王磊 辛小敏 閆小燕 王秀敏

(安陽市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,河南 安陽 455000)

肝癌是全球常見惡性腫瘤之一,據(jù)報道每年肝癌新增病例高達840萬例〔1〕。肝內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肝癌治療的主要挑戰(zhàn),這是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后差、總體5年生存率低的主要原因〔2〕。因此,研究肝癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機制有助于開發(fā)新的肝癌治療方法。微小RNA(miRNA)是進化保守的非編碼RNA,其通過與靶mRNA互補序列結(jié)合發(fā)揮作用,參與細胞存活、細胞凋亡等廣泛細胞途徑〔3〕。miR-204-5p是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,研究指出長鏈非編碼RNA(LncRNA)KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物(KCNQ1OT)1通過下調(diào)miR-204-5p促進非小細胞肺癌細胞增殖和自噬、抑制細胞凋亡〔4〕。敲除Linc01234通過上調(diào)miR-204-5p誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡和生長阻滯,并抑制小鼠異種移植瘤形成〔5〕。miR-204-5p低表達已被證實與肝癌轉(zhuǎn)移、血管浸潤和晚期分期有關(guān)〔6〕,過表達miR-204-5p對肝癌細胞存活和化療耐藥具有抑制作用〔7〕,但miR-204-5p的上游調(diào)控機制并未闡明。本研究通過生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA脫氧鳥苷激酶反義RNA(DGUOK-AS)1與miR-204-5p存在靶向結(jié)合位點,推測DGUOK-AS1可能靶向miR-204-5p參與肝癌進展。本研究探討干擾DGUOK-AS1對肝癌細胞MHCC97-H增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1組織來源 收集2016年3月至2018年3月間在安陽市人民醫(yī)院確診并進行手術(shù)切除的43例肝癌患者的癌組織和相應(yīng)的癌旁組織(正常肝組織)。樣品收集后立即保存在液氮中。所有患者術(shù)前未接受任何治療。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者或其家屬知情同意。

1.2細胞和試劑 肝癌細胞MHCC97-H購于中科院上海細胞庫;第一鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購于北京天根生化公司;DGUOK-AS1小干擾RNA(si-DGUOK-AS1)及其陰性對照(si-NC)、miR-204-5p抑制物(inhibitor)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-204-5p模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC)購于上海吉瑪制藥公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶公司;Transwell小室購自美國康寧公司;抗兔IgG二抗及兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體購于上海賽信通公司。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測DGUOK-AS1和miR-204-5p表達 采用Trizol試劑從肝癌組織、癌旁組織中提取總RNA。第一鏈cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄,再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進行RT-qPCR分析。引物序列(5′-3′)為：DGUOK-AS1上游：TGCTCCCAGAACTCTAACCC,下游：CACCCACTCTTGAGCCACTT;GAPDH上游：CAG GAGGCATTGCTGATGAT,下游：GAAGGCTGGGGCT CATTT;miR-204-5p上游：CGAAGTTCCCTTTGTCA TCCT,下游：GTGCAGGGTCCGAGGTATTC;U6上游：GTGGACCGCACAAGCTCGCT;下游：TTGTTGAACGGCACTGTGTATAGCA;2-ΔΔCt法分析DGUOK-AS1和miR-204-5p相對表達量。

1.4細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 MHCC97-H細胞置于含5% CO2、37 ℃濕潤培養(yǎng)箱,用添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將對數(shù)期MHCC97-H細胞以2×105個/孔密度接種6孔板,按照Lipofectamine2000使用說明書將si-NC、si-DGUOK-AS1、si-DGUOK-AS1與anti-miR-NC、si-DGUOK-AS1與miR-204-5p inhibitor分別轉(zhuǎn)染MHCC97-H細胞,收集轉(zhuǎn)染48 h細胞,RT-qPCR分析轉(zhuǎn)染效果,隨后進行下一步實驗。實驗分組如下：si-NC組、si-DGUOK-AS1組、si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC組、si-DGUOK-AS1+miR-204-5p inhibitor組。

1.5集落形成實驗檢測細胞克隆能力 將各組細胞按照200個/孔接種6孔板,培養(yǎng)箱孵育約10 d,用甲醇固定集落10 min,再用0.5%結(jié)晶紫染色20 min。顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的集落數(shù)即為克隆形成數(shù)。

1.6流式細胞術(shù)分析凋亡和周期分布 周期檢測：用70%乙醇固定各組細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,用500 μl的PI/核糖核酸酶(RNase)染色緩沖液中重懸1×106個細胞,室溫下避光孵育15 min。流式細胞儀分析細胞周期分布。凋亡檢測：收集細胞,用預(yù)冷PBS緩沖液洗滌兩次。集合緩沖液調(diào)整細胞為1×106個/ml。然后分別加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和PI,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲 取200 μl含4×104個細胞接種到涂有(侵襲)或未涂(遷移)基質(zhì)膠的Transwell小室上腔中,下室加入500 μl含10%血清的培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)因子。培養(yǎng)箱孵育24 h后,70%甲醇固定Transwell膜下表面細胞,0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機選取3個視野進行細胞計數(shù),以平均值表示侵襲或遷移細胞數(shù)量。

1.8Western印跡分析Bax、Bcl-2、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達 放射免疫沉淀(RIPA)測定緩沖液裂解各組細胞,蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品,并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與兔抗人Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin及GAPDH抗體4 ℃孵育過夜,再將膜與二抗室溫孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色后,ImageJ軟件分析各條帶光密度值,目的蛋白表達量以其條帶和內(nèi)參蛋白條帶光密度值的比值表示。

1.9雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?含有或未含有miR-204-5p結(jié)合位點的DGUOK-AS1野生(WT)或突變型(MUT)熒光素酶載體由上海吉瑪制藥公司提供。將WT-DGUOK-AS1、MUT-DGUOK-AS1分別與有miR-204-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至MHCC97-H細胞,轉(zhuǎn)染48 h后雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定細胞相對熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1DGUOK-AS1和miR-204-5p在肝癌中的表達 肝癌組織中DGUOK-AS1表達量(5.15±0.33)較癌旁組織(1.00±0.15)顯著升高(t=75.073,P<0.05),而miR-204-5p表達量(0.16±0.02)較癌旁組織(0.99±0.12)顯著降低(t=44.739,P<0.05)。si-DGUOK-AS1組MHCC97-H細胞中DGUOK-AS1表達量較si-NC組顯著降低,而miR-204-5p表達量較si-NC組顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 DGUOK-AS1和miR-204-5p表達及干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H細胞周期和克隆形成的影響

2.2干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H增殖的影響 si-DGUOK-AS1組MHCC97-H細胞克隆形成數(shù)、S期細胞比例較si-NC組顯著減少,而G0-G1期細胞比例較si-NC組顯著升高(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H細胞周期、克隆形成(結(jié)晶紫染色)的影響

2.3干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H凋亡的影響 si-DGUOK-AS1組MHCC97-H細胞凋亡率、Bax蛋白表達量較si-NC組顯著升高,而Bcl-2蛋白表達量較si-NC組顯著降低(P<0.05),見圖2、圖3、表2。

圖2 干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H凋亡的影響

表2 干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H凋亡、遷移、侵襲及其蛋白表達的影響

2.4干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H遷移侵襲的影響 si-DGUOK-AS1組MHCC97-H細胞遷移和侵襲細胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達量較si-NC組顯著降低,而E-cadherin蛋白表達量較si-NC組顯著升高(P<0.05),見圖3、表2、圖4。

圖4 干擾DGUOK-AS1對MHCC97-H遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.5DGUOK-AS1靶向miR-204-5p 生物信息學(xué)軟件預(yù)測DGUOK-AS1的靶基因發(fā)現(xiàn)miR-204-5p與DGUOK-AS1之間存在特異性互補序列,見圖5。WT-DGUOK-AS1和miR-204-5p mimics共轉(zhuǎn)染后,MHCC97-H細胞相對熒光素酶活性較WT-DGUOK-AS1和miR-NC共轉(zhuǎn)染顯著降低(P<0.05);而MUT-DGUOK-AS1和miR-204-5p mimics共轉(zhuǎn)染后MHCC97-H細胞相對熒光素酶活性與MUT-DGUOK-AS1和miR-NC共轉(zhuǎn)染無顯著差異(P>0.05),見表3。

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-204-5p對干擾DGUOK-AS1處理的MHCC97-H遷移侵襲的影響 si-DGUOK-AS1+miR-204-5p inhibitor組MHCC97-H細胞遷移和侵襲細胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達量較si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC組顯著升高,而E-cadherin蛋白表達量較si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC組顯著降低(P<0.05),見圖6、表4。

圖6 抑制miR-204-5p對干擾DGUOK-AS1處理的MHCC97-H遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

表4 抑制miR-204-5p對干擾DGUOK-AS1處理的MHCC97-H遷移、侵襲的影響

2.7抑制miR-204-5p對干擾DGUOK-AS1處理的MHCC97-H增殖凋亡的影響 si-DGUOK-AS1+miR-204-5p inhibitor組MHCC97-H細胞克隆形成數(shù)、S期細胞比例、Bcl-2蛋白表達量較si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC組顯著升高,而G0-G1期細胞比例、凋亡率、Bax蛋白表達量較si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC組顯著降低(P<0.05),見圖3、圖7、表5、圖8。

圖7 抑制miR-204-5p對干擾DGUOK-AS1處理的MHCC97-H細胞周期和克隆形成(結(jié)晶紫染色)的影響

圖8 抑制miR-204-5p對干擾DGUOK-AS1處理的MHCC97-H細胞凋亡的影響

表5 抑制miR-204-5p對干擾DGUOK-AS1處理的MHCC97-H增殖凋亡的影響

3 討 論

研究證實,LncRNA是細胞增殖、周期分布、遷移、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬等細胞的基本調(diào)節(jié)劑,在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤進展中發(fā)揮作用〔8,9〕。本研究結(jié)果顯示,肝癌中DGUOK-AS1表達上調(diào)。功能缺失實驗說明,干擾DGUOK-AS1表達對肝癌細胞具有抗增殖作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟,上皮表型標(biāo)志蛋白E-cadherin缺失、間質(zhì)表型蛋白N-cadherin表達增加顯著促進腫瘤細胞遷移和侵襲〔10〕。本研究結(jié)果提示,干擾DGUOK-AS1可能通過抑制EMT進而抑制肝癌細胞遷移和侵襲,干擾DGUOK-AS1通過上調(diào)Bax蛋白表達、下調(diào)Bcl-2蛋白表達顯著促進MHCC97-H細胞凋亡。與本研究結(jié)論類似,文獻〔11,12〕證實,DGUOK-AS1在乳腺癌、宮頸癌中表達增加,敲低DGUOK-AS1可抑制宮頸癌細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡。表明DGUOK-AS1在肝癌中具有致癌中作用,而干擾DGUOK-AS1表達可降低肝癌細胞的惡性生物學(xué)行為并誘導(dǎo)細胞凋亡。

miR-204-5p在惡性腫瘤中的抑癌作用被廣泛報道。研究指出,骨肉瘤中miR-204-5p表達降低,過表達miR-204-5p導(dǎo)致細胞凋亡增加,遷移和侵襲能力下降〔13〕。miR-204-5p還顯著抑制食管鱗癌細胞增殖、侵襲和細胞周期,誘導(dǎo)細胞凋亡〔14〕。LncRNA DSCAM反義RNA1(DSCAM-AS1)通過下調(diào)miR-204-5p促進乳腺癌腫瘤生長〔15〕。敲減LncRNA顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞EMT進程、遷移、侵襲,其機制與上調(diào)miR-204-5p有關(guān)〔16〕。本研究證實,DGUOK-AS1與miR-204-5p的靶向關(guān)系,并揭示了DGUOK-AS1對miR-204-5p表達的負調(diào)控作用。已有文獻證實,肝癌組織、細胞中miR-204-5p表達降低,且過表達miR-204-5p顯著抑制肝癌細胞的增殖和克隆生成能力,而抑制miR-204-5p則增強肝癌細胞增殖和克隆生成能力〔17〕,說明靶向調(diào)控miR-204-5p可能是DGUOK-AS1在肝癌中發(fā)揮作用的途徑。本研究結(jié)果提示,DGUOK-AS1靶向miR-204-5p參與肝癌進展。

綜上,肝癌中DGUOK-AS1表達增加,干擾DGUOK-AS1通過靶向miR-204-5p可抑制肝癌細胞MHCC97-H增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細胞凋亡。DGUOK-AS1/miR-204-5p分子軸是肝癌治療的潛在靶點。