王欣,鄭思宇,馮龍斐,劉敏,劉寶林

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200093)

黃酒,是以稻米、黍米、小米等淀粉含量高、蛋白質(zhì)含量較低的谷物為主要原料,經(jīng)加曲或部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀造而成的發(fā)酵酒(GB/T 13662—2018《黃酒》),其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣主要是由酒曲和釀酒環(huán)境中的各種微生物產(chǎn)生的[1]。黃酒發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生不同數(shù)量的高級(jí)醇、脂肪酸、醛、脂類等[2],并且伴隨著水自締合、與醇締合及與其他代謝產(chǎn)物的交叉締合的復(fù)雜氫鍵締合作用[3]。其中在發(fā)酵過程中醇、水氫鍵締合的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)變化與酒的刺激和醇厚感緊密相關(guān),對(duì)發(fā)酵酒的最終風(fēng)味有重要影響[4]。因此,黃酒釀造中發(fā)酵過程的監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。

在對(duì)黃酒發(fā)酵過程監(jiān)測(cè)研究方面,PENG等[5]采用GC-MS技術(shù)比較了黃酒在后發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的差異,發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵工藝過程對(duì)黃酒風(fēng)味有重要影響。陳青柳等[6]應(yīng)用HPLC和GC-MS聯(lián)用對(duì)黃酒中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。孫樂平等[7]通過頂空固相微萃取和氣相色譜質(zhì)譜法定量分析了燕麥黃酒發(fā)酵過程中高等醇類的變化,并與發(fā)酵過程中微生物群落變化進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。這些方法具有高通量、高精度等優(yōu)勢(shì),然而往往需要復(fù)雜的分析步驟,抑或是成本較高,在實(shí)際生產(chǎn)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用受到一定的限制。

作為一種快速分析和非破壞性的技術(shù),低場(chǎng)核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)在研究復(fù)雜基質(zhì)中的水和脂類方面有一定優(yōu)勢(shì),可以根據(jù)氫質(zhì)子在基質(zhì)中的流動(dòng)性來區(qū)分和描述質(zhì)子群。目前LF-NMR技術(shù)已在部分發(fā)酵食品的品質(zhì)分析中有一定應(yīng)用[8],如糯米[9]、發(fā)酵香腸[10]、納豆[11]等食品的監(jiān)測(cè)。雖然已有對(duì)葡萄酒T2弛豫特性的研究報(bào)道[12],但應(yīng)用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)對(duì)黃酒的研究還相對(duì)較少。因此,本文對(duì)黃酒釀造過程中5個(gè)關(guān)鍵工藝階段的樣品進(jìn)行了分析,在比較了不同酒精度、陳釀時(shí)間和品牌的黃酒的LF-NMR弛豫特性的基礎(chǔ)上進(jìn)行了主成分分析,以探究LF-NMR在監(jiān)測(cè)黃酒發(fā)酵過程和辨別不同黃酒類別的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同發(fā)酵階段(浸米、第一次發(fā)酵、第二次發(fā)酵、煎酒及3年陳釀)的黃酒樣品由黃酒生產(chǎn)企業(yè)提供;18個(gè)市售黃酒樣品(A～I(xiàn))均為經(jīng)檢驗(yàn)后的市場(chǎng)抽樣產(chǎn)品,樣品真實(shí)有效;去離子水由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

LF-NMR核磁共振分析儀(PQ001,磁場(chǎng)強(qiáng)度(0.5±0.08) T,共振頻率21.3 MHz,配套T-Invfit反演擬合軟件和Φ15 mm核磁試管),上海紐邁電子科技有限公司;HH·S21恒溫水浴鍋,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

以去離子水為對(duì)照,對(duì)經(jīng)過浸米、第一次發(fā)酵(發(fā)酵1)、第二次發(fā)酵(發(fā)酵2)、煎酒的樣品和3年陳釀的黃酒進(jìn)行LF-NMR弛豫特性分析;以B品牌酒精度分別12%vol、13%vol和14%vol的8年陳釀黃酒為對(duì)象,比較酒精度對(duì)LF-NMR弛豫特性的影響;選取品牌B及H(酒精度14%vol,陳釀時(shí)間5、8年),品牌F(酒精度15%vol,陳釀時(shí)間6、8年)的黃酒,研究陳釀時(shí)間對(duì)LF-NMR弛豫特性的影響;對(duì)品牌C和I(3年陳,13%vol)、品牌B和H(5年陳,14%vol;8年陳,13%vol;8年陳,14%vol)的黃酒LF-NMR弛豫特性進(jìn)行比較。最后對(duì)9個(gè)品牌18個(gè)黃酒樣品進(jìn)行主成分分析,黃酒樣品信息見表1。

表1 黃酒樣品信息Table 1 Information of Huangjiu samples

取3 mL樣品于核磁管中,32 ℃水浴10 min后置于核磁探頭中穩(wěn)定1 min,選擇CPMG序列,檢測(cè)參數(shù)為：采樣頻率(sampling frequency,SW)為250.0 kHz、重復(fù)采樣等待時(shí)間(time of repetition,TR)為20 000 ms、重復(fù)掃描次數(shù)(number of repeat scans,NS)為4次、半回波時(shí)間(τ)為500 μs、回波個(gè)數(shù)(echo count,EC)為16 000個(gè)、采樣點(diǎn)數(shù)(sampling number,TD)為4 000 126個(gè)(當(dāng)SW、τ、EC三者確定后,此值可自動(dòng)確定)。檢測(cè)時(shí)室溫：23.7 ℃、濕度：50%。應(yīng)用T-invfit軟件進(jìn)行單/多組分反演擬合,可得到樣品的單組分弛豫時(shí)間(T2W),多組分弛豫時(shí)間T2i(i=1,2…)、信號(hào)幅值及峰面積比例S2i(i=1,2…)等核磁信息。

樣品設(shè)置3個(gè)平行及3次重復(fù),以確保結(jié)果的可靠性。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)反演擬合獲得的5個(gè)變量(T2 W、T21、T22、S21、S22)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和主成分分析(principal component analysis,PCA)。使用ANOVA方差分析和Duncan事后檢驗(yàn),P<0.05時(shí)為顯著性差異。應(yīng)用Origin 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀造階段樣品的LF-NMR弛豫特性

2.1.1 單組分弛豫(T2W)特性

T2W可以反映樣品在發(fā)酵過程中弛豫特性的整體變化,不同釀造階段黃酒樣品的單組分弛豫時(shí)間(T2W)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同釀造階段樣品的單組分弛豫時(shí)間(T2W)

圖1表明,與去離子水的T2W(2 825 ms)相比,浸米階段樣品的T2W顯著降低1 176 ms(P<0.05),這是由于浸入米料后,體系中含有了豐富的氨基酸和其他有機(jī)物質(zhì),增加了體系中氨基酸態(tài)氮、酯類物質(zhì)與有機(jī)酸的含量[13]。第一次發(fā)酵后樣品的T2W進(jìn)一步從1 649 ms顯著縮短至273 ms,說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醇、氨基酸等物質(zhì)使樣品中氫質(zhì)子的束縛力相對(duì)增強(qiáng)[14]。經(jīng)過第二次發(fā)酵及煎酒后的樣品的T2W無顯著變化,而經(jīng)過3年陳釀后樣品的T2W又顯著長(zhǎng)于煎酒后的樣品,說明新釀制黃酒體系不夠穩(wěn)定,陳釀過程中隨酸與醇酯化反應(yīng)的進(jìn)行,黃酒的酒精度降低,而揮發(fā)酯含量增加,總體表現(xiàn)為體系中氫質(zhì)子的束縛力相對(duì)減弱。根據(jù)LI等[15]對(duì)黃酒發(fā)酵過程的研究,陳釀可賦予黃酒和諧宜人的香味,在此過程中體系中的氫鍵締合作用也發(fā)生了改變。

2.1.2 多組分弛豫(T2)特性

不同釀造階段的黃酒樣品的多組分弛豫(T2)圖譜如圖2所示。將位于100～1 000 ms的弛豫峰命名為T21峰,大于1 000 ms的弛豫峰命名為T22峰,將其多組分弛豫時(shí)間(T21,T22)及峰面積比例(S21,S22)的變化情況列于表2。

a-各階段的總體情況;b-去離子水和浸米的樣品;c-浸米和發(fā)酵1的樣品;d-發(fā)酵1和發(fā)酵2的樣品;e-發(fā)酵2和煎酒的樣品;f-煎酒和3年陳黃酒的樣品圖2 不同釀造階段樣品的多組分弛豫圖譜(T2)

表2 黃酒發(fā)酵過程中的多組分弛豫信息Table 2 The multi-component relaxation characteristics of Huangjiu

由圖2-a可知,發(fā)酵過程中樣品的T2多組分弛豫圖譜變化明顯。為了更清晰地分析,對(duì)相鄰2個(gè)發(fā)酵階段的T2多組分弛豫圖譜進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如圖2-b～圖2-f所示。

圖2-b表明,雖然浸米后樣品與去離子水的多組分弛豫圖譜都表現(xiàn)為一個(gè)弛豫峰,且峰形類似,但浸米后樣品的弛豫時(shí)間更短,由2 009 ms縮短到1 221 ms(表2)。這是由于加米浸泡后體系中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16],如有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、淀粉、糖和維生素等,這些都會(huì)增強(qiáng)對(duì)樣品中水分子的束縛作用,影響到水的氫鍵締合[17],體系的布朗運(yùn)動(dòng)相對(duì)減弱,氫質(zhì)子的弛豫加快,使其弛豫時(shí)間縮短。

由圖2-c可知,與浸米階段的樣品相比,經(jīng)過第一次發(fā)酵后的樣品的T2多組分弛豫特性發(fā)生了顯著改變,表現(xiàn)為峰數(shù)量的增加和信號(hào)幅值的相對(duì)降低,該階段樣品呈現(xiàn)2個(gè)弛豫峰,其中,新增的弛豫峰位于132 ms處(表2),且所占峰面積比例達(dá)到了86.2%,說明該部分氫質(zhì)子是體系中主要的組成部分,T22峰的弛豫時(shí)間也縮短至1 386 ms,S22僅為13.8%。YANG等[18]的研究表明,經(jīng)過第一次發(fā)酵后體系中會(huì)形成多種醇類、醛類、酸類、酯類等物質(zhì),體系變得更加復(fù)雜且會(huì)對(duì)體系中氫鍵的締合產(chǎn)生影響,這與弛豫峰的增加密切相關(guān)。

由圖2-d可知,與第一次發(fā)酵的樣品相比,經(jīng)第二次發(fā)酵后的樣品也表現(xiàn)為兩個(gè)弛豫峰,峰形類似,信號(hào)幅值略有降低;但弛豫峰相對(duì)左移,弛豫時(shí)間從132 ms縮短至126 ms(表2),但該峰面積比例幾乎無變化(86.3%),T22峰進(jìn)一步縮短至1 317 ms。經(jīng)第二次發(fā)酵后體系中的醇、酸、酚、酯等物質(zhì)的種類和含量均相對(duì)增加[19],從而使樣品中氫質(zhì)子所受束縛作用增強(qiáng)、弛豫加快。

圖2-e中,與第二次發(fā)酵相比,煎酒后的樣品亦呈現(xiàn)兩個(gè)弛豫峰,但其分布進(jìn)一步左移,弛豫時(shí)間分別縮短至114 ms和1 232 ms,S21略有減小(85.1%)。這可能是由于煎酒的溫度為(90±1) ℃,相對(duì)高的溫度促進(jìn)體系中物質(zhì)的溶解和轉(zhuǎn)變,使物質(zhì)間的氫鍵締合作用進(jìn)一步增強(qiáng)[16],體系中氫質(zhì)子所受束縛作用進(jìn)一步增強(qiáng),表現(xiàn)為弛豫時(shí)間的縮短。

由圖2-f可知,與煎酒后的樣品相比,經(jīng)過3年陳釀的黃酒的多組分弛豫仍為2個(gè)弛豫峰,但其分布相對(duì)右移,弛豫時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)至242 ms和1 908 ms,S21有明顯增加(92.4%)。這是由于陳釀貯存期間,微生物作用和化學(xué)反應(yīng)仍在緩慢進(jìn)行,醇類、酸類、酚類、酯類等物質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生變化,風(fēng)味特征得到增強(qiáng),這也會(huì)導(dǎo)致陳釀時(shí)的氫鍵締合不同于釀造過程中的氫鍵締合[20]。隨陳釀時(shí)間的延長(zhǎng),醇類及易揮發(fā)的一些物質(zhì)的含量相對(duì)減少。這使樣品中氫質(zhì)子所受束縛作用相對(duì)減弱,弛豫時(shí)間延長(zhǎng)。

2.2 不同酒精度黃酒的LF-NMR弛豫特性

同一品牌不同酒精度的黃酒樣品的LF-NMR弛豫特性如圖4所示。

由圖3-a可知,隨酒精度從12%vol增加至14%vol,黃酒的T2W從376 ms縮短至307 ms(P<0.05)。圖3-b中,隨酒精度的增加,樣品的弛豫分布左移,T21和T22均相對(duì)縮短。酒精度的增加意味著體系中乙醇分子的增多,這會(huì)使氫質(zhì)子在溶液中的運(yùn)動(dòng)受限[21]。劉敏等[22]的研究亦發(fā)現(xiàn),水-乙醇體系中乙醇濃度的增加會(huì)加快氫質(zhì)子的弛豫。KIRSCHNER等[23]的研究發(fā)現(xiàn),乙醇摩爾分?jǐn)?shù)的增加會(huì)使體系中分子的表面密度增加,氫鍵締合更加緊密。因此,同一品牌和陳釀時(shí)間下,隨酒精度的增加,樣品的T2 W、T21和T22均相對(duì)縮短。

a-單組分弛豫時(shí)間;b-多組分弛豫分布圖3 不同酒精度黃酒的單組分弛豫時(shí)間和多組分弛豫分布

2.3 不同陳釀時(shí)間黃酒的LF-NMR弛豫特性

同一品牌不同陳釀時(shí)間的黃酒樣品的LF-NMR弛豫特性比較如表3所示。

表3 不同陳釀時(shí)間黃酒的LF-NMR弛豫特性Table 3 LF-NMR relaxation characteristics of Huangjiu after different aging years

由表3可知,陳釀時(shí)間對(duì)黃酒的T2弛豫特性的影響較小。同一品牌的黃酒,當(dāng)酒精度相同時(shí),陳釀年份較長(zhǎng)的黃酒表現(xiàn)出較大的T21,而T22、S21和S22的變化不大。這可能是由于,隨著陳釀時(shí)間的增加,黃酒中發(fā)生了包括氧化、酯化、水解和揮發(fā)等物理化學(xué)反應(yīng),使酒的陳香增加[15],但由于乙醇濃度對(duì)體系中醇水締合作用的影響更為明顯,本部分中酒精度相同,故整體上表現(xiàn)為對(duì)體系中氫質(zhì)子的自由度影響較小,僅T21相對(duì)延長(zhǎng)。

2.4 不同品牌黃酒的LF-NMR弛豫特性

4組不同品牌,同一酒精度、陳釀時(shí)間的黃酒樣品的LF-NMR弛豫特性比較結(jié)果如圖4所示。

a-3年陳,13%vol;b-5年陳,14%vol;c-8年陳,13%vol;d-8年陳,14%vol圖4 不同品牌黃酒的多組分弛豫分布(T2)

由圖4-a～圖4-d可知,黃酒的多組分弛豫分布峰形相似,但不同品牌間有所區(qū)分。在同一酒精度和陳釀時(shí)間下,如圖4-a,品牌I和C均為加飯酒,但產(chǎn)地不同,品牌I的弛豫分布較品牌C右移。而圖4-b～圖4-d中,品牌B和H的黃酒類型及產(chǎn)地均不同,即使酒精度和陳釀時(shí)間相同,品牌B的弛豫分布均較H左移。這一對(duì)比說明,對(duì)于同一酒精度和陳釀時(shí)間的黃酒,不同品牌黃酒釀造工藝的區(qū)別也會(huì)使其LF-NMR弛豫特性有所差異。

2.5 不同品牌黃酒的主成分分析

對(duì)9個(gè)品牌18個(gè)黃酒樣品共54個(gè)樣本的LF-NMR弛豫信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及主成分分析,提取主成分1(PC1)和主成分2(PC2),主成分表達(dá)式分別如下,累計(jì)貢獻(xiàn)值達(dá)到96%,即2個(gè)主成分保留了96%的原始數(shù)據(jù)信息,能很好的反映所有變量的原有信息[24],主成分分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同品牌黃酒的PC1和PC2得分圖

F1=0.39T21+0.56S21- 0.48T22-0.55S22

F2=0.60T21-0.43S21+0.51T22+0.44S22

由圖5可知,不同品牌黃酒的分布有明顯區(qū)別。這是由于不同品牌黃酒所選用的原料、釀造工藝和黃酒類型有一定的區(qū)別[2],這都會(huì)對(duì)樣品的弛豫特性產(chǎn)生影響,從而反映為在主成分分布圖的區(qū)別。A、C、D、E、G品牌的黃酒樣品具有相同的酒精度及陳釀時(shí)間,故分布相對(duì)集中,而B品牌中,酒精度及陳釀時(shí)間都有一定變化,故PCA分布上也有一定區(qū)分,8年陳12%vol的黃酒分布于第四象限,其余樣品均分布于第三象限,但總體與其他品牌可區(qū)分;F品牌的2個(gè)陳釀時(shí)間的黃酒則位于第二象限,陳釀時(shí)間上亦可區(qū)分;類似的,H品牌則均分布于圖第一象限;I品牌的分布位于圖的右上方,其中8年陳14%vol的黃酒由于和H品牌酒精度相同,產(chǎn)地均為上海且兩者陳釀時(shí)間相近,因此分布較為接近。這說明基于黃酒的LF-NMR弛豫特性和PCA分析可以區(qū)分來源于不同生產(chǎn)企業(yè)的黃酒產(chǎn)品,且酒精度及陳釀時(shí)間也會(huì)影響其分布。

3 結(jié)論

本文重點(diǎn)探索了基于低場(chǎng)核磁共振技術(shù)進(jìn)行黃酒發(fā)酵進(jìn)程監(jiān)測(cè)及品牌區(qū)分的可行性。研究發(fā)現(xiàn),黃酒釀造過程中樣品的LF-NMR特性有明顯改變。發(fā)酵使黃酒的單組分弛豫時(shí)間(T2W)顯著縮短,而陳釀則會(huì)使T2W稍有延長(zhǎng)。發(fā)酵后樣品的T2圖譜均呈典型雙峰特征,且在發(fā)酵過程中弛豫時(shí)間相對(duì)縮短,陳釀過程會(huì)使弛豫時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)。同一品牌及陳釀時(shí)間的黃酒,酒精度越高,體系的單組分及多組分時(shí)間均越小;陳釀時(shí)間對(duì)弛豫特性影響較小,同一品牌及酒精度下,陳釀時(shí)間僅對(duì)T21有一定影響。不同品牌黃酒因釀造工藝的區(qū)別而使弛豫分布有一定特點(diǎn)。通過主成分分析可以挖掘黃酒的LF-NMR弛豫信息,實(shí)現(xiàn)對(duì)不同工藝生產(chǎn)的各品牌黃酒的快速辨別。研究也為后期LF-NMR技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定參考。