楊逸鑫 王彥權(quán) 彭芳

[摘要]?目的?探討肝龍膠囊對Balb/c裸鼠腋下移植瘤的影響。方法?將人肝癌敏感株BEL-7402接種于裸鼠腋下造模，造模成功后將其分為模型組、索拉非尼組、CII-3組、脫脂膏組、肝龍膠囊高、中、低劑量組，正常裸鼠為空白組，連續(xù)給藥14d。比較各組的抑瘤率、臟器指數(shù)、生化指標、缺氧微環(huán)境相關(guān)蛋白及其mRNA表達水平。結(jié)果?各藥物治療組均能抑制腫瘤生長，其中肝龍膠囊中劑量組的平均抑瘤率最高；與模型組相比，各藥物治療組裸鼠的心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、肺臟指數(shù)均有所升高，脾臟指數(shù)均有所下降，但多數(shù)變化不大；各項生化指標顯示，肝龍膠囊安全性良好，并未出現(xiàn)明顯的組織損傷；索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組裸鼠的低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible?factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）和血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular?endothelial?growth?factor?receptor?2，VEGFR2）的mRNA表達均顯著低于模型組（P<0.05）；免疫組織化學結(jié)果顯示，各藥物治療組的VEGFR2、HIF-1α、VEGF、Ki-67和CD31蛋白表達均表現(xiàn)出不同程度的抑制，其中以索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組及CII-3組的抑制作用較強。結(jié)論?肝龍膠囊可有效抑制Balb/c裸鼠腋下移植瘤的生長，并下調(diào)移植瘤中缺氧微環(huán)境相關(guān)蛋白及其mRNA表達水平。

[關(guān)鍵詞]?肝龍膠囊；肝癌；腋下移植瘤；美洲大蠊

[中圖分類號]?R965.2??????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.04.018

Effect?of?Ganlong?capsule?on?axillary?graft?tumour?in?Balb/c?nude?mice

YANG?Yixin1，2，?WANG?Yanquan1，2，?PENG?Fang1，2

1.College?of?Pharmacy，?Dali?University，?Dali?671000，?Yunnan，?China;?2.Yunnan?Provincial?Key?Laboratory?of?Entomological?Biopharmaceutical?R&D，?Dali?671000，?Yunnan，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?Ganlong?capsule?on?axillary?graft?tumour?in?Balb/c?nude?mice.?Methods?BEL-?7402，?a?human?hepatocellular?carcinoma?sensitive?strain，?was?inoculated?into?the?armpit?of?nude?mice?for?modeling.?After?successful?modeling，?mice?were?divided?into?model?group，?sorafenib?group，?CII-3?group，?degreasing?cream?group，?and?Ganlong?capsule?high-dose，?medium-dose?and?low-dose?groups，?and?normal?nude?mice?were?included?in?blank?group.?All?groups?were?given?continuous?administration?for?14?days.?The?tumor?inhibition?rate，?organ?index，?biochemical?index，?anoxic?microenvironment?related?proteins?and?their?mRNA?expression?levels?were?compared?among?all?groups.?Results?All?drug?treatment?groups?could?inhibit?tumor?growth，?and?the?average?tumor?inhibition?rate?was?the?highest?in?Ganlong?capsule?medium-dose?group.?Compared?with?the?model?group，?the?heart?index，?kidney?index，?liver?index?and?lung?index?of?nude?mice?in?all?drug?treatment?groups?were?increased，?and?the?spleen?index?were?decreased，?but?most?of?the?changes?were?little.?Various?biochemical?indexes?showed?that?Ganlong?capsule?was?safe?and?did?not?cause?obvious?tissue?damage.?The?mRNA?expressions?of?hypoxia-inducible?factor-1α?（HIF-1α），?vascular?endothelial?growth?factor?（VEGF）?and?vascular?endothelial?growth?factor?receptor?2?（VEGFR2）?in?sorafenib?group?and?Ganlong?capsule?medium-dose?group?were?significantly?lower?than?those?in?model?group?（P<0.05）.?Immunohistochemical?results?showed?that?all?drug?treatment?groups?showed?different?degrees?of?inhibition?on?VEGFR2，?HIF-1α，?VEGF，?Ki-67?and?CD31?protein?expressions，?among?which?sorafenib?group，?Ganlong?capsule?medium-dose?group?and?CII-3?group?had?stronger?inhibitory?effects.?Conclusion?Ganlong?capsule?can?effectively?inhibit?the?growth?of?axillary?graft?tumour?in?Balb/c?nude?mice，?and?down-regulate?the?expression?level?of?hypoxic?microenvironment?related?protein?and?their?mRNA?in?the?graft?tumor.

[Key?words]?Ganlong?capsule;?Hepatocellular?carcinoma;?Axillary?graft?tumor;?Periplaneta?Americana

肝細胞癌是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴重威脅我國人民的生命和健康[1-3]。2020年，我國肝癌年新發(fā)病例達41萬人，占全球45.3%，死亡39.1萬人，占全球47.1%[4-6]。乙型肝炎病毒和（或）丙型肝炎病毒感染、過度飲酒、非酒精性脂肪性肝炎、其他原因引起的肝硬化及有肝癌家族史者均為肝癌高危人群[1]。乙型肝炎是肝癌重要的發(fā)病因素，肝纖維化可演變?yōu)槁愿斡不?，最終導致肝癌發(fā)生。肝龍膠囊是國家藥品監(jiān)督管理局（National?Medical?Products?Administration，NMPA）批準的治療乙型肝炎的二類中藥新藥，由美洲大蠊提取物研制而成，其主要活性成分為黏氨糖，具有疏肝理脾、活血解毒及抗肝纖維化作用[7]。肝癌的發(fā)生與慢性肝炎、肝硬化有關(guān)。研究顯示，同樣來源于美洲大蠊的兩種粗提物（CII-3和脫脂膏）對惡性腫瘤有著不錯的療效，由此推測肝龍膠囊可能在治療肝癌方面具有同樣的效果。本研究擬觀察肝龍膠囊是否具有治療肝癌的作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1??材料與方法

1.1??實驗動物、細胞、主要藥品及器材

7～9周SPF級Balb/c裸鼠，體質(zhì)量18～22g，64只，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：430727200101104518。人肝細胞癌敏感細胞株BEL-7402（MXC050）由上海美軒生物科技有限公司提供。美洲大蠊粗提物脫脂膏、美洲大蠊粗提物CII-3由大理大學藥學院提供；肝龍膠囊（批準文號：國藥準字Z20050113，生產(chǎn)單位：昆明賽諾制藥股份有限公司，規(guī)格：每粒重0.3g，含美洲大蠊提取物0.15g）；索拉非尼（批號：1017R021）購自北京索萊寶科技有限公司；尿素氮測試盒、超氧化物歧化酶試劑盒、小鼠血清肌酐試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；聚合酶鏈反應（polymerase?chain?reaction，PCR）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR熒光試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2??實驗方法

1.2.1??藥液配制??肝龍膠囊、CII-3、脫脂膏用生理鹽水稀釋至實驗所需濃度并過濾后使用；索拉非尼與羧甲基纖維素鈉、甘油混合，配制成濃度為3mg/ml的索拉非尼混懸膠漿備用。

1.2.2??裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組給藥??Balb/c裸鼠適應性飼養(yǎng)1周后，于左前肢腋下注射含有5×107個BEL-7402細胞株的細胞懸液，其后放置SPF級動物房飼養(yǎng)1周，直至裸鼠腋下腫瘤組織體積達到100mm3。將造模成功的裸鼠分為模型組、索拉非尼組（給予索拉非尼30mg/kg）、CII-3組（給予CII-3?200mg/kg）、脫脂膏組（給予脫脂膏200mg/kg）、肝龍膠囊高、中、低劑量組（分別給予肝龍膠囊360mg/kg、180mg/kg、90mg/kg），同時選取正常裸鼠作為空白組，每組各8只，造模成功后第7天開始按上述給藥劑量進行灌胃給藥（0.1ml/10g），模型組和空白組給予等體積生理鹽水，均連續(xù)給藥14d。

1.2.3??對裸鼠腋下移植瘤抑瘤率及臟器指數(shù)的影響??實驗結(jié)束后頸椎脫位處死裸鼠，摘取心、肝、脾、肺及腎，剝離腋下移植瘤，檢測臟器指數(shù)及抑瘤率[8]。抑瘤率（%）=（模型組瘤重–給藥組瘤重）/模型組瘤重×100%。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.2.4??對裸鼠生化指標的影響??實驗結(jié)束后眼眶靜脈叢取血，按試劑盒說明書檢測各組裸鼠的肌酐清除率、尿素氮、轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶水平。

1.2.5??對裸鼠腋下移植瘤缺氧微環(huán)境相關(guān)蛋白及其mRNA表達水平的影響??實時熒光定量PCR法檢測各組裸鼠腋下移植瘤腫瘤組織缺氧微環(huán)境中低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible?factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular?endothelial?growth?factor?receptor?2，VEGFR2）mRNA表達水平；免疫組織化學染色法檢測各組裸鼠腋下移植瘤缺氧微環(huán)境中相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ki-67、CD31的表達水平。

1.3??統(tǒng)計學方法

應用SPSS?18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗。數(shù)據(jù)圖使用Graphpad?Prism?8軟件進行繪制。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2??結(jié)果

2.1??對裸鼠腋下移植瘤生長的影響

與模型組比較，不同藥物處理后裸鼠的腫瘤瘤重均呈下降趨勢，且索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組的腫瘤瘤重均顯著低于模型組（P<0.05），肝龍膠囊中劑量組的平均抑瘤率最高，見表1。

2.2??對裸鼠腋下移植瘤臟器指數(shù)的影響

與模型組相比，各藥物治療組裸鼠的心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、肺臟指數(shù)均有所升高，脾臟指數(shù)均有所下降，多數(shù)變化不大，見表2。

2.3??對裸鼠生化指標的影響

與空白組相比，模型組和各治療組裸鼠的尿素氮、肌酐水平均顯著降低（P<0.05）；除脫脂膏組外，各治療組裸鼠的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著高于空白組（P<0.05）；除肝龍膠囊低、高劑量組外，各治療組裸鼠的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著低于空白組和模型組（P<0.05），見表3。

2.4??對裸鼠腋下移植瘤組織缺氧微環(huán)境相關(guān)蛋白mRNA表達水平的影響

索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組和脫脂膏組裸鼠的HIF-1α?mRNA表達均顯著低于模型組（P<0.05）；索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組裸鼠的VEGF?mRNA和VEGFR2?mRNA表達均顯著低于模型組（P<0.05），見表4。

2.5??對裸鼠腋下移植瘤組織缺氧微環(huán)境相關(guān)蛋白表達的影響

免疫組織化學染色結(jié)果顯示：各藥物治療組對VEGFR2、HIF-1α、VEGF、Ki-67和CD31蛋白表達均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中以索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組及CII-3組的抑制作用較強，見圖1。

3??討論

腫瘤微環(huán)境成分復雜，包含多種細胞及其他非轉(zhuǎn)化型細胞，其特點是缺氧、低pH值和高還原性，其中缺氧是大多數(shù)實體瘤的典型特征[9-11]。腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境之間相互影響，在促進腫瘤細胞生長的同時也能抑制免疫細胞的活性[12]。

HIF-1α是腫瘤對缺氧適應性反應的重要觸發(fā)因素[13]。研究表明，HIF-1α在肝癌中高度表達，腫瘤組織缺氧越嚴重，HIF-1α表達越高[14-15]。HIF-1α可通過激活下游基因促進腫瘤細胞的生長且抑制細胞凋亡，其在肝癌和基質(zhì)形成中起重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

VEGF的表達需要HIF-1α的激活，即使在缺氧的情況下也是如此[16]。VEGFR是特異性結(jié)合VEGF的高親和力受體，其亞型VEGFR2在血管內(nèi)皮的形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用；它可抑制內(nèi)皮細胞凋亡，在一定程度上增加血管通透性[17]。研究表明，VEGF與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，肝癌組織中VEGF陽性表達率顯著高于其他相鄰或非相鄰的實質(zhì)組織[18]。

本研究結(jié)果顯示，各治療組在一定程度上均可抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長，提高臟器指數(shù)（除脾臟指數(shù)外），以索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組效果最好；各項生化指標顯示，肝龍膠囊安全性良好，并未出現(xiàn)明顯的組織損傷；索拉非尼組和肝龍膠囊低、中、高劑量組均可降低裸鼠腫瘤組織中HIF-1α、VEGF和VEGFR2?mRNA的表達量，其中以索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組效果顯著，提示索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組具有下調(diào)體內(nèi)上述3種缺氧微環(huán)境相關(guān)蛋白mRNA的能力。

免疫組織化學染色結(jié)果表明，與模型組相比，各治療組均可抑制裸鼠腋下移植瘤內(nèi)HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ki-67、CD31蛋白的表達；其中索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組及CII-3組對HIF-1α、VEGFR2、Ki-67蛋白表達的抑制作用效果較好；索拉非尼組對VEGF蛋白表達的抑制效果最優(yōu)；肝龍膠囊中劑量組和CII-3組對CD31蛋白表達的抑制效果較為顯著，且優(yōu)于索拉非尼組。

綜上，肝龍膠囊可有效抑制Balb/c裸鼠腋下移植瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡，且下調(diào)裸鼠移植瘤缺氧微環(huán)境相關(guān)蛋白及其mRNA的表達水平。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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