王曉燕 鄒小義 祝翔 王婷 強(qiáng)葉濤 周思源 張鵬 張平

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（江蘇常州 213000）；2德安醫(yī)院康復(fù)科（江蘇常州 213000）；3江蘇省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（南京 210029）；4揚(yáng)中市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（江蘇鎮(zhèn)江 212200）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是心血管病最常見的動(dòng)脈壁異常綜合征。巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的泡沫化是AS 病理過(guò)程中的標(biāo)志。研究表明鐵代謝異常亦是AS 的危險(xiǎn)因素之一，鐵代謝紊亂所致的胞內(nèi)鐵超載可通過(guò)Fenton 反應(yīng)［1］產(chǎn)生ROS，加重體內(nèi)低密度脂蛋白的氧化［2］，而脂質(zhì)過(guò)氧化又是AS 形成的關(guān)鍵。已有研究證實(shí)鐵離子對(duì)大多數(shù)細(xì)胞均可造成氧化應(yīng)激損傷，如腦組織中鐵含量的升高會(huì)加速腦內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，引起阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］，軟骨細(xì)胞的鐵超載會(huì)增加膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率［4］等。鐵超載引起的內(nèi)皮功能障礙［5-6］及促炎巨噬細(xì)胞生成［7］增加了AS 的發(fā)病率，但鐵超載對(duì)泡沫細(xì)胞的作用還尚不清楚，其是否促進(jìn)泡沫細(xì)胞向促AS 表型轉(zhuǎn)化，還鮮有報(bào)道。因此，本研究建立泡沫細(xì)胞模型，旨在觀察鐵超載對(duì)促進(jìn)泡沫細(xì)胞向促AS 表型轉(zhuǎn)化的影響，探討其在AS 活化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料MOVAS 細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞研究所；氧化性低密度脂蛋白（oxLDL），去鐵胺，普魯士藍(lán)染色試劑盒，油紅O 染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸鐵銨，購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司。檸檬酸鐵銨購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，ROS 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Beyotime 公司，MDA 和GSH 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，GPX4 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自酶免上海瑞番生物科技有限公司，CCK-8 購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MOVAS 細(xì)胞分為media 組、ox-LDL組、oxLDL + FC組、oxLDL + FC + DFO組。配制50 mmol DFO 和200 mmol FC 母液用于后續(xù)研究。細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，調(diào)至濃度為5 × 104個(gè)細(xì)胞/mL，接種于96孔板中，每孔加100 μL培養(yǎng)液，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞60%粘連后，去掉完全培養(yǎng)液，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 mL，饑餓培養(yǎng)12 h。按組分別加入含鐵元素200 μmol的FC和100 μmol DFO，孵育1 h。加入50 μg/mL 的oxLDL 刺激細(xì)胞24 h 后檢測(cè)。

1.2.2 CCK-8 檢測(cè)每孔加入15 μL 的CCK-8，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育3 h。酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)測(cè)OD值，分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 ROS 檢測(cè)每孔按1∶1 000 比例加入DHE探針，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)每孔加入樣本，酶標(biāo)抗體后孵育，洗滌后加底物顯色，酶標(biāo)儀讀取吸光度，計(jì)算蛋白含量。

1.2.5 RT-qPCR 檢測(cè)收集標(biāo)本，加入Trizol。利用氯仿、異丙醇、乙醇提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于擴(kuò)增。結(jié)果采用2-△△CT法分析目的基因在各組之間的表達(dá)。各靶基因引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence

1.2.6 普魯士藍(lán)染色細(xì)胞種植鋪板，PBS 洗滌后4%多聚甲醛固定，蒸餾水洗滌，加入普魯士藍(lán)染液，蒸餾水洗滌后顯微鏡下拍照。圖中藍(lán)綠色代表鐵沉積。

1.2.7 油紅O 染色細(xì)胞種植鋪板，PBS 洗滌后油紅O 固定25 min 棄去，蒸餾水洗滌，60%異丙醇30 s 后棄去，油紅O 染料浸染20 min 棄去，60%異丙醇分化至無(wú)背景色，水洗，蘇木精復(fù)染2 min，油紅O 緩沖液孵育1 min 棄去。加蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在倒置顯微鏡下拍攝照片以觀察細(xì)胞泡沫化的程度。圖中紅色代表泡沫細(xì)胞。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鐵超載模型的建立oxLDL + FC 組中的兩種細(xì)胞均觀察到明顯的藍(lán)綠色鐵沉積。DFO 處理后，oxLDL + FC + DFO 組的藍(lán)綠色鐵沉積顯著減輕（圖1）。

圖1 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞普魯士藍(lán)染色（標(biāo)尺=100 μm）Fig.1 RAW264.7 and MOVAS cell iron deposition by Prussian Blue staining （scale=100 μm）

2.2 鐵超載參與oxLDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞的生成與oxLDL 組比較，oxLDL+FC 組呈現(xiàn)更明顯的紅色（圖2），且負(fù)責(zé)膽固醇流出的主要分子ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ABCG1）mRNA 表達(dá)降低（P＜ 0.05），見表2-3。DFO 預(yù)處理后，與oxLDL+FC 組比較，oxLDL+FC+DFO組紅色顯著減少（圖2）。并且，ABCA1和ABCG1 mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜ 0.05），見表2-3。

圖2 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞油紅O 染色（標(biāo)尺=50 μm）Fig.2 RAW264.7 and MOVAS cell were stained with Oil Red O （scale=50 μm）

表2 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的ABCA1 mRNA 水平Tab.2 The mRNA expression of ABCA1 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

表2 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的ABCA1 mRNA 水平Tab.2 The mRNA expression of ABCA1 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

注：與oxLDL + FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media組oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組RAW264.7 1.000 ± 0.014 0.809 ± 0.036*0.721 ± 0.033 1.835 ± 0.120*MOVAS 1.002 ± 0.084 0.082 ± 0.078*0.602 ± 0.061 1.673 ± 0.123*

表3 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的ABCG1 mRNA 水平Tab.3 The mRNA expression of ABCG1 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

表3 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的ABCG1 mRNA 水平Tab.3 The mRNA expression of ABCG1 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

注：與oxLDL+FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media組oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組RAW264.7 1.003 ± 0.085 0.893 ± 0.016*0.768 ± 0.061 1.537 ± 0.124*MOVAS 1.004 ± 0.112 0.679 ± 0.073 0.591 ± 0.058 1.367 ± 0.053*

2.3 鐵超載調(diào)控oxLDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)與oxLDL 組比較，oxLDL + FC 組兩種細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞存活率（圖3）和活性（表4）均顯著降低（P＜ 0.05），泡沫細(xì)胞ROS 和MDA 的含量明顯增加，GPX4 的表達(dá)明顯降低（P＜ 0.05），但對(duì)于GSH 含量，僅在平滑肌細(xì)胞中顯著減少，而巨噬細(xì)胞中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖4，表5-7）。DFO 處理后，oxLDL + FC 組比較，oxLDL + FC +DFO 組的細(xì)胞存活率和活性明顯提高（P＜ 0.05）（圖3，表4）。同時(shí)以上所有鐵超載環(huán)境中加重的過(guò)氧化反應(yīng)均有所減輕（圖4，表5-7）。

圖3 光鏡觀察RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的存活情況（標(biāo)尺=200 μm）Fig.3 The survival of RAW264.7 and MOVAS cell via light microscopy （scale=200 μm）

圖4 DHE 探針觀察RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞ROS 的生成（標(biāo)尺=50 μm）Fig.4 The ROS generation of RAW264.7 and MOVAS cell by DHE probe （scale=50 μm）

表4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞活性Tab.4 The relative cells activity of RAW264.7 and MOVAS via CCK-8 assay ±s，%

表4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞活性Tab.4 The relative cells activity of RAW264.7 and MOVAS via CCK-8 assay ±s，%

注：與oxLDL+FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media組oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組RAW264.7 100.000 ± 2.624 70.672 ± 1.860*43.800 ± 2.694 52.918 ± 3.079*MOVAS 100.000 ± 1.676 77.981 ± 3.220*45.493 ± 2.340 61.263 ± 1.690*

表5 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的MDA 水平Tab.5 The content of MDA in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，nmol/mL

表5 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的MDA 水平Tab.5 The content of MDA in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，nmol/mL

注：與oxLDL+FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組MOVAS 1.267 ± 0.123 1.892 ± 0.219*2.464 ± 0.244 1.873 ± 0.224*RAW264.7 0.766 ± 0.078 1.316 ± 0.088*2.386 ± 0.140 1.665 ± 0.096*

表6 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的GPX4 含量Tab.6 The content of GPX4 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，pg/mL

表6 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的GPX4 含量Tab.6 The content of GPX4 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，pg/mL

注：與oxLDL+FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組MOVAS 337.801 ± 28.104 347.435 ± 38.656*240.760 ± 17.360 284.464 ± 18.562*RAW264.7 316.075 ± 11.402 281.403 ± 31.398*205.787 ± 28.654 285.066 ± 32.690*

表7 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的GSH 含量Tab.7 The content of GSH in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，μmol/gprot

表7 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的GSH 含量Tab.7 The content of GSH in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，μmol/gprot

注：與oxLDL+FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media組oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組MOVAS 31.267 3 ± 4.244 8 21.390 4 ± 0.339 2 22.878 9 ± 2.046 6 28.734 3 ± 0.968 3*RAW264.7 40.897 5 ± 3.602 1 21.497 3 ± 4.610 4 23.643 7 ± 2.657 7 32.180 1 ± 1.544 8*

2.4 鐵超載參與oxLDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞促動(dòng)脈粥樣硬化表型的轉(zhuǎn)化與oxLDL 組比較，oxLDL+FC組巨噬細(xì)胞促炎M1 型標(biāo)志物iNOS 和平滑肌細(xì)胞合成型標(biāo)記物OPN顯著增加，平滑肌細(xì)胞收縮型標(biāo)志物α-SMA、平滑肌肌球蛋白重鏈11（MYH11）明顯下降（P＜ 0.05），而平滑肌收縮型標(biāo)志物SM22a和抗炎M2 型標(biāo)志物Arg-1 mRNA 無(wú)明顯變化（P＞0.05）。DFO 處理后，與oxLDL + FC 組相比，Arg-1、α-SMA、MYH11 和SM22a 均顯著增加，iNOS 和OPN顯著降低（P＜ 0.05）。見表8-9。

表8 RAW264.7 細(xì)胞的iNOS 和Arg-1 mRNA 水平Tab.8 The mRNA expression of iNOS and Arg-1 in RAW264.7 cells ±s

表8 RAW264.7 細(xì)胞的iNOS 和Arg-1 mRNA 水平Tab.8 The mRNA expression of iNOS and Arg-1 in RAW264.7 cells ±s

注：與oxLDL+FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組iNOS 1.000 ± 0.012 1.959 ± 0.024*2.720 ± 0.061 2.251 ± 0.198*Arg-1 1.001 ± 0.063 1.089 ± 0.126 1.120 ± 0.128 1.405 ± 0.049*

表9 MOVAS 細(xì)胞的α-SMA、SM22a、MYH11、OPN mRNA 水平Tab.9 The mRNA expression of α-SMA、SM22a、MYH11 and OPN in MOVAS cells ±s

表9 MOVAS 細(xì)胞的α-SMA、SM22a、MYH11、OPN mRNA 水平Tab.9 The mRNA expression of α-SMA、SM22a、MYH11 and OPN in MOVAS cells ±s

注：與oxLDL+FC組相比，*P ＜ 0.05

組別media組oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組OPN 1.001 ± 0.067 1.148 ± 0.091*2.271 ± 0.033 1.428 ± 0.123*α-SMA 1.001 ± 0.053 0.594 ± 0.037*0.392 ± 0.024 0.770 ± 0.014*SM22a 1.002 ± 0.083 0.786 ± 0.117 0.602 ± 0.073 0.971 ± 0.127*MYH11 1.001 ± 0.063 0.682 ± 0.029*0.411 ± 0.021 0.653 ± 0.032*

2.5 鐵超載加重oxLDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞炎癥反應(yīng)與oxLDL 組比較，鐵超載環(huán)境加強(qiáng)了TNF-α、IL-1β mRNA 的表達(dá)（P＜ 0.05），而DFO 處理后，TNF-α、IL-1β 的mRNA 表達(dá)較oxLDL+FC 組顯著降低（P＜ 0.05）。見表10-11。

表10 RT-qPCR 檢測(cè)RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的TNF-α mRNA 水平Tab.10 The mRNA expression of TNF-α in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

表10 RT-qPCR 檢測(cè)RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的TNF-α mRNA 水平Tab.10 The mRNA expression of TNF-α in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

組別media組oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組RAW264.7 1.005 ± 0.120 1.610 ± 0.203*3.315 ± 0.223 1.601 ± 0.252*MOVAS 1.008 ± 0.157 2.517 ± 0.329*5.417 ± 0.183 3.803 ± 0.326*

表11 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的IL-1β mRNA 水平Tab.11 The mRNA expression of IL-1β in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

表11 RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞的IL-1β mRNA 水平Tab.11 The mRNA expression of IL-1β in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

注：與oxLDL+FC組比較，*P ＜ 0.05

組別media組oxLDL組oxLDL+FC組oxLDL+FC+DFO組RAW264.7 1.001 ± 0.041 1.514 ± 0.145*2.826 ± 0.177 1.754 ± 0.055*MOVAS 1.006 ± 0.133 1.695 ± 0.171*3.600 ± 0.183 1.772 ± 0.363*

3 討論

本研究選用RAW264.7 和MOVAS 細(xì)胞株建立AS 泡沫細(xì)胞模型，觀察鐵超載與泡沫細(xì)胞促AS活化的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵超載促進(jìn)巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞吸收oxLDL 向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)分子ABCA1 和ABCG1 mRNA 水平顯著下降。這意味著鐵超載促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇沉積可能由ABCA1 和ABCG1 表達(dá)降低所致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鐵超載實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞死亡率顯著升高，ROS 和MDA 含量增加，表明過(guò)量鐵對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性，加重細(xì)胞過(guò)氧化損傷。眾所周知，GPX4 作為保護(hù)生物膜不受氫過(guò)氧化損傷的GPX 分子，通過(guò)消耗細(xì)胞內(nèi)GSH 抑制磷脂和膽固醇的氫過(guò)氧化反應(yīng)［8］。本實(shí)驗(yàn)中，鐵超載引起GPX4 顯著降低，導(dǎo)致ROS 的積累，促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，但巨噬細(xì)胞GSH 含量與oxLDL 組相比卻沒有明顯變化，推測(cè)對(duì)于巨噬細(xì)胞，鐵超載可能通過(guò)其他方式影響GPX4，而不是耗竭GSH。但在DFO 治療后，GPX4和GSH 含量均顯著上升，表明去除過(guò)量鐵即可恢復(fù)細(xì)胞抗氧化能力。

巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是AS 發(fā)病過(guò)程中的重要參與細(xì)胞，其功能會(huì)隨著病情的進(jìn)展發(fā)生改變并相互作用，如巨噬細(xì)胞極化與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化［9-11］。在AS 病程中，由于機(jī)體微環(huán)境改變，促使巨噬細(xì)胞極化為促炎M1 型和抗炎M2 型并參與鐵代謝，M1 型分泌促炎因子促使晚期斑塊破裂并表達(dá)高水平的鐵儲(chǔ)存蛋白和低水平的運(yùn)鐵素（FPN）來(lái)維持胞內(nèi)鐵超載狀態(tài)，反之，M2 型分泌抑炎因子在AS 初期穩(wěn)定斑塊并表達(dá)低水平的鐵儲(chǔ)存蛋白和高水平的FPN 以利于鐵外流［12-13］。在斑塊初期血管中平滑肌細(xì)胞以增殖為主，促進(jìn)纖維帽生成以穩(wěn)定斑塊［11］。隨著斑塊進(jìn)展，平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)異常轉(zhuǎn)化，由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換，下調(diào)原有的收縮型標(biāo)志物α-SMA、MYH11 和SM22a 等，上調(diào)骨橋蛋白（OPN）等合成型標(biāo)志物，甚至向巨噬細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變［14-15］，致使正常表型的平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少，最終導(dǎo)致纖維帽變薄，斑塊破裂［11］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鐵超載能夠促使促炎M1 型巨噬細(xì)胞和收縮型平滑肌細(xì)胞的生成，并釋放炎癥因子（TNF-α、IL-1β）。所有這些變化在DFO 處理后均出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。

此外，研究［16-18］表明GPX4 活性降低，則對(duì)鐵死亡現(xiàn)象更敏感，其失活是導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物積累的原因。鐵死亡是一種以脂質(zhì)過(guò)氧化積累為特征的鐵依賴性細(xì)胞凋亡，是以GSH 消耗，抗氧化體系GPX4 失活，ROS 大量生成為特征的炎癥反應(yīng)［18-19］。雖然本實(shí)驗(yàn)中，鐵超載組部分?jǐn)?shù)據(jù)支持了鐵死亡現(xiàn)象，但遺憾的是，DFO 卻不是鐵死亡的特異性阻斷劑，我們未能從反面驗(yàn)證鐵死亡的存在。即便如此，我們依然看到了DFO 具有一定的抗AS 作用，這與BAI 等［20］利用DFO 部分抑制oxLDL 誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡的現(xiàn)象相符。

綜上所述，本研究證實(shí)外源性鐵超載促進(jìn)oxLDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的生成，加重脂質(zhì)過(guò)氧化和炎癥反應(yīng)，促使細(xì)胞向促動(dòng)脈粥樣硬化表型轉(zhuǎn)化。但鐵超載在AS中的機(jī)制研究目前還處在初步階段，與鐵死亡究竟是何關(guān)系，是否激活鐵死亡途徑且如何發(fā)揮作用，還需深入研究。我們相信通過(guò)對(duì)泡沫細(xì)胞中鐵代謝的深入研究，將為AS 的預(yù)防和治療找到新的方案。