張倜培,李青,包鴻慧*,沈正興,石娟,唐前勇,程一方,周睿*

1(湖北文理學(xué)院,傳統(tǒng)藥食同源產(chǎn)品研究與開(kāi)發(fā)國(guó)際科技合作基地,湖北 襄陽(yáng),441053) 2(襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖北 襄陽(yáng),441607)

糖尿病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的代謝紊亂性慢性疾病,常伴有糖尿病腎病、神經(jīng)病變等并發(fā)癥[1]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑可有效減緩葡萄糖通過(guò)腸壁吸收參與機(jī)體的血液循環(huán),控制餐后血糖水平,是臨床治療糖尿病常用一線藥物[2-3]。乙酰膽堿脂酶抑制劑可通過(guò)抑制乙酰膽堿脂酶活力而提高乙酰膽堿水平和神經(jīng)元興奮性,廣泛應(yīng)用于阿爾茨海默癥的治療[4]。目前,臨床常用酶抑制劑主要有阿卡波糖和伏米格列醇、多奈哌齊和他克林等,但長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生胃腸道疾病、頭暈惡心等副作用且價(jià)格昂貴[2,4]。此外,高血糖機(jī)體內(nèi)血清和血紅蛋白等的非酶糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)是糖尿病并發(fā)癥如阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化、白內(nèi)障等慢性疾病發(fā)生的重要誘因,抑制蛋白糖基化和AGEs的形成能有效緩解糖尿病并發(fā)癥[5]。而機(jī)體內(nèi)活性氧自由基大量累積,易導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子功能損傷,且氧化應(yīng)激與認(rèn)知功能障礙等糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)[4,6]。因此,清除自由基、抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿脂酶活性以及抑制AGEs常作為安全高效型天然植物源抗糖尿病和抗癡呆活性成分的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[6-10]。

綠碎茶一般選用中低檔機(jī)采老嫩混雜的茶鮮葉為原料,通過(guò)殺青、揉切、初烘、足火及篩分等工藝制成的顆粒形綠茶,富含兒茶素類天然多酚物質(zhì),主要用于熱銷國(guó)內(nèi)外的袋泡茶和窨制花茶產(chǎn)品基料,但綠碎茶較紅碎茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對(duì)滯后,其研究?jī)H限于加工工藝、理化品質(zhì)、滋氣味等方面[11-12]。此外,植物多酚可通過(guò)抑制自由基通路、脂質(zhì)抗氧化、抑制腸道消化酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)胰島素合成與分泌、調(diào)節(jié)腸道菌群以及改善氧化應(yīng)激狀態(tài)和神經(jīng)元線粒體功能等機(jī)制發(fā)揮降血糖和認(rèn)知保護(hù)功效[3,10,13-14],而干燥方式與加熱溫度均顯著影響多酚抗氧化及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性[7,15]。同時(shí),前期研究已發(fā)現(xiàn)綠碎茶水提物具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性以及一定的抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制能力[16],然而干燥方式對(duì)綠碎茶多酚提取物抗氧化和抗糖尿病及抗癡呆活性的影響未見(jiàn)研究報(bào)道。

因此,本研究通過(guò)蒸干結(jié)合真空干燥與真空冷凍干燥2種方式干燥綠碎茶乙酸乙酯萃取相,測(cè)定提取物的DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、羥自由基(·OH)清除能力,鐵離子還原能力(ferric ion reducing power,FRAP)、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶抑制能力以及AGEs形成抑制能力,評(píng)價(jià)2種干燥方式對(duì)多酚提取物體外抗氧化和抗糖尿病及抗癡呆活性潛力的影響,為綠碎茶資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠碎茶,湖北天藝茶業(yè)有限責(zé)任公司;DPPH、ABTS、福林酚、2,4,6-三吡啶三吖嗪,上海阿拉丁有限公司;α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶(acetylcholin esterase,AChE)、阿卡波糖,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;L-抗壞血酸(維生素C)、氨基胍(aminoguanidine,AG)、石杉?jí)A甲(huperzine A,HupA)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-dithiobide (2-nitrobenzoic acid),DTTB)、4-硝基酚-α-D-呋喃葡萄糖苷(4-nitrophenol-α-D-glucofuran,pNPG)、碘化硫代乙酰膽堿,上海源葉生物科技公司;其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra Scan PRO型色度儀,美國(guó)Hunter Lab公司;LC-LX-L6OD型高速離心機(jī),上海力辰邦西儀器科技有限公司;SY-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;L5S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海精密儀器儀表有限公司;DZF-6050型真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DNM-9602型酶標(biāo)儀,北京普朗新技術(shù)有限公司;SP Virtis BenchTop Pro型真空冷凍干燥機(jī),美國(guó)SP Scientific儀器公司;F-7000型熒光分光光度計(jì),日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將綠碎茶粉碎并過(guò)60目篩,稱取150 g用1 500 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液于30 ℃恒溫水浴下攪拌浸提12 h,4層紗布過(guò)濾,將濾液離心取上清液,濃縮,用等體積氯仿萃取3次,收集上層水相,再用等體積乙酸乙酯萃取3次,收集上層乙酸乙酯相,然后均勻等量分為2份。其中1份萃取液減壓濃縮,將殘液置于蒸發(fā)皿,水蒸氣浴揮干至膏狀,真空干燥(0.09 MPa,60 ℃,6 h),樣品標(biāo)記為BGTE-SVD。另1份萃取液減壓濃縮至膏狀,冷凍干燥,樣品標(biāo)記為BGTE-FD。采用福林酚法[17]測(cè)定樣品BGTE-SVD與BGTE-FD的總酚含量分別為(759.89±14.28) mg GAE/g和(820.11±20.37)mg GAE/g。采用苯酚硫酸法[17]測(cè)定樣品BGTE-SVD與BGTE-FD的總糖含量分別為(6.71±0.21)%和(7.55±0.28)%。

1.3.2 綠碎茶多酚提取物的色澤測(cè)定

將樣品置于潔凈的比色皿中,采用色差儀測(cè)定色度值：L*值(亮度)、a*值(紅度)、b*值(黃度),并根據(jù)公式(1)計(jì)算色差值ΔE。測(cè)定前用標(biāo)準(zhǔn)白板校正色差儀。

(1)

式中：ΔL*表示提取物與原綠碎茶粉的亮度差值;Δa*表示提取物與原綠碎茶粉的紅度差值;Δb*表示提取物與原綠碎茶粉的黃度差值。

1.3.3 綠碎茶多酚提取物體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定參照張露等[10]方法。·OH清除能力(hydroxyl radical scavenging activity,HRSA)測(cè)定參照龍曉珊等[14]方法。FRAP測(cè)定參照陳濤林等[18]方法。維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定結(jié)果用IC50值表示。

1.3.4 綠碎茶多酚提取物體外抗糖尿病活性測(cè)定

1.3.4.1α-淀粉酶抑制活性測(cè)定

采用張宏圖等[13]的測(cè)定方法并略作修改。取0.5 mL的樣品與0.5 mL的α-淀粉酶溶液充分混合,于37 ℃條件下孵育10 min后,添加0.5 mL的淀粉溶液,繼續(xù)反應(yīng)10 min。然后,添加1.0 mL的DNS試劑,并置于沸水浴5 min滅酶。冰浴快速冷卻至室溫后,加入10 mL的蒸餾水充分混勻,最后準(zhǔn)確量取200 μL溶液加入96平板,并置于酶標(biāo)儀,于540 nm下測(cè)定吸光值。選擇阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果用樣品的α-淀粉酶活性抑制率和半抑制濃度值(IC50)表示,α-淀粉酶活性抑制率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A為添加樣品和酶的反應(yīng)體系為抑制組;B為不含酶的反應(yīng)體系為對(duì)照組;C為不加樣品的反應(yīng)體系為非抑制組;D為不加樣品和酶的反應(yīng)體系為空白對(duì)照組。

1.3.4.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

采用張露等[10]測(cè)定方法并略作修改。用磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.9)配制α-葡萄糖苷酶溶液(0.25 U/mL)和pNPG溶液(5 mmol/L)。然后,準(zhǔn)確量取50 μL的樣品以及100 μL的α-葡萄糖苷酶溶液于96孔平板中,置于酶標(biāo)儀25 ℃下反應(yīng)10 min。再加入50 μL的pNPG溶液,25 ℃下繼續(xù)反應(yīng)5 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的吸光值。阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果用樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制率和IC50表示。α-葡萄糖苷酶活性抑制率的計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A是樣品測(cè)試組吸光值;B是樣品背景測(cè)試組(磷酸鹽緩沖液代替樣品測(cè)試組中的α-葡萄糖苷酶溶液)吸光值;C是空白對(duì)照測(cè)試組(磷酸鹽緩沖液代替樣品測(cè)試組中的樣品)吸光值。

1.3.4.3 抗糖基化活性測(cè)定

參照楊生輝等[9]的測(cè)定方法并略作修改。準(zhǔn)確配制20 mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液、0.5 mol/L葡萄糖溶液(glucose,Glu)。準(zhǔn)確量取BSA、Glu各1.5 mL,分別加入1 mL樣品溶液(0.2 mg/mL)與6.0 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.4),搖勻后避光37 ℃恒溫孵育1～6 d。采用熒光分光光度計(jì),測(cè)定AGEs在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm處的熒光值。相同濃度的AG為陽(yáng)性對(duì)照。樣品對(duì)BSA/Glu模擬體系A(chǔ)GEs的相對(duì)抑制率按公式(4)計(jì)算：

(4)

式中：F1為不添加樣品但水浴的BSA/Glu模擬體系的熒光值;F2為添加樣品且水浴的BSA/Glu模擬體系的熒光值;F3為不添加樣品也不水浴的BSA/Glu模擬體系的熒光值。

1.3.5 AChE抑制活性測(cè)定

參照ELLMAN等[19]的測(cè)定方法并略作修改。在96孔板上依次加入50 μL PBS(pH 7.4)、25 μL不同質(zhì)量濃度樣品溶液以及25 μL質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL AChE溶液。在4 ℃條件下靜置20 min。然后加入25 μL質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL ATCI和125 μL質(zhì)量濃度為0.59 mg/mL DTNB,在37 ℃恒溫條件下反應(yīng)20 min后,用酶標(biāo)儀在405 nm處快速測(cè)定吸光值。以HupA作為陽(yáng)性對(duì)照。AChE酶活性抑制率按公式(5)計(jì)算：

(5)

式中：A1為PBS代替樣品的吸光值;A2為PBS代替空白測(cè)試組中的AChE溶液的吸光值;A3為樣品組測(cè)試吸光值;A4為PBS代替樣品測(cè)試組中的AChE溶液的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次,結(jié)果表示以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2019軟件進(jìn)行基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì);采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較及分析;采用ANOVA算法進(jìn)行單因素方差分析;采用Origin 2019軟件繪制圖形。顯著性水平選定P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠碎茶多酚提取物的色澤

由圖1和表1可知,原綠碎茶粉呈暗綠色,而B(niǎo)GTE-SVD和BGTE-FD分別呈現(xiàn)橙黃色和暗黃色,其L*、a*、b*值均顯著升高(P<0.05),ΔE分別為8.68和11.59,差異顯著(P<0.05)。BGTE-FD的L*、b*及ΔE值均明顯高于BGTE-SVD,而其a*值卻低于BGTE-SVD,表明真空冷凍干燥提取物色澤偏亮偏黃,而蒸干結(jié)合真空干燥提取物色澤偏紅,這可能與多酚類物質(zhì)在高熱條件下易發(fā)生氧化、聚合或分解等反應(yīng)有關(guān)[15]。

表1 綠碎茶多酚提取物的色澤測(cè)定Table 1 The color measurements of polyphenol extracts of broken green tea

a-綠碎茶粉;b-BGTE-SVD;c-BGTE-FD圖1 綠碎茶粉和綠碎茶多酚提取物的外觀

2.2 綠碎茶多酚提取物體外抗氧化活性

由圖2和表2可知,各樣品對(duì)DPPH自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的提高而不斷增強(qiáng),劑量依耐性明顯。

表2 綠碎茶多酚提取物體外抗氧化和酶抑制活性的IC50值 單位：mg/L

圖2 綠碎茶多酚提取物的DPPH自由基清除能力

BGTE-FD和BGTE-SVD的IC50值分別為2.64 mg/L和3.93 mg/L,其清除DPPH自由基能力約為維生素C(IC50=7.86 mg/L)的3倍和2倍,表明綠碎茶多酚提取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,且BGTE-FD活性明顯強(qiáng)于BGTE-SVD(P<0.05)。這可能是由于低溫和低氧分壓環(huán)境有利于提取物抗氧化活性物質(zhì)的保留[20]。袁曉擘等[21]與張軼斌等[22]研究發(fā)現(xiàn)五峰綠茶水提物和綠茶多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值分別為50.56 mg/L及300 mg/L以上,遠(yuǎn)大于本研究樣品測(cè)定值,表明多酚是綠碎茶中最主要的抗氧化物質(zhì)。

由圖3和表2可知,隨著質(zhì)量濃度的提升,各樣品對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力不斷增強(qiáng),劑量效應(yīng)顯著。BGTE-FD和BGTE-SVD對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的IC50值分別為5.17 mg/L和7.98 mg/L,明顯低于前期綠碎茶水提物的研究結(jié)果(IC50=22.16 mg/L)[16]以及五峰綠茶水提物的測(cè)定值(IC50=8.81 mg/L)[21],且BGTE-FD和BGTE-SVD抗氧化活性相當(dāng)于維生素C(IC50=12.37 mg/L)的2.39倍和1.55倍,這與DPPH自由基清除活性測(cè)定結(jié)論相一致。這可歸因于高含量的多酚類物質(zhì)有利于自由基清除能力增強(qiáng)[6]。

圖3 綠碎茶多酚提取物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力

由圖4和表2可知,綠碎茶多酚提取物具有較強(qiáng)的羥自由基清除活性,各樣品對(duì)羥自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的提高而不斷增強(qiáng),且相互之間存在顯著性差異(P<0.05),量效關(guān)系明顯。各樣品清除·OH能力大小順序?yàn)锽GTE-FD(IC50=247.01 mg/L)>BGTE-SVD(IC50=289.29 mg/L)>維生素C(IC50=319.83 mg/L),BGTE-FD和BGTE-SVD的·OH清除能力相當(dāng)于維生素C的1.30倍和1.11倍,且顯著強(qiáng)于前期綠碎茶水提物的測(cè)定值[16](IC50=2 952.57 mg/L)(P<0.05)。李曉強(qiáng)等[23]同樣研究發(fā)現(xiàn)余甘子提取物中多酚含量與羥自由基清除能力呈顯著性正相關(guān)。由圖5和表2可知,各樣品的FRAP與質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)性,且彼此間差異顯著(P<0.05),劑量依賴性明顯。BGTE-FD的FRAP最強(qiáng),IC50值為27.73 mg/L,其活性約為維生素C的1.15倍,而B(niǎo)GTE-SVD與維生素C的總還原能力次之,IC50值分別為32.85 mg/L和31.86 mg/L,差異不顯著(P>0.05)。

圖4 綠碎茶多酚提取物的羥自由基清除能力

圖5 綠碎茶多酚提取物的鐵離子還原能力

綜上所述,綠碎茶多酚提取物的4個(gè)抗氧化指標(biāo)IC50值大小順序依次為IC50(DPPH)

2.3 綠碎茶多酚提取物的體外抗糖尿病活性

由圖6和表2可知,各樣品對(duì)α-淀粉酶具有良好的抑制能力,劑量依賴效應(yīng)顯著。BGTE-FD與BGTE-SVD對(duì)α-淀粉酶的抑制活性顯著低于阿卡波糖(IC50=9.35 mg/L),這與王靜等[24]對(duì)蘋(píng)果多酚的研究結(jié)論相一致。BGTE-FD抑制α-淀粉酶的能力明顯高于BGTE-SVD(P<0.05),兩者的IC50值分別為85.84 mg/L和282.64 mg/L,約為阿卡波糖的α-淀粉酶抑制能力的10.89%和3.31%。此外,張宏圖等[13]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚可通過(guò)疏水相互作用和氫鍵與α-淀粉酶結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物,產(chǎn)生非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

圖6 綠碎茶多酚提取物的α-淀粉酶活性抑制能力

由圖7和表2可知,綠碎茶多酚提取物具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性,劑量依賴效應(yīng)良好。質(zhì)量濃度為12 mg/L時(shí),BGTE-FD和BGTE-SVD對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率分別高達(dá)84.56%和80.03%,IC50值分別為4.38 mg/L和4.97 mg/L,差異不顯著(P>0.05),其活性顯著強(qiáng)于阿卡波糖(IC50=929.59 mg/L),約為阿卡波糖活性的187倍以上,且遠(yuǎn)高于前期綠碎茶水提物(IC50=390 mg/L)[16]、桑黃醇提物(IC50=430 mg/L)[25]、肉桂多酚(IC50=48 mg/L)[14]及海蒿子多酚(IC50=27.09 mg/L)[8],低于覆盆子多酚提取物(IC50=1.65 mg/L)[10],表明綠碎茶多酚提取物具有天然醫(yī)藥α-葡萄糖苷酶抑制劑的開(kāi)發(fā)潛力。

圖7 綠碎茶多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

由圖8可知,綠茶碎多酚提取物對(duì)熒光性AGEs形成具有良好的抑制作用。反應(yīng)1 d時(shí),各樣品AGEs抑制率均較低。反應(yīng)3 d時(shí),BGTE-FD和BGTE-SVD的AGEs抑制率快增至35.35%和31.67%(P<0.05),但明顯低于AG(67.03%),約為AG抑制能力的52.74%和47.25%。反應(yīng)6 d時(shí),AG的AGEs抑制率增速變緩,而B(niǎo)GTE-FD和BGTE-SVD的ACEs抑制率繼續(xù)呈線性增長(zhǎng),其抑制率接近于AG(71.81%),分別高達(dá)65.28%和63.66%,遠(yuǎn)高于玉米須黃酮(IC50=467.9 mg/L)[9],表明綠茶碎多酚提取物具有天然植物源AGEs抑制劑的開(kāi)發(fā)潛力。劉玲等[26]研究表明,茶多酚抗糖基化作用機(jī)制主要在于保護(hù)蛋白質(zhì)的巰基、抗氧化作用以及抑制蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)。

圖8 綠碎茶多酚提取物對(duì)AGEs形成的抑制能力

2.4 綠碎茶多酚提取物的AChE抑制活性

天然植物源乙AChE抑制劑是阿爾茨海默病治療藥物的研發(fā)熱點(diǎn)[27]。由圖9和表2可知,綠碎茶多酚提取物對(duì)AChE活性具有一定的抑制作用,其抑制能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),呈現(xiàn)良好的劑量依耐性。BGTE-FD抑制AChE的能力(IC50值416.45 mg/L)顯著低于HupA(IC50=0.06 mg/L)(P<0.05),而高于BGTE-SVD(IC50值590.74 mg/L),且遠(yuǎn)大于云臺(tái)山毛尖綠茶提取物(質(zhì)量濃度1 mg/mL的抑制率為56.27%)[28]、丹參乙酸乙酯提取物(IC50值為1.2 mg/mL)[29]以及大果榕果實(shí)多酚提取物(IC50值為4.9 mg/mL)[30]。

圖9 綠碎茶多酚提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶活性抑制能力

3 結(jié)論

本文首次采用蒸干結(jié)合真空干燥以及真空冷凍干燥2種干燥方式處理綠碎茶乙酸乙酯萃取相,比較研究了兩種提取物的色澤、體外抗氧化和抗糖尿病以及乙酰膽堿酯酶抑制活性。結(jié)果表明,干燥方式對(duì)綠碎茶多酚提取物的色澤及體外生物活性具有顯著影響。真空冷凍干燥提取物具有較高的總酚含量及較強(qiáng)的酶抑制能力和AGEs形成抑制能力,其清除DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、·OH、鐵離子還原及抑制α-葡萄糖苷酶的能力均高于相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸和阿卡波糖,同時(shí)對(duì)熒光性非酶糖基化終產(chǎn)物抑制率高達(dá)65.28%,接近于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍,且抑制乙酰膽堿酯酶能力的IC50值僅為416.45 mg/L。因此,真空冷凍干燥的綠碎茶多酚提取物具有良好的天然植物源抗氧化劑以及抗糖尿病和防治老年癡呆藥物或保健食品的開(kāi)發(fā)潛力。后續(xù)擬對(duì)綠碎茶多酚提取物的單體活性組分進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及功效機(jī)制探究等工作,并通過(guò)細(xì)胞模型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其體內(nèi)外生物活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。