動分數設置為高置信度值，即0.700，要顯示的最大交互蛋白數量控制在10 個以內，構建牛HSPA6的互作蛋白網絡。

2 結果與分析

2.1 牛HSPA6蛋白進化關系分析

構建牛、山羊、長江江豚、馬、羊駝、人、北方白頰長臂猿、豚鼠、豬等多種生物的HSPA6蛋白的同源序列的系統(tǒng)進化樹如圖1所示。由圖1可知，牛與羊、長江江豚等哺乳動物處于同一分支，它們的HSPA6蛋白的氨基酸序列有很大的相似性。

圖1 牛HSPA6蛋白與其他物種同源蛋白質序列比對系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Bos taurus and other species based on sequence homology of HSPA6 protein

2.2 牛HSPA6蛋白理化性質分析

通過EXPASY在線軟件對HSPA6的理化性質進行預測分析。牛HSPA6蛋白理化性質如表1所示。該蛋白分子質量為70570.64 u，理論等電點為5.66，表明該蛋白質是酸性蛋白。

表1 HSPA6蛋白理化性質Table 1 Physicochemical properties of HSPA6 protein

2.3 牛HSPA6蛋白親疏水區(qū)域、蛋白質跨膜域及信號肽分析

分析牛HSPA6蛋白氨基酸序列的親水、疏水區(qū)域，其中正值表示該蛋白為疏水性蛋白，值越大疏水性越強；負值表示鈣蛋白為親水性蛋白，數字越大親水性越強，雙性氨基酸范圍為0.5～-0.5。由圖2可得，牛HSPA6蛋白的親水性最強位點位于第591位谷氨酸（Glu）、疏水性最強位點位于第393位天冬氨酸（Asp），分值分別為-3.422、2.211；同時HSPA6蛋白質序列中大多數氨基酸的分值為負，則可知親水性區(qū)域多于疏水性區(qū)域，親水性預測分析進一步證實GRAVY值分析。

圖2 牛HSPA6親水性分析Fig.2 Hydrophilicity analysis of bovine HSPA6 protein

馬旭華等[13]研究發(fā)現秦川牛背最長肌在宰后成熟初期，HSPA6蛋白僅發(fā)生少量降解，致使系水力增強。且有研究發(fā)現在更嫩的肉樣中，HSP70含量較高[14]。HSPA6蛋白作為HSP70的一種，由于其為親水性蛋白，自身含量的增加會導致水分含量增加，從而對牛肉嫩度產生影響。已有發(fā)現指出肉的品質特征如嫩度、顏色和持水能力與HSPs表達量的差異有關[12]。這些研究都進一步說明了牛HSPA6蛋白作為親水性蛋白，對牛肉嫩度產生影響。

通過TMHMM Server 2.0針對牛HSPA6進行跨膜域預測，如圖3所示。預測結果顯示，HSPA6未含有跨膜信號，不存在由胞外向胞內的跨膜段，皆呈膜外螺旋狀，故不屬于跨膜蛋白。通過SignalP 5.0對牛HSPA6蛋白進行預測，結果如圖4所示。預測結果顯示，Sec/SPI（SP）概率＜0.003，數值較低，未觀察到信號肽區(qū)域。由于信號肽是一種蛋白質分泌的標記，這與Pockley等[15]報道的HSP60和HSP70在細胞外環(huán)境中存在這一結果不一致，推測是牛HSPA6蛋白可能主要在細胞內發(fā)揮作用，在細胞外環(huán)境分泌較少，信號肽含量過低，故未觀察到信號肽區(qū)域。

圖3 牛HSPA6跨膜結構預測Fig.3 Transmembrane structure prediction of bovine HSPA6 protein

圖4 牛HSPA6信號肽預測Fig.4 Signal peptide prediction of bovine HSPA6 protein

2.4 牛HSPA6蛋白結構域、磷酸化位點及糖基化位點分析

牛HSPA6蛋白包含N-端核苷酸結合域（nucleotide binding domain，NBD）和C-端底物結合域（substratebinding domain，SBD）兩個重要且獨立的結構域。NBD又稱為ATP酶結構域，約44 kDa，可以結合并水解ATP；SBD稱為肽結合域，約28 kDa，具有蛋白酶敏感位點的中間域和結合延伸的多肽。牛HSPA6蛋白的兩個結構域可以進行變構耦合，NBD和SBD之間有一個靈活的含結構域的蛋白酶敏感位點，在變構通訊中發(fā)揮著重要作用[16-17]。HSPA6經歷ATP水解和核苷酸交換循環(huán)，使底物結合和釋放，與此同時HSPA6保持并發(fā)揮其一系列生理功能[18]。SBD與其伴侶蛋白的結合能力比NBD結合ATP的能力薄弱；但當二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）與NBD相結合時，其構象的變化可以提高SBD與其伴侶蛋白的親和力[19]。通過NCBI中Consered Domains對預測的HSPA6蛋白質保守域進行分析，由圖5可知，其氨基酸序列具有HSP70家族特有的結構，即NBD與SBD。

圖5 牛HSPA6蛋白結構域預測Fig.5 Domain prediction of bovine HSPA6 protein

馬旭華等[13]研究發(fā)現宰后成熟期間秦川牛背最長肌中HSPA6表達量呈顯著下降趨勢，并與ATP、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）含量呈顯著正相關，結果表明HSPA6可能通過利用自身結構域具有ATP-ADP轉換活性機制，執(zhí)行了宰后成熟期間秦川牛肉蛋白的翻譯后修飾，蛋白質翻譯后修飾促使組織中各種生化反應利用能量導致ATP的降解，且降解產物ADP、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量均隨成熟時間延長呈顯著下降趨勢，同時，反映組織細胞中氧化還原和能量變化狀態(tài)的NADH含量呈下降趨勢，發(fā)生了與活體不同的變化。這一研究說明HSPA6蛋白的NBD和SBD結構域通過影響宰后肉品中能量物質，進而影響宰后肉品品質。

為了對牛HSPA6的作用機制作進一步分析，通過NetPhos3.1 Server分析HSPA6磷酸化位點，如圖6所示，可以看出蛋白質序列中存在多個可能發(fā)生磷酸化的位點。從預測位點中篩選出11 個得分＞0.900的位點，且主要分布在NBD及SBD結構域，如表2所示（預測得分在0.000～1.000，＞0.500表示可能發(fā)生磷酸化，越接近1，就越可能發(fā)生磷酸化）。根據NetPhos3.1預測結果結果可知，牛HSPA6蛋白發(fā)生磷酸化最多的氨基酸為絲氨酸（Ser）。Ser通過蛋白質的異構途徑進行磷酸化，激活蛋白質的酶活性；除了激活蛋白質的酶活性外，酪氨酸還有一個重要的作用，就是通過形成多個蛋白的復合體，構成細胞信號傳遞和轉導的根源性機制[20]。

表2 HSPA6多肽鏈中可能的磷酸化位點Table 2 Potential phosphorylation sites in HSPA6 peptide chains

圖6 牛HSPA6蛋白磷酸化位點預測Fig.6 Phosphorylation site prediction of bovine HSPA6 protein

越來越多的證據表明，HSP70受大量翻譯后修飾調節(jié)，也稱為伴侶代碼，包括乙?；⒘姿峄虯DP-核糖基化等[21-22]。通過磷酸化位點預測，表明HSPA6蛋白也進行磷酸化修飾，這有助于更加深入了解HSPA6的磷酸化水平及其在機體中的作用機理。Beltrao等[23]已經鑒定出11 個物種的HSP70亞型上的磷酸位點共313 個，富集發(fā)現這些位點大多數位于NBD和SBD結構域附近，這與本研究結果一致。通過磷酸化位點預測發(fā)現HSPA6能夠催化磷酸基團從磷酸供體向磷酸供體遷移，進而調整和控制蛋白質的活力與功能等各個環(huán)節(jié)。因此，HSPA6可能通過宰后牛肉中所發(fā)生的蛋白質翻譯后修飾進一步調控蛋白質結構、功能活性及蛋白質間的相互作用，這些變化又進一步影響并導致細胞凋亡和蛋白水解等變化，最終影響嫩度、持水性等肉品質[24]。已有研究發(fā)現HSPA6可以通過抑制相關信號通路的磷酸化和絲裂原活化蛋白激酶途徑發(fā)揮作用[25]。

牛HSPA6蛋白的N-糖基化位點預測結果如圖7所示。結果顯示，該蛋白存在4 個可能的N-糖基化位點，最有可能發(fā)生N-糖基化的位點位于第33位殘基上，概率為0.6172。蛋白質N-糖基化修飾在蛋白質翻譯后修飾中具有關鍵作用[26]?；趯ΡＪ亟Y構域、可能磷酸化位點及N-糖基化預測的綜合分析，發(fā)現發(fā)揮生物學作用的結構域位于4～379位堿基中，而磷酸化位點及N-糖基化激活位點分布的后端堿基可能是蛋白質進行修飾的主要部分。

圖7 牛HSPA6蛋白N-糖基化修飾位點預測Fig.7 Prediction of N-glycosylation sites of bovine HSPA6 protein

2.5 牛HSPA6蛋白亞細胞定位預測分析

通過PSORT II Prediction分析牛HSPA6亞細胞定位。結果顯示，HSPA 6 蛋白最有可能為細胞質蛋白（14.5%），其次可能為細胞質和細胞核蛋白（12.5%）。說明HSPA6在細胞質中具有重要生理功能。同時通過其序列發(fā)現，HSPA6的C-末端具有特征構象EEVD，該特征構象用于進行細胞質定位。兩者預測結果可以說明HSPA6最有可能是胞質蛋白，且主要在細胞質中發(fā)揮生物作用。且已有數據表明HSPA6蛋白的細胞定位主要在胞質溶膠和胞外外泌體中[19]。此外，也有報道指出其他位置如中心粒，以及COP9信號體和血液微粒共定位的含核蛋白復合物中都有HSPA6[27]。馬旭華等[13]利用4D-非標定量蛋白質組學技術對篩選出的秦川牛HSPA6蛋白及其相關蛋白作基因本體論（Gene Ontology，GO）分析研究發(fā)現，此類相關蛋白主要在細胞質中發(fā)揮生物作用。以上發(fā)現都說明牛HSPA6蛋白最有可能在細胞質中發(fā)揮作用。

2.6 牛HSPA6蛋白的高級結構預測分析

通過在線軟件SOPMA分析牛HSPA6蛋白的二級結構，如圖8所示，該蛋白二級結構主要由40.38%的α-螺旋、7.20%的β-轉角、33.65%的無規(guī)卷曲和18.78%延伸鏈構成。該蛋白質中α-螺旋及β-轉角總比例為47.58%，說明蛋白質的二級結構較穩(wěn)定，其中α-螺旋及無規(guī)卷曲占比最大。模型構建的結果用Ramachandran plot表示，如圖9所示。結果顯示，通過模型構建所得蛋白的三維結構中，92.77%的Φ角和Ψ角均處于Ramachandran plot中的合理區(qū)域，確保了其三維結構的正確性。圖10為通過SWISS-MODEL采用同源建模法預測的蛋白牛HSPA6的三級結構及相關參數。該蛋白質三級結構符合HSP70家族特征，NBD及SBD均被折疊為球狀結構，其間由任意的卷曲鏈進行連接。并且預測的結果表明GMQE為0.73，QMEAN為-1.07，覆蓋率82.92%，序列相似性55.0%，顯示該模型預測結果合理。

圖8 牛HSPA6蛋白二級結構預測Fig.8 Secondary structure analysis of bovine HSPA6 protein

圖9 牛HSPA6蛋白三級結構Ramachandran plots圖Fig.9 Ramachandran plots of tertiary structure of bovine HSPA6 protein

圖10 牛HSPA6蛋白三級結構預測Fig.10 Tertiary structure analysis of bovine HSPA6 protein

通過高級結構預測表明牛HSPA6蛋白是一種結構相對穩(wěn)定的蛋白質。結合理化特性預測結果，都說明HSPA6為穩(wěn)定性蛋白質。Hageman等[28]發(fā)現HSPA6可能已經進化出在極端壓力條件下維持穩(wěn)定的關鍵功能。Picard等[29]表明HSP70是在正常細胞生長期間以及在病理生理條件下維持細胞完整性的最重要的HSPs之一。馬旭華等[13]研究發(fā)現宰后成熟初期HSPA6僅發(fā)生少量降解，這可能與其自身結構和功能具有穩(wěn)定性有關，因而能夠在宰后初期較好地執(zhí)行其生理功能，抑制細胞凋亡，對肌肉結構蛋白降解程度起反向調控作用。這些研究中HSPA6蛋白在非正常環(huán)境條件下仍保持其生理功能，這與其自身結構和功能的穩(wěn)定性密不可分。

2.7 牛HSPA6蛋白質互作網絡分析

通過STRING對牛HSPA6蛋白進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建，以獲取其潛在蛋白質的交互作用，如圖11所示。表3為牛HSPA6蛋白相互作用的蛋白質及可能性預測得分。結果顯示，聚類系數：0.814；PPI富集P值：1.29×10-11；HSPA6蛋白可能與BAG1、DNAJA4、DNAJB1、DNAJC2等蛋白相互作用。GO富集分析表明，牛HSPA6互作基因主要參與腺苷酸交換因子活性、ATP酶調節(jié)活性、伴侶綁定等分子功能；京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析可以看出，HSPA6主要參與內質網中的蛋白質加工。參與的反應組途徑有HSF1介導的熱休克反應的調節(jié)、類固醇激素受體的HSP90伴侶循環(huán)及細胞對壓力的反應等。

表3 與牛HSPA6蛋白相互作用的蛋白質及可能性預測得分Table 3 Proteins interacting with bovine HSPA6 protein and predicted likelihood scores

圖11 牛HSPA6蛋白相互作用預測Fig.11 Putative interaction network of bovine HSPA6 protein

分析牛HSPA6蛋白互作網絡，發(fā)現DNAJB1、DNAJC2及DNAJC7都屬于HSP40家族成員。HSP40通過HSP70的NBD和SBD的C端部分與HSP70相互作用，與HSP70/HSP90組織蛋白（HSP70-HSP90 organizing factor，HOP）競爭，且HSP70上的磷酸化位點可以促進其與HSP40相互作用，并幫助這種伴侶蛋白達到適合HOP結合的構象，之后被共同伴侶蛋白取代[30-31]。除此之外，還發(fā)現了HSP110家族成員HSPH1，有報道顯示，HSP110同樣可以和HSP70相互作用[32]。通過蛋白互作網絡發(fā)現的HSP40及HSP110家族成員，表明HSPA6在參與牛的熱應激反應過程中，可能會與這些成員以聚合體的形式存在，其上的磷酸化等位點在該過程中發(fā)揮重要作用。通過進一步的GO富集發(fā)現，牛HSPA6互作基因主要參與腺苷酸交換因子活性、ATP酶調節(jié)活性、伴侶綁定等分子功能，通過影響ATP等能量物質合成過程，導致肌細胞中能量物質的改變，進而改變肉的品質[33]。KEGG通路分析預測基因主要參與內質網中的蛋白質加工，這與牛HSPA6亞細胞定位預測以及含有EEVD的結果相吻合，結果都說明該蛋白主要在細胞質中發(fā)揮生物作用。HSPA6互作蛋白網絡為深入探討宰后應激及分子機制對肉品質的影響提供了可靠的線索。

3 結論

本實驗通過構建牛HSPA6蛋白系統(tǒng)進化樹以及進行多重生物信息學分析，得到牛HSPA6蛋白的結構特征和功能特性。牛HSPA6蛋白是一種結構和功能特性穩(wěn)定的酸性親水性蛋白，這使得它能夠在應激反應過程中保持并發(fā)揮其生物學功能以及對牛肉品質（尤其是嫩度）起作用；并且含有NBD和SBD兩個與ATP-ADP活性轉化有關的結構域，GO富集到的互作基因也主要參與腺苷酸交換因子活性、ATP酶調節(jié)活性等分子功能，說明該蛋白通過調節(jié)ATP等能量物質的合成，影響宰后肉品的蛋白質翻譯后修飾，進而影響肉的品質。蛋白功能預測表明該蛋白含有磷酸化位點，大多數位于NBD和SBD結構域附近，結合蛋白互作網絡進行分析，其上的磷酸化位點促進HSPA6蛋白的聚合，使其與互作蛋白形成聚合體，可能參與調節(jié)牛溫度應激反應過程，并且以上這些反應主要在細胞質中進行。本研究對牛HSPA6蛋白結構特征和功能特性進行分析，為深入研究牛應激反應及牛肉品質變化機制提供理論基礎。