姜學權，汪浩勇

湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068

運動發(fā)酵單胞菌是一種高效的乙醇生產(chǎn)菌株，有許多理想的工業(yè)生物催化劑特性[1]。它的代謝途徑已得到廣泛研究，有助于揭示其高乙醇生產(chǎn)率和耐受性的機制。

目前，微生物的干燥方法通常包括冷凍干燥、噴霧干燥和真空干燥[2]。相比其他干燥方法，鼓風干燥操作簡單，可顯著降低成本，同時能達到預期的干燥效果[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖作為干燥保護劑能起到脫水保護的作用，并且不含原基，不會使蛋白質發(fā)生褐變反應從而變質失活，甘油可以清除自由基及活性氧，這有助于防止變性和其他形式的損壞[4]。

本研究以運動發(fā)酵單胞菌為研究對象，采用固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)運動發(fā)酵單胞菌，使用顯微鏡計數(shù)法統(tǒng)計細菌數(shù)量，利用鼓風干燥法處理細菌，通過添加可能的保護劑分析其對細菌存活率的影響，最后采用發(fā)酵方式分析鼓風干燥運動發(fā)酵單胞菌的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

運動發(fā)酵單胞菌由湖北工業(yè)大學汪浩勇老師實驗室提供。

1.1.2 原料

豆粕和麩皮均購自河北油脂有限公司，含水率分別為11.3%和11.8%。

1.1.3 培養(yǎng)基

固態(tài)培養(yǎng)基：豆粕7 g，麩皮3 g，混合后121 ℃滅菌20 min。

ZM 液態(tài)培養(yǎng)基：25%葡萄糖，1%酵母提取物，0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，pH 6.0～7.0，115 ℃滅菌30 min。

ZM 活化培養(yǎng)基：10%葡萄糖，1%酵母提取物，0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，pH 6.0～7.0，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SPX-250-B 型生化培養(yǎng)箱，上海福碼公司；LS-335L-I 型高壓蒸汽滅菌鍋，江陰賓江醫(yī)療有限公司；PH50-3A43L 型顯微鏡，蘇州光學神鷹有限公司；101-2B 型電熱鼓風干燥箱，恒諾利興科技有限公司；DHS-10A 型電子水分測定儀，邦西儀器科技有限公司；CJ-2D 型超凈工作臺，天津泰斯特。

1.3 試驗方法

1.3.1 運動發(fā)酵單胞菌的固態(tài)培養(yǎng)

使用豆粕作為原料提供細菌生長所需的營養(yǎng)，麩皮作為輔料改善培養(yǎng)基的通透性。豆粕與麩皮質量比為7∶3 的混合原料10 g，5%的活化菌液混在無菌水溶液（含有0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，5%葡萄糖）中，取10 g 加到混合原料中混勻，在33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用顯微鏡觀察并統(tǒng)計細菌數(shù)。

1.3.2 鼓風干燥及保護劑添加

分別用滅菌的淀粉、乳糖和麥芽糖與培養(yǎng)的運動發(fā)酵單胞菌固態(tài)培養(yǎng)基等質量混合。固態(tài)培養(yǎng)基和保護劑各稱取4 g（培養(yǎng)基是濕重，含有50.39%的水分），混勻后放在39 ℃電熱鼓風干燥箱風吹，直至含水率低于10%。

1.3.3 組合保護劑的選擇

培養(yǎng)運動發(fā)酵單胞菌的固態(tài)培養(yǎng)基與乳糖等質量混勻后，分別添加固態(tài)培養(yǎng)基質量分數(shù)2%，4%，6%，8%的甘油到其中，另一組分別添加固態(tài)培養(yǎng)基質量分數(shù)5%，10%，15%，20%的甘露糖，混勻后放在39 ℃電熱鼓風干燥箱風吹，直至含水率低于10%。

1.3.4 發(fā)酵試驗

經(jīng)過鼓風干燥的菌株用無菌水懸浮起來，以5%的接種量加入葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，瓶口用活塞塞緊，并添加石蠟油密封，第一次稱重并記錄，發(fā)酵瓶置于恒溫搖床中超過72 h。結束后進行第二次稱重。

1.3.5 細菌總數(shù)及活菌數(shù)的確定

運動發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)結束后，加水約45 g 將細菌懸浮起來，取50 μL 懸液，將其加到有950 μL 無菌水的EP 管中混勻，取10 μL 于血球計數(shù)板，用顯微鏡拍照計數(shù)。

鼓風干燥結束后，加入大約45 g 水將細菌懸浮起來，混勻后取10 μL 加到含有30 μL 水的八連管中，取10 μL 亞甲基藍溶液加入其中進行染色，染色時間大約1 min，取10 μL 染色液于血球計數(shù)板上，用顯微鏡拍照統(tǒng)計細菌總數(shù)和活細菌數(shù)。其中在顯微鏡下觀察到藍色的細菌為死細菌，顏色沒有變化的是活細菌。細菌數(shù)/g=N×256×5 000×稀釋倍數(shù)（N 為顯微鏡下觀察到的細菌數(shù)）

2 結果與分析

2.1 運動發(fā)酵單胞菌固態(tài)培養(yǎng)

以豆粕7 g 和麩皮3 g 混合作為固態(tài)培養(yǎng)基，5%的運動發(fā)酵單胞菌與無菌水（含有0.1%七水硫酸鎂，0.1%磷酸氫二鉀，0.1%硫酸銨，5%葡萄糖）混勻后取10 g 加入固態(tài)培養(yǎng)基中，在33 ℃下培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察到的形態(tài)如圖1 所示，運動發(fā)酵單胞菌在顯微鏡下呈圓形、無色透明狀態(tài)，經(jīng)統(tǒng)計計算得出細菌數(shù)達到1.85×1010CFU/g。表明在此條件下能夠培養(yǎng)出足夠多的細菌。

圖1 運動發(fā)酵單胞菌顯微鏡下的形態(tài)

2.2 鼓風干燥的主要保護劑選擇

運動發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)24 h 后，淀粉、麥芽糖、乳糖作為保護劑與培養(yǎng)細菌的固態(tài)培養(yǎng)基1∶1 混勻，以不添加任何保護劑的培養(yǎng)基作為對照組，然后放在39 ℃電熱鼓風干燥箱中風吹干燥，直到含水量低于10%。麥芽糖和乳糖經(jīng)過稀釋后，可以在顯微鏡下清楚地觀察到細菌，可以作為保護劑與固態(tài)培養(yǎng)基1∶1 混勻進行鼓風干燥。麥芽糖和乳糖作為保護劑進行熱風干燥后，細菌總數(shù)和活菌數(shù)分別為1.38×1010CFU/g、7.27×109CFU/g，1.05×1010CFU/g、9.07×109CFU/g。其對應的存活率分別為52.49%和86.34%。對照組總細菌數(shù)為7.35×109CFU/g，活菌數(shù)只有2.79×109CFU/g，存活率為37.91%。雖然添加麥芽糖后，細菌總數(shù)達到最高，但其保護效果不明顯，而添加乳糖后，存活率明顯比對照組和添加麥芽糖的高，且細菌總數(shù)也比對照組有明顯增加。因此，選擇乳糖作為鼓風干燥的主要保護劑。

2.3 組合保護劑選擇

固態(tài)培養(yǎng)基等質量的乳糖分別與5%，10%，15%，20%的甘露糖為組合保護劑。當添加5%的甘露糖后，細菌總數(shù)達到1.26×1010CFU/g，活菌數(shù)也高達1.19×1010CFU/g，細菌數(shù)顯著比對照組多，其存活率超過94%。進一步增加其添加量，細菌總數(shù)明顯減少。表明在鼓風干燥過程中，添加5%的甘露糖能有效地增加細菌數(shù)，提高細菌存活率。

固態(tài)培養(yǎng)基等質量的乳糖分別與2%，4%，6%，8%的甘油作為組合保護劑。添加2%和4%的甘油后進行鼓風干燥，細菌總數(shù)分別達到1.38×1010CFU/g 和1.26×1010CFU/g，而活菌數(shù)也分別高達1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g，細菌總數(shù)明顯比對照組多，存活率超過94%。在鼓風干燥過程中，添加一定量的甘油能有效地使細菌從固形物中脫離下來，從而能在顯微鏡中觀察到更多的細菌。當甘油的添加量增加時，細菌數(shù)有所減少，過多的甘油添加量也會減少細菌數(shù)量。鼓風干燥過程中，2%～4%的甘油添加不僅能有效地提高細菌總數(shù)，還能提高細菌干燥存活率。

2.4 發(fā)酵試驗

鼓風干燥結束后，用無菌水將運動發(fā)酵單胞菌懸浮起來，吸取1 mL 接種于25%的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基質量為30 g，用電子天平稱整個發(fā)酵瓶的質量，在34 ℃下培養(yǎng)72 h，結束后再稱其質量，計算其失重。結果如表1 所示，干燥后的失重值為0.100 1 g/g，與沒有干燥菌株的失重結果非常接近，表明鼓風干燥方式可用于運動發(fā)酵單胞菌的干燥。

表1 發(fā)酵失重結果（單位：g）

3 結論

在5%接菌量、5%葡萄糖濃添加量、加水量10 g、33 ℃條件下培養(yǎng)時間24 h，獲得的細菌數(shù)為1.85×1010CFU/g。在39 ℃下進行鼓風干燥，固態(tài)培養(yǎng)基等質量的乳糖與5%的甘露糖作為組合保護劑，活菌數(shù)達到1.19×1010CFU/g，存活率超過94%，對鼓風干燥有明顯的保護效果。固態(tài)培養(yǎng)基等質量的乳糖分別與2%或4%的甘油作為組合保護劑，活菌數(shù)分別達到1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g，存活率超過94%。干燥前后的菌株都具有較好的發(fā)酵能力。