楊玲 翁旭亮 曾婷 王成銀 劉青 邱鈴鈴 雷源

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病［1］。臨床上以記憶障礙、計(jì)算力下降、理解力下降、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙及人格和行為改變等全面認(rèn)知功能下降表現(xiàn)為特征。世界衛(wèi)生組織報(bào)道, 預(yù)計(jì)到2050 年, AD 患病人數(shù)將高達(dá)1.52 億, 為目前全球五大死因之一［2］, 給社會(huì)和家庭帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。隨著人口老齡化現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重,延緩AD 的發(fā)展及預(yù)防AD 的發(fā)生已成為目前關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。AD 的病理特征主要表現(xiàn)為由β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉積引起的老年斑(senile plaque, SP)、神經(jīng)細(xì)胞tau 蛋白過(guò)度磷酸化引起的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)和神經(jīng)元的丟失［3］。其中Aβ 在腦內(nèi)異常增多聚集產(chǎn)生神經(jīng)毒性是AD 的始動(dòng)與中心環(huán)節(jié)［4］。健腦增智飲是廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腦病科的科內(nèi)膏方制劑, 課題組在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn), 其對(duì)認(rèn)知功能障礙有著明顯的改善作用, 可顯著改善認(rèn)知障礙患者的記憶力、認(rèn)知功能及日常生活能力, 改善血清S100 蛋白和AchE 指標(biāo)［5,6］, 但其具體的作用機(jī)制尚未開(kāi)展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。臨床仍需更進(jìn)一步的研究以闡明其對(duì)AD 認(rèn)知功能障礙的具體調(diào)控機(jī)制, 為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供充分的科學(xué)理論依據(jù)。本研究擬采用Aβ1-42 構(gòu)建AD 細(xì)胞模型, 通過(guò)檢測(cè)AD 細(xì)胞模型的細(xì)胞活性及凋亡水平, 進(jìn)一步探討健腦增智飲治療AD 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 健腦增智飲的制備 健腦增智飲(組方：熟地黃20 g, 茯苓15 g, 巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、麥冬、石菖蒲、遠(yuǎn)志、川芎、丹參、赤芍各10 g, 五味子、生姜、大棗各6 g)復(fù)方內(nèi)含的所有藥材均由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供, 采用自動(dòng)循環(huán)煎藥機(jī)提取濃縮, 調(diào)整為等滲溶液后按照生物劑量使終濃度為0.5 g/ml, 經(jīng)過(guò)濾除菌后4℃避光保存, 待用前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將PC12 細(xì)胞于90%DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗的培養(yǎng)液中, 置于37℃、95%空氣+5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 1～2 d 更換培養(yǎng)液, 培養(yǎng)至單層細(xì)胞匯合后傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的PC12 細(xì)胞,以105個(gè)/孔鋪板至6 孔培養(yǎng)板中, 分為六組：①NC組；②AD 組, 加入濃度為20 μmol/L 的Aβ1-42 置培養(yǎng)箱中24 h；③AD+Donepezil 組, 加入20 μmol/L 多奈哌齊(Donepezil)稀釋液預(yù)處理PC12 細(xì)胞24 h, 再加入20 μmol/L 的Aβ1-42 作用于PC12 細(xì)胞24 h；④AD+5 μg/ml 健腦增智飲組、AD+10 μg/ml 健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組, 應(yīng)用不同濃度的健腦增智飲(5、10、20 μg/ml)預(yù)處理神經(jīng)細(xì)胞24 h, 再加入20 μmol/L 的Aβ1-42 作用于PC12 細(xì)胞24 h。

1.3 CCK-8 檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞活性 96 孔板加入細(xì)胞100 μl/孔(約1×104), 置37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。加入適當(dāng)濃度的受試化合物。將96 孔板在37℃, 含5%CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1、2、3 d, 向各孔中加入10 μl 的CCK-8 檢測(cè)溶液, 37℃下孵育1 h。讀數(shù)前在搖床上混勻, 酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度。

1.4 western 蛋白印跡法檢測(cè)凋亡因子相關(guān)蛋白水平 常規(guī)流程胰酶消化細(xì)胞, 離心, 50 μl RIPA+5 μl PMSF 裂解液裂解各組細(xì)胞, 完成總蛋白提取, 按50 體積BCA 試劑加1 體積Cu 試劑(50∶1)配成BCA工作液測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離, 轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜, 取出雜交膜, TBST 漂洗5 min, 1 次,用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h, TBST 洗膜10 min,1 次, 加合適的一抗稀釋液4℃過(guò)夜, TBST 洗膜10 min,3次, 加相應(yīng)二抗稀釋液37℃孵育1 h, TBST洗膜10 min,3 次, 將雜交膜置于一透明塑料板上, 用一干凈移液器將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面, 并使反應(yīng)持續(xù)5 min, 用試劑盒提供的濾紙吸去膜表面多余的底物溶液, 放至保鮮膜上, 顯影。檢測(cè)各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取Falcon 試管,并按標(biāo)本順序編號(hào), 使用冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞2 次, 再用1×Binding Buffer 緩沖液制成1×106細(xì)胞/ml的懸液。Falcon 試管中加入100 μl 細(xì)胞懸液, 分別加入5 μl Annexin V-FITC與10 μl 碘化丙啶(PI), 充分混勻,室溫(20～25℃)避光處放置15 min。各試驗(yàn)管中分別加入1×Binding Buffer 緩沖液400 μl。1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t 檢驗(yàn)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞活性的影響 通過(guò)CCK-8檢測(cè)法測(cè)定各組細(xì)胞活性結(jié)果顯示：與NC 組比較,AD 組活性顯著降低(P＜0.05), 與AD 組比較, AD+Donepezil 組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組細(xì)胞活性顯著增高(P＜0.05)。見(jiàn)表1, 圖1。

圖1 不同濃度健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞活性的影響

表1 不同時(shí)間各組PC12 細(xì)胞活性比較( x-±s, n=3)

2.2 健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)western 蛋白印跡法測(cè)定凋亡因子相關(guān)蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示：與NC 組比較, AD 組Bax 表達(dá)水平顯著上調(diào), Bcl-2 水平顯著下調(diào), Bcl-2/Bax 顯著下調(diào)(P＜0.05)；與AD 組比較, AD+Donepezil 組、AD+10 μg/ml健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bax 水平顯著下調(diào)(P＜0.05), AD+Donepezil 組和AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bcl-2/Bax 顯著上調(diào)(P＜0.05)。見(jiàn)表2, 圖2。

圖2 不同濃度健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

表2 不同濃度健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響( x-±s, n=3)

2.3 健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示：與NC 組比較,AD 組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)；與AD 組比較,AD+Donepezil 組和AD+5 μg/ml 健腦增智飲組、AD+10 μg/ml 健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組細(xì)胞凋亡顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表3, 圖3。

圖3 不同濃度健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞凋亡的影響

表3 不同濃度健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞凋亡的影響( ±s, n=3)

表3 不同濃度健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞凋亡的影響( ±s, n=3)

注：與AD 組比較, aP＜0.05

項(xiàng)目NC 組AD 組AD+Donepezil 組AD+健腦增智飲組5 μg/ml10 μg/ml20 μg/ml凋亡率7.870±0.241a36.530±1.42910.690±1.257a26.930±1.790a23.800±1.136a10.410±1.903a

3 討論

關(guān)于AD 的治療, 目前臨床尚無(wú)特效藥物, 西醫(yī)方面主要包括膽堿酯酶抑制劑, 如多奈哌齊(唯一一種同時(shí)被美國(guó)食品與藥品管理局和英國(guó)藥品控制局批準(zhǔn)上市的用于對(duì)癥治療輕、中度AD 的藥物)、石杉?jí)A甲、加蘭他敏等, 另一類為N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA 受體)拮抗劑, 如美金剛等。盡管目前有多種上市的治療藥物, 但僅能延緩疾病的進(jìn)展, 而難以治愈及阻止本病的進(jìn)展, 新的治療策略亟待被發(fā)現(xiàn)。

Aβ 是一種由淀粉樣前體蛋白通過(guò)γ 分泌酶和β 分泌酶通過(guò)剪切而成, 越來(lái)越多的研究表明, Aβ在AD 發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用, 是涉及遺傳和環(huán)境因素的AD 發(fā)病機(jī)制的上游分子, 而Aβ 積累及其相關(guān)炎癥被認(rèn)為是AD 腦中神經(jīng)變性和神經(jīng)元丟失前的早期事件［4］。研究證實(shí)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Aβ 的過(guò)度沉積明顯早于臨床癥狀的出現(xiàn)［7］。Aβ 的毒性積聚能夠?qū)е耂P 的形成, 引起神經(jīng)元細(xì)胞的死亡、突觸缺失和神經(jīng)功能的失調(diào), 導(dǎo)致AD 的發(fā)生。其中神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡是AD 重要的病理改變, 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡通路主要包括2 條：線粒體依賴的凋亡通路和死亡受體依賴通路, Aβ 主要通過(guò)線粒體通路導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡, Caspase-3 是凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵因子, Aβ 破壞線粒體膜結(jié)構(gòu), 細(xì)胞色素C 釋放至胞質(zhì)中, 進(jìn)一步激活caspase-3, 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。

本研究以Aβ1-42 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞培養(yǎng)成AD 細(xì)胞模型, 利用不同濃度健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)結(jié)果顯示：與NC 組比較, AD 組活性顯著降低(P＜0.05), 與AD 組比較, AD+Donepezil 組增殖活性顯著增高(P＜0.05), AD+20 μg/ml 健腦增智飲組細(xì)胞活性亦顯著增高(P＜0.05)。進(jìn)一步證實(shí)健腦增智飲對(duì)AD 細(xì)胞模型有較好的神經(jīng)保護(hù)作用, 減少AD 細(xì)胞的凋亡, 且高濃度(20 μg/ml)健腦增智飲治療AD 組療效更優(yōu)。上述結(jié)果表明, 健腦增智飲可明顯增加細(xì)胞活性, 抑制Aβ 蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡, 減少神經(jīng)元丟失。

Bax 屬于兔抗人單克隆抗體, 是人體最主要的凋亡相關(guān)蛋白, Bax 的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)線粒體內(nèi)膜孔道蛋白線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開(kāi)放, 釋放細(xì)胞色素C,激活caspase-9, 進(jìn)一步激活caspase-3 介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑, 促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。而B(niǎo)cl-2 蛋白是線粒體凋亡的關(guān)鍵蛋白, 可阻斷、抑制線粒體內(nèi)膜孔道蛋白MPTP 開(kāi)放, 阻斷caspase-3 蛋白激活, 從而阻斷、抑制細(xì)胞凋亡。Bax 是與Bcl-2 同源的水溶性相關(guān)蛋白, 可拮抗Bcl-2 的保護(hù)效應(yīng), 促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［9-14］。本研究應(yīng)用western 蛋白印跡法檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示：與NC 組比較, AD 組Bax 表達(dá)水平顯著上調(diào), Bcl-2 水平顯著下調(diào), Bcl-2/Bax 顯著下調(diào)(P＜0.05)；與AD 組比較, AD+Donepezil 組、AD+10 μg/ml健腦增智飲組、AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bax 水平顯著下調(diào)(P＜0.05), AD+Donepezil 組和AD+20 μg/ml 健腦增智飲組Bcl-2/Bax 顯著上調(diào)(P＜0.05)。提示AD 組的細(xì)胞凋亡增加, 而多奈哌齊和健腦增智飲高濃度可有效減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生, 進(jìn)一步證實(shí)了健腦增智飲通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax 的表達(dá)對(duì)AD 細(xì)胞減少細(xì)胞的凋亡,起到神經(jīng)保護(hù)作用。

AD 屬于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇, 最早見(jiàn)于東漢《華佗神醫(yī)秘傳·華佗治癡呆神方》。殷賀等［15］多名醫(yī)家均認(rèn)為“腎虛、痰、瘀”的基本病機(jī)貫穿于AD發(fā)生發(fā)展的始終。年老腎精虛衰, 腎藏精, 精生髓, 髓源虧乏, 髓海不充, 同時(shí)脾胃漸衰, 運(yùn)化無(wú)力, 氣機(jī)失調(diào), 濕濁內(nèi)聚, 郁而成痰, 痰濁內(nèi)盛, 上蒙清竅, 腦失清靈, 而氣機(jī)失調(diào), 氣血瘀滯, 腦絡(luò)血脈運(yùn)行不暢, 瘀血阻滯, 清竅失養(yǎng), 導(dǎo)致腦神經(jīng)功能障礙, 發(fā)為本病。治療上多以“補(bǔ)腎化痰祛瘀法”貫穿始終［16-19］。基于此基礎(chǔ), 本課題組成員也總結(jié)出治療AD 的經(jīng)驗(yàn)方健腦增智飲, 本方以地黃飲子為基礎(chǔ)方加減, 重用熟地黃、山茱萸, 起到以補(bǔ)腎填精益髓為主, 余藥共用, 兼以化痰開(kāi)竅、活血祛瘀, 標(biāo)本同治、虛實(shí)兼施的作用, 長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床, 并取得較好療效。

綜上所述, 健腦增智飲可通過(guò)調(diào)控Bcl-2/Bax 蛋白的表達(dá), 有效減少AD 細(xì)胞的凋亡, 提高細(xì)胞的活性,起到對(duì)AD 細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用, 且高濃度(20 μg/ml)健腦增智飲治療組療效更優(yōu), 為中醫(yī)治療認(rèn)知障礙疾病的進(jìn)一步探索提供理論及臨床依據(jù)。