王怡晨 嚴(yán)燕雯 宋美慧 薛祥俊 周文廣 李玉權(quán) 齊玲 李光華 曾祥宗，

1大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（云南大理 671000）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院2消化病研究所，3血液病科（廣東清遠(yuǎn) 511518）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome， MDS）是一種起源于造血干細(xì)胞的異質(zhì)性髓系腫瘤，以骨髓無(wú)效造血、病態(tài)造血和高風(fēng)險(xiǎn)向急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）轉(zhuǎn)變?yōu)樘卣鳎?］。MDS 的總體2 年生存率約65%［2-3］。其中，20% ～ 30%患者會(huì)出現(xiàn)AML 轉(zhuǎn)化，此時(shí)治療難度比原發(fā)AML 還要高，中位生存期不到1年［4-5］。MDS 向AML 轉(zhuǎn)化涉及多種機(jī)制，如基因突變、染色體不穩(wěn)定性、表觀遺傳改變、免疫缺陷及骨髓微環(huán)境改變等，但其確切機(jī)制尚不明確［6-7］。近來(lái)，有文獻(xiàn)［7-8］報(bào)道與造血干細(xì)胞的自我更新及分化命運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在MDS 向急性白血病轉(zhuǎn)化中扮演著重要角色，如RUNX1、GATA2 等［9-10］。同源盒基因（homeobox gene，HOX）是調(diào)控造血干細(xì)胞增殖、分化的高度保守的同源域轉(zhuǎn)錄因子家族。其中，HOXB4 是調(diào)控造血干細(xì)胞自我更新的重要正向因素［11］。ANTONCHUK 等［12］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HOXB4 基因可以使得具有造血潛能和分化能力的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC）快速增殖。李琳等［13］發(fā)現(xiàn)，HOXB4 基因的表達(dá)水平與AML 患者腫瘤負(fù)荷存在正相關(guān)，高表達(dá)HOXB4 患者的化療效果差。然而，這些研究主要聚焦在正常造血干細(xì)胞的擴(kuò)增以及腫瘤化療耐藥上，關(guān)于HOXB4 基因在MDS 患者中的臨床意義既往少見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)MDS 患者骨髓樣本中HOXB4的表達(dá)水平，探討其在MDS疾病進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2021 年7 月至2023 年6 月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院（清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院）血液內(nèi)科診斷為MDS 患者49 例（MDS 組），其中男26 例，女23 例，年齡25 ～ 82 歲，中位年齡63 歲，按照WHO 2016 分型標(biāo)準(zhǔn)［14］分型。參照修訂版國(guó)際預(yù)后評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［15］（international prognostic scoring system-revised，IPSS-R）對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分，不伴原始細(xì)胞增多類型（none excess blasts， Non-EB）患者25 例，伴原始細(xì)胞增多類型（excess blasts，EB）患者24 例。納入同時(shí)期就診的35 例非惡性血液系統(tǒng)疾病患者（巨幼細(xì)胞性貧血24 例，缺鐵性貧血11 例）作為對(duì)照組（C 組），C 組中男16 例，女19 例，年齡24～85 歲，中位年齡59 歲。為進(jìn)一步探討HOXB4 基因的表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系，我們根據(jù)HOXB4 的中位表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中HOXB4 高表達(dá)組24 例，低表達(dá)組25 例，參照IPSS-R 對(duì)患者進(jìn)行評(píng)分，以4 分為界限劃分為相對(duì)低危組和相對(duì)高危組。本研究經(jīng)清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審查號(hào)：2023-研-135）且患者本人知情同意。

1.2 主要儀器及試劑Ficoll-Paque PLUS 淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)GE 公司），TRIzol 總RNA 提取試劑（美國(guó)Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國(guó)BIO-RAD 公司）；通過(guò)NCBI查找HOXB4 基因全序列，使用Primer premier 6軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。通過(guò)BLAST 比對(duì)合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。T100 梯度PCR 儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）和 CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)BIO-RAD 公司），Nano-Drop One 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛公司），全自動(dòng)數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)（德國(guó)ZEISS 公司）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離使用EDTA 抗凝的采血管采集患者骨髓液4 ～ 5 mL，F(xiàn)icoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RNA 的提取及cDNA 的合成TRIzol 法提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280處的吸光度值，記錄吸光度值在1.8 ～2.2 之間的樣本的RNA 濃度，進(jìn)行cDNA 的合成。逆轉(zhuǎn)錄按照試劑商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取500 ng RNA、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶、4 μL 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，dd H2O補(bǔ)齊至反應(yīng)體系20 μL。55 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。待反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)HOXB4表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。iTaq Universal SYBR Green Supermix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，總反應(yīng)體系20 μL，每一份標(biāo)本做3 個(gè)復(fù)孔用來(lái)檢測(cè)。在CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s 進(jìn)行40 次循環(huán)，擴(kuò)增完成后進(jìn)入溶解曲線程序：65 ℃ 60 s。待所有反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH 為內(nèi)參，對(duì)HOXB4基因的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。根據(jù)Cq 值來(lái)計(jì)算△Ct 值，基因表達(dá)水平根據(jù)公式△Ct = Ct（待測(cè)基因）-Ct （GAPDH）進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果最終以2-（ΔΔCt）值來(lái)代表基因的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，連續(xù)變量以±s表示，偏態(tài)分布資料以M（P25，P75）表示，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，分類變量以n（%）表示，采用Fisher 精確值檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDS 患者HOXB4 基因表達(dá)水平MDS 組骨髓中HOXB4 基因的mRNA 中位表達(dá)水平為3.30（1.61，7.80），C 組的HOXB4 基因的mRNA 中位表達(dá)水平為1.43（0.61，3.12），與C 組相比，MDS 患者骨髓中HOXB4 基因的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（Z = -3.307，P= 0.002）。

2.2 HOXB4 基因表達(dá)水平與患者臨床特征之間的關(guān)系HOXB4 基因高表達(dá)組白細(xì)胞的水平更低（P= 0.049），中性粒細(xì)胞水平有下降的趨勢(shì)（P= 0.064），兩組之間血紅蛋白濃度及血小板數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.342），見(jiàn)表2。

表2 MDS 患者的臨床特征Tab.2 Clinical characteristics of patients with MDS

2.3 HOXB4 的mRNA 表達(dá)水平與MDS 分型的關(guān)系HOXB4 高表達(dá)組患者具有較多的EB 類型（P＜ 0.01），見(jiàn)表3。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Non-EB 組患者HOXB4 基因的mRNA 中位表達(dá)水平為2.28（1.13，5.02），與C 組無(wú)差別（P＞ 0.05），而EB 組患者HOXB4 基因的mRNA 表達(dá)水平為6.45（1.77，10.89），相較于Non-EB 組患者（P＜ 0.01）和C 組（P= 0.001）均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 HOXB4 基因與MDS 分型的關(guān)系Tab.3 The relationship between HOXB4 gene and MDS classification 例（%）

2.4 HOXB4 表達(dá)水平與MDS 預(yù)后危險(xiǎn)分層的關(guān)系HOXB4 基因高相表達(dá)組有19 例（79.2%）評(píng)為相對(duì)高危組，而低表達(dá)組只有13 例（52%）評(píng)為相對(duì)高危組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表4。

表4 HOXB4 基因表達(dá)水平與MDS 患者預(yù)后的關(guān)系Tab.4 The relationship between HOXB4 gene expression level and prognosis of MDS patients例（%）

2.5 HOXB4 基因表達(dá)水平與白血病轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)有10 例已進(jìn)展至AML 階段，其中8 例（33.30%）來(lái)自于HOXB4 基因高表達(dá)組，2 例（8%）來(lái)自于HOXB4 基因低表達(dá)組，HOXB4 基因高表達(dá)組患者的白血病轉(zhuǎn)化率明顯高于低表達(dá)組（P＜ 0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

MDS 是一組起源于造血干細(xì)胞的高度異質(zhì)性的髓系惡性腫瘤，不同患者之間的臨床表現(xiàn)相差很大，對(duì)于IPSS-R 評(píng)分為極低危的患者，臨床可僅表現(xiàn)為輕度血細(xì)胞減少，中位生存期可長(zhǎng)達(dá)9 年，而評(píng)分為極高危的患者則表現(xiàn)為嚴(yán)重的血細(xì)胞減少、快速向AML 轉(zhuǎn)化，中位生存期不到1 年。目前研究［6-7］表明，由于造血干細(xì)胞本身遺傳損傷事件的累積及骨髓微環(huán)境的免疫失調(diào)，高?；颊進(jìn)DS干細(xì)胞往往表現(xiàn)為快速增殖但分化阻滯，導(dǎo)致病情逐漸向急性白血病轉(zhuǎn)化。這一過(guò)程中，調(diào)控造血干細(xì)胞增殖及分化的轉(zhuǎn)錄因子也起著重要作用［16］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與C 組相比，MDS 組的造血調(diào)控因子HOXB4 mRNA 表達(dá)水平升高，并且HOXB4 基因的高表達(dá)與患者白細(xì)胞減少、原始細(xì)胞增多、不良預(yù)后分層及白血病轉(zhuǎn)化相關(guān)。

HOXB4 是第一個(gè)被證實(shí)在人類和小鼠中具有調(diào)控正常造血干細(xì)胞的自我更新和定向分化作用的HOX 基因。然而，HOXB4 不單有重要的造血調(diào)控作用，在許多惡性腫瘤中被認(rèn)為是一種癌癥相關(guān)基因，如白血病、乳腺癌、卵巢癌等［17-19］。KUSAKABE 等［20］發(fā)現(xiàn)在人類急性T 淋巴細(xì)胞白血病中，HOXB 基因通過(guò)可通過(guò)表觀遺傳機(jī)制被特異性激活，并使白血病前期細(xì)胞和白血病細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。ZHANG等［21］曾報(bào)道狗和獼猴在移植過(guò)表達(dá)HOXB4 的CD34+細(xì)胞后發(fā)生急性髓性白血病，這些白血病細(xì)胞存在過(guò)表達(dá)HOXB4、癌基因表達(dá)失調(diào)和髓系分化受阻，HOXB4 敲低后，白血病細(xì)胞可恢復(fù)分化。這些研究表明HOXB4 過(guò)表達(dá)具有顯著的白血病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而，目前關(guān)于HOXB4 在MDS 中的作用罕見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)MDS 患者中的HOXB4 基因表達(dá)水平與原始細(xì)胞比例及白血病轉(zhuǎn)化相關(guān)。因此，我們推測(cè)HOXB4 的高表達(dá)可引起惡性原始細(xì)胞擴(kuò)增，從而加速M(fèi)DS 患者向急性白血病轉(zhuǎn)化。

HOXB4 的異常表達(dá)常常與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。有研究［22-24］發(fā)現(xiàn)在急性和慢性髓系白血病患者中，HOXB4 的高表達(dá)均與高腫瘤負(fù)荷、化療耐藥及不良生存期相關(guān)。而HOXB4 的敲低可通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路下調(diào)P-gp、MRP1 和BCRP 的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞株的多藥耐藥［25］。在卵巢癌中，HOXB4 可通過(guò)激活DHDDS 基因增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，從而促進(jìn)疾病惡性進(jìn)展［17］，而HOXB4 敲低可通過(guò)抑制PI3K/Akt 通路下調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，增強(qiáng)紫杉醇和DDP 的細(xì)胞毒性作用從而達(dá)到增強(qiáng)藥效的目的［26］。盡管已經(jīng)有許多研究證實(shí)了HOXB4 基因的高表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展，但其確切機(jī)制目前尚不清楚，需要更多的研究去進(jìn)一步闡明。

MDS 是一組異質(zhì)性很大的疾病，患者的治療策略主要依賴于預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層［27］?，F(xiàn)有的評(píng)分系統(tǒng)包括分子國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)（IPSS-M）、IRSS-R及WHO 分型預(yù)后積分系統(tǒng)（WPSS）等都存在一定的不足，如所需的參數(shù)較多、評(píng)分過(guò)程較為復(fù)雜等。因此，發(fā)現(xiàn)新型可靠又易于檢測(cè)的預(yù)后分子標(biāo)志物對(duì)MDS 的診治具有十分重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中HOXB4 基因的高表達(dá)與MDS 的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，檢測(cè)HOXB4 的表達(dá)水平，有利于臨床及早發(fā)現(xiàn)白血病轉(zhuǎn)化的高危人群，盡早啟動(dòng)去甲基化治療、聯(lián)合化療及骨髓移植等積極治療手段，改善患者的生存。此外，實(shí)體瘤中有基礎(chǔ)研究表明HOXB4 敲低可以增強(qiáng)化療療效，因此，HOXB4 也有望成為治療MDS 的潛在靶點(diǎn)。