熊良益 ，高永堅，林碧珊，梁浩明，楊敏娟，張 蜀 *

1. 廣東藥科大學 新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006

2. 國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

3. 廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006

養(yǎng)胃湯出自《古代經典名方目錄（第一批）》[1]中的第68 首，源自《證治準繩》（明·王肯堂）。處方記載“治外感風寒，內傷生冷，憎寒壯熱，頭目昏疼，不問風寒二證，夾食停痰，俱能治之。但感風邪，以微汗為好?！惫δ苤髦螢橥飧酗L寒、內傷生冷、惡心嘔吐等。由清半夏、姜厚樸、麩炒蒼術、橘紅、廣藿香葉、草果仁、茯苓、人參、炒甘草、生姜、烏梅11 味藥味組成，各藥味之間相輔相成，共奏溫中理氣、燥濕和胃之功。臨床上，養(yǎng)胃湯常用于治療消化道[2]、慢性胃炎[3]等疾病。2021 年9月國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》指出“基準樣品”[4]是橋接古代經典名方和中藥3.1 類制劑，是還原根據古籍記載制備湯劑的參比物質，對于經典名方制劑的開發(fā)至關重要。

關于養(yǎng)胃湯基準樣品成分和質量控制研究相對較少，大多集中于單味藥、藥對化學成分或是化裁方的藥效研究[5-10]，較缺乏對養(yǎng)胃湯更為綜合、全面的質量控制方法的研究。本研究采用UPLC 建立了養(yǎng)胃湯基準樣品的指紋圖譜與7 種成分的含量測定方法，從定性和定量2 個方面對養(yǎng)胃湯基準樣品進行全面研究，為養(yǎng)胃湯后續(xù)藥學研究及其相關制劑的開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-40DXS 型島津高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Waters H-Class 型超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；ME204E 型萬分之一電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；PL203 型百萬分之一電子分析天平，上海梅特勒-托利多公司；Unique-R202 型多功能超純水系統(tǒng)，廈門銳思捷水純化技術有限公司；KQ-500DE 型超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FD.1C.50 型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 材料

對照品人參皂苷Rg1（Rg1，批號110703-202034，質量分數94.0%）、人參皂苷Re（Re，批號110754-202129，質量分數96.0%）、人參皂苷Rb1（Rb1，批號110704-202129，質量分數94.3%）、橙皮苷（批號110721-202019，質量分數95.3%）、厚樸酚（批號110729-202015，質量分數99.0%）、和厚樸酚（批號110730-201915，質量分數99.8%）、甘草酸（批號10731-202122，質量分數94.4%）、甘草苷（批號111610-201908，質量分數95.0%）、廣藿香酮（批號111822-201904，質量分數99.0%）、綠原酸（批號110753-035，質量分數98.0%）、6-姜辣素（批號1118-2020070，質量分數99.3%）、奎寧酸（批號111717-20140，質量分數94.5%）、柚皮苷（批號110722-202116，質量分數93.5%）、毛蕊花糖苷（批號111530-201914，質量分數95.2%）、川陳皮素（批號112055-202102，質量分數99.7%）、橘皮素（批號112054-202102，質量分數99.7%）、腺苷（批號110879-201703，質量分數99.7%）、鳥苷（批號111977-201501，質量分數93.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品蒼術苷A（批號126054-77-1，質量分數98.0%）購自中科華檢（北京）科技有限公司；對照品兒茶素（批號Lot5878，質量分數98.0%）、芹糖甘草苷（批號74639-14-8，質量分數98.0%）均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；對照品新綠原酸（批號DST180130-015，質量分數99.0%）、隱綠原酸（批號DST170210-035，質量分數98.0%）均購自成都德思特生物科技有限公司。色譜甲醇、色譜乙腈，購自Dikma 科技有限公司；色譜磷酸，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分析甲醇，購自廣州化學試劑廠；超純水，實驗室自制。

11 味藥材均購于其道地產地或主產區(qū)，經國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司質量部劉國慧副主任中藥師鑒定，各藥材基原如下：人參為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC. A. Mey.的干燥根和根莖，半夏為天南星科半夏屬植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，厚樸為木蘭科厚樸屬植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd. et Wils 的干燥干皮及枝皮，蒼術為菊科蒼術屬植物茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.) DC.的干燥根莖，橘紅為蕓香科柑橘屬植物橘CitrusreticulataBlanco 及其栽培變種的干燥外層果皮，廣藿香為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.的干燥葉，草果為姜科豆蔻屬植物草果Amomumtsao-koCrevost et Lemaire 的干燥成熟果實，茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核，甘草為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.干燥根和根莖，生姜為姜科姜屬多年生草本植物姜ZingiberofficinaleRoscoe 的新鮮根狀莖，烏梅為薔薇科李屬木本植物梅Prunusmume(Sieb.) Sieb.et Zucc.的近成熟果實。各藥材按《中國藥典》2020年版一部項下檢測均合格。本研究參考《中國藥典》2020 年版藥材項下炮制方法，對藥材進行炮制及檢測，在檢測合格的基礎上采用隨機數表法將不同批次藥材進行組合，藥材批號及產地組合信息見表1。

2 方法與結果

2.1 基準樣品的制備

原方記載：半夏（湯洗七次）、厚樸（去粗皮、姜汁炒）、蒼術（米泔浸一宿，洗切，炒）各一兩，橘紅七錢半，藿香葉（洗去土）、草果（去皮膜）、茯苓（去黑皮）、人參（去蘆）各半兩，炙甘草二錢半。右?咀，每服四錢，水一盞半，姜七片，烏梅一個，煎六分，熱服。按照《中國科學技術史·度量衡卷》[11]記載，明代衡量單位量值小于元代，1 斤量值在596.8 g。而1 斤為16 兩，因此1 兩折合為37.3 g；1 錢折合為3.73 g?！夺t(yī)學正傳》[12]凡例：“凡云用水一盞，即今之白茶盞也，約計半斤之數，余仿此”。明朝1 斤重596.8 g[13]，則所述“一盞水”重298.4 g，約300 g，即300 mL。因此，本實驗采取1 盞等于300 mL 來折算，再看煎煮方法，本方為煮散劑，參考文獻查閱[14]，即得養(yǎng)胃湯處方為清半夏37.30 g，姜厚樸37.30 g，麩炒蒼術37.30 g，橘紅27.98 g，廣藿香葉18.65 g，草果仁18.65 g，茯苓18.65 g，人參18.65 g，炒甘草9.33 g，粉碎成粗粉，生姜7 g，烏梅2.65 g，加水450 mL，武火煮沸后文火煎至270 mL，趁熱濾過。分裝至西林瓶，-50 ℃預冷凍3 h 后冷凍干燥72 h，壓蓋密塞，即得到養(yǎng)胃湯基準樣品凍干粉。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取奎寧酸、腺苷、鳥苷、新綠原酸、蒼術苷A、綠原酸、隱綠原酸、兒茶素、甘草苷、芹糖甘草苷、柚皮苷、橙皮苷對照品，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為21.3、25.6、24.0、22.1、28.7、25.2、29.8、20.5、23.1、20.3、21.0、22.3 μg/mL 的混合對照品溶液1。取毛蕊花糖苷、甘草酸、6-姜辣素、川陳皮素、橘皮素、和厚樸酚、廣藿香酮、厚樸酚對照品，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為21.0、24.3、28.2、20.3、26.8、23.2、21.5、22.7 μg/mL 的混合對照品溶液2。

2.2.2 供試品溶液 取基準樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按“2.1”項下制備方法，分別制備缺清半夏、缺姜厚樸、缺麩炒蒼術、缺橘紅、缺廣藿香葉、缺草果仁、缺茯苓、缺人參、缺炒甘草、缺生姜、缺烏梅的陰性基準樣品。取陰性基準樣品適量，按“2.2.2”項下制備方法分別制備各陰性供試品溶液，即得。

2.2.4 單味藥對照溶液 按“2.1”項下制備方法，分別制備清半夏、姜厚樸、麩炒蒼術、橘紅、廣藿香葉、草果仁、茯苓、人參、炒甘草、生姜、烏梅單味藥基準樣品。取單味藥基準樣品適量，按“2.2.2”項下制備方法分別制備各單味藥供試品溶液。

2.3 養(yǎng)胃湯UPLC 指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件

（1）指紋圖譜I：色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，8%乙腈；15～40 min，8%～15%乙腈；40～65 min，15%～21%乙腈；檢測波長為300 nm；體積流量為0.30 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL。

（2）指紋圖譜II：色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～5 min，25%乙腈；5～60 min，25%～50%乙腈；60～70 min，50%～75%乙腈；檢測波長為203 nm；體積流量為0.30 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL。

2.3.2 精密度試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，結果2 張指紋圖譜各共有峰相對保留時間的RSD均＜1.2%，相對峰面積的RSD 均＜7.0%，結果表明該儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，結果2 張指紋圖譜各共有峰相對保留時間的RSD 均＜0.7%，相對峰面積的RSD 均＜4.7%，結果表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.3.4 重復性試驗 按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，結果2 張指紋圖譜各共有峰相對保留時間的RSD 均＜1.0%，相對峰面積的RSD 均＜4.8%，結果表明該方法重復性較好。

2.3.5 耐用性考察 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，考察不同儀器Waters H-Class UPLC TUV、Waters H-Class UPLC PDA；不同色譜柱選擇同一廠家不同生產批次的Waters UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；不同柱溫33、35、37 ℃；不同體積流量0.27、0.30、0.33 mL/min 下，2 張指紋圖譜各共有峰相對保留時間的RSD 均＜3.0%，相對峰面積的RSD 均＜5.0%，結果表明該指紋圖譜方法在不同儀器、色譜柱、柱溫、流動相體積流量下，該方法耐用性良好。

2.4 UPLC 指紋圖譜的建立及相似度評價

取15 批基準樣品（S1～S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。將上述數據結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件（2012 版），以S1 為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度為0.1 min，進行峰多點校正和mark 峰匹配，其中指紋圖譜I 匹配了24 個共有峰（圖1），指紋圖譜II 匹配了21 個共有峰（圖1）。15 批基準樣品（S1～S15）2 張指紋圖譜相似度均＞0.9（表2），結果表明，不同產地飲片制備所得養(yǎng)胃湯基準樣品的物質基礎成分組成較接近。

圖1 15 批養(yǎng)胃湯基準樣品 (S1～S15) 的UPLC 指紋圖譜I、II 疊加圖及其共有模式圖譜 (RI、RII)Fig.1 UPLC fingerprint I, II overlays of 15 batches of Yangwei Decoction benchmark samples (S1-S15) and common pattern maps (RI, RII)

表2 15 批養(yǎng)胃湯基準樣品 (S1～S15) 指紋圖譜I、II 的相似度評價結果Table 2 Similarity evaluation results of fingerprints I, II of 15 batches of Yangwei Decoction benchmark samples (S1-S15)

2.5 共有峰歸屬

按“2.2.3”“2.2.4”項下方法制備陰性、單味藥對照溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。根據2 套指紋圖譜的相似度匹配結果對共有峰進行編號，經對照品、基準樣品、單味藥樣品、各單味藥陰性樣品相關圖譜色譜峰比對。

圖譜結果顯示：（1）指紋圖譜I：1、2、5、9～11、14 號峰歸屬烏梅；2 號峰歸屬清半夏；1、2、6 號峰歸屬麩炒蒼術；3、4 號峰歸屬茯苓；6～8、10、12、15、17、22～24 號峰歸屬橘紅；13 號峰歸屬草果仁；14、16、18、19 號峰歸屬姜厚樸；20、21 號峰歸屬炒甘草（圖2）；（2）指紋圖譜II：1、5、6、12、18、21 號峰歸屬姜厚樸；2、3、5、7、10、13～15 號峰歸屬橘紅；8、9、12、17、19 號峰歸屬炒甘草；11 號峰歸屬生姜；15～17、20 號峰歸屬廣藿香葉（圖3）。其中，指紋圖譜II 中11 號峰（6-姜辣素）在生姜、姜厚樸單味藥中均具有明顯色譜峰，但在厚樸單味藥基準樣品中未有響應，即姜厚樸單味藥中6-姜辣素是因為厚樸與姜汁一起炮制而引入，所以生姜是6-姜辣素（11 號峰）的唯一來源[15]。

圖2 養(yǎng)胃湯基準樣品與單味飲片和陰性樣品的UPLC 指紋圖譜IFig.2 UPLC fingerprint I of Yangwei Decoction benchmark samples and single herbal pieces and negative samples

圖3 養(yǎng)胃湯基準樣品與單味飲片和陰性樣品的UPLC 指紋圖譜IIFig.3 UPLC fingerprint II of Yangwei Decoction benchmark samples and single herbal pieces and negative samples

2.6 色譜峰指認

養(yǎng)胃湯基準樣品指紋圖譜共標定了45 個特征峰，通過與對照品色譜峰進行比對指認出20 個色譜峰。其中，指紋圖譜I 中1 號峰為奎寧酸、3 號峰為腺苷、4 號峰為鳥苷、5 號峰為新綠原酸、6 號峰為蒼術苷A、9 號峰為綠原酸、11 號峰為隱綠原酸、13 號峰為兒茶素、20 號峰為甘草苷、21 號峰為芹糖甘草苷、23 號峰為柚皮苷、24 號峰為橙皮苷（圖4）；指紋圖譜II 中4 號峰為毛蕊花糖苷、9 號峰為甘草酸、11 號峰為6-姜辣素、13 號峰為川陳皮素、15 號峰為橘皮素、18 號峰為和厚樸酚、20 號峰為廣藿香酮、21 為號峰為厚樸酚（圖5）。

圖4 混合對照品 (A)、養(yǎng)胃湯基準樣品 (B) 和空白溶劑(C) 的UPLC 指紋圖譜IFig.4 UPLC fingerprint I of mixed reference solution (A),Yangwei Decoction benchmark sample (B) and blank solution (C)

圖5 混合對照品 (A)、養(yǎng)胃湯基準樣品 (B) 和空白溶劑(C) 的UPLC 指紋圖譜IIFig.5 UPLC fingerprint II of mixed reference solution (A),Yangwei Decoction benchmark sample (B) and blank solution (C)

2.7 養(yǎng)胃湯中多指標成分定量測定

2.7.1 色譜條件

（1）Rg1、Re、Rb1：色譜柱為Waters Cortecs C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相為乙腈-水；梯度洗脫：0～7.0 min，19%乙腈；7.0～10.5 min，19%～25%乙腈；10.5～22.0 min，25%～29%乙腈；22.0～31.0 min，29%～47%乙腈；31.0～39.0 min，47%～80%乙腈；體積流量0.30 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測器：ELSD，漂移管溫度85 ℃；氣體體積流量1.5 L/min。理論塔板數按Rb1峰計算不低于5 000。

（2）橙皮苷：色譜柱為Waters HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇-水（40∶60）；等度洗脫；體積流量0.30 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長284 nm。理論塔板數按橙皮苷峰計算不低于4 000。

（3）和厚樸酚、厚樸酚：色譜柱為Waters HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇-水（78∶22）；等度洗脫；體積流量0.30 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長294 nm。理論塔板數按厚樸酚峰計算不低于10 000。

（4）甘草酸：色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（31∶69）；等度洗脫；體積流量0.30 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm。理論塔板數按甘草酸峰計算不低于6 000。

2.7.2 對照品溶液的制備 取Rg1、Re、Rb1對照品，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為98.5、97.0、99.8 μg/mL 的混合溶液，搖勻，即得混合對照品溶液。

取橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚、甘草酸對照品適量，精密稱定，加80%甲醇分別制成含橙皮苷40.3 μg/mL 對照品溶液，含厚樸酚22.4 μg/mL、和厚樸酚22.5 μg/mL 的混合對照品溶液，含甘草酸20.2 μg/mL 的對照品溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備

（1）Rg1、Re、Rb1：精密稱取基準樣品1.0 g，加水20 mL 使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次40 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（2）和厚樸酚、厚樸酚、橙皮苷和甘草酸：精密稱取基準樣品0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W、頻率40 Hz）30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 陰性、單味藥供試品溶液的制備 按照“2.7.3”項下供試品溶液制備方法，分別制備缺人參、橘紅、姜厚樸、炒甘草的陰性供試品溶液及單味藥供試品溶液。

2.7.5 專屬性考察 分別取供試品溶液、對照品溶液、陰性供試品溶液、單味藥供試品溶液，按照“2.7.1”項下色譜條件測定。各指標成分在陰性下無干擾，分離度、理論板數均較好，專屬性強，色譜圖見圖6～9。

圖6 養(yǎng)胃湯基準樣品中Rg1、Re 及Rb1 含量測定色譜圖Fig.6 Chromatogram of Rg1, Re and Rb1 content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

圖7 養(yǎng)胃湯基準樣品中橙皮苷含量測定色譜圖Fig.7 Chromatogram of hesperidin content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

圖8 養(yǎng)胃湯基準樣品中和厚樸酚、厚樸酚含量測定色譜Fig.8 Chromatogram of honokiol and magnolol content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

圖9 養(yǎng)胃湯基準樣品中甘草酸含量測定色譜圖Fig.9 Chromatogram of glycyrrhizinic acid content determination in Yangwei Decoction benchmark samples

2.7.6 線性關系考察 分別精密吸取“2.7.2”項下混合對照品溶液適量，用相應溶劑分別稀釋配制成7 個不同質量濃度的系列對照品溶液。按“2.7.1”項下色譜條件測定，以對照品溶液質量濃度或進樣質量的對數為橫坐標（X），測定的峰面積或其對數為縱坐標（Y），分別繪制各成分的標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程及線性范圍分別為Rg1Y＝15 800X＋67 900，r＝0.999 2，線性范圍24.21～484.23 μg/mL；ReY＝15 700X＋67 900，r＝0.999 7，線性范圍22.79～455.81 μg/mL；Rb1Y＝15 700X＋67 600，r＝0.999 3，線性范圍23.51～470.17 μg/mL；橙皮苷Y＝60 900X-77 300，r＝1.000 0，線性范圍7.24～362.14 μg/mL；和厚樸酚Y＝52 000X＋33 000，r＝0.999 8，線性范圍2.52～252.25 μg/mL；厚樸酚Y＝44 300X＋33 800，r＝0.999 8，線性范圍2.20～220.16 μg/mL；甘草酸Y＝5 810X＋7 760，r＝0.999 5，線性范圍4.59～229.73 μg/mL。

2.7.7 精密度考察 按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液1 份，按“2.7.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸峰面積的RSD 分別為2.2%、2.0%、1.8%、0.3%、0.5%、0.4%、1.1%，結果表明儀器精密度良好。

2.7.8 穩(wěn)定性考察 按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液1 份，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 后，按“2.7.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸峰面積的RSD 分別為3.7%、4.5%、3.6%、1.2%、0.8%、1.1%、1.7%，結果表明該供試品溶液在48 h 內穩(wěn)定。

2.7.9 重復性考察 按“2.7.3”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.7.1”項下色譜條件測定，Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸的質量分數分別為0.099、0.081、0.094、0.691、0.047、0.057、0.093 mg/g，RSD 分別為3.3%、3.0%、2.9%、1.9%、3.9%、3.2%、1.8%，表明建立的方法重復性良好。

2.7.10 準確度考察 取養(yǎng)胃湯基準樣品共9 份，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5 比例加入對照品，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸的平均加樣回收率分別為102.9%、101.3%、102.6%、94.8%、95.0%、107.0%、98.5%，RSD 依次為3.7%、3.4%、4.2%、3.2%、4.2%、2.1%、1.3%，結果表明建立的方法準確度良好。

2.7.11 耐用性考察 按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項下色譜條件測定，考察不同液相儀器、不同色譜柱、柱溫、體積流量對Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸7 種指標成分含量的影響。

（1）不同儀器的影響：Waters H-Class UPLC TUV、Waters H-Class UPLC PDA、島津UPLC-40 DXS 3 種儀器對7 種指標成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測定的RSD 分別為3.0%、2.3%、2.4%、2.9%、1.7%、1.9%、3.1%。

（2）不同色譜柱的影響：Waters HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Cortecs C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）、Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）對7 種指標成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測定的RSD 分別為3.6%、1.4%、4.2%、3.9%、2.4%、2.3%、3.7%。

（3）不同體積流量的影響：考察0.27、0.30、0.33 mL/min 3 種不同體積流量對7 種指標成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測定的RSD 分別為3.1%、3.4%、2.3%、3.2%、2.8%、3.0%、3.4%。

（4）不同柱溫的影響：考察28、30、32 ℃ 3 種不同柱溫對7 種指標成分Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量測定的RSD 分別為3.6%、2.4%、1.9%、1.7%、1.6%、1.8%、2.2%。結果表明，以上考察因素測定的各指標成分含量的RSD 均小于5%，表明各考察因素對Rg1、Re、Rb1、橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草酸含量的測定影響較小。

2.7.12 樣品測定 取15 批養(yǎng)胃湯基準樣品（S1～S15），按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，以含量測定均值上下浮動30%規(guī)定出各指標成分的含量范圍，結果見表3。結果表明：（1）Rg1的平均質量分數為0.120 mg/g，波動范圍0.081～0.163 mg/g，均值的±30%為0.084～0.155 mg/g，S5、S8 不在范圍內；Re 的平均質量分數為0.093 mg/g，波動范圍0.053～0.175 mg/g，均值的±30%為0.065～0.120 mg/g，S5、S10不在范圍內；Rb1的平均質量分數為0.352 mg/g，波動范圍0.225～0.554 mg/g，均值的±30%為0.246～0.457 mg/g，S5、S8、S13 不在范圍內；（2）橙皮苷的平均質量分數為7.015 mg/g，波動范圍5.778～8.926 mg/g，均值的±30%為4.911～9.120 mg/g，均在范圍內；（3）和厚樸酚＋厚樸酚的平均質量分數為1.387 mg/g，波動范圍0.834～2.865 mg/g，均值的±30%為0.971～1.804 mg/g，S1、S3、S5 不在范圍內；（4）甘草酸的平均質量分數為1.414 mg/g，波動范圍 1.060～1.825 mg/g，均值的±30%為0.990～1.838 mg/g。

表3 15 批基準樣品中7 種指標性成分含量測定Table 3 Determination of seven index components in 15 batches of benchmark samples

3 討論

3.1 色譜條件的考察

本研究考察了不同流動相體系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液）對養(yǎng)胃湯色譜峰的影響，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液體系時，各色譜峰響應良好，對稱性好，分離度好。在上述色譜條件下，采用全波長（200～400 nm）掃描，在前期建立的一套指紋圖譜方法中，由于各色譜峰分離度差、響應較低，因此根據化合物成分特點與極性大小[16]，篩選2 種不同的色譜條件，其中指紋圖譜I 波長為300 nm 時能夠得到有機酸類、核苷類、酚酸類、黃酮類成分；指紋圖譜II波長為203 nm 時能夠得到苯乙醇類、糖苷類、黃酮苷元、酚類以及揮發(fā)性成分，建立的2 套指紋圖譜分析方法，其色譜峰豐富，響應高，能較全面表征養(yǎng)胃湯基準樣品內在質量。

在含量測定方法中考察了不同流動相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液），不同漂移管溫度（85、105 ℃）及不同載氣流量（1.5、2.0 L/min）對養(yǎng)胃湯基準樣品中人參皂苷類成分含量的影響，結果表明在流動相為乙腈-水，漂移管溫度85 ℃，氣體體積流量1.5 L/min 時各色譜峰響應良好，分離度好。

對建立的指紋圖譜與7 種指標性成分含量測定方法進行方法學考察，均符合要求，表明所建立的方法穩(wěn)定可行，可用于養(yǎng)胃湯基準樣品的測定。

3.2 供試品溶液的考察

本研究考察了不同比例的甲醇（50%、70%、100%甲醇），不同提取方式（超聲處理、加熱回流）及不同提取時間（30、45、60 min）對指紋圖譜色譜峰的影響，在提取溶劑為50%甲醇、超聲處理30 min時色譜峰較豐富，各色譜峰響應良好。

本研究考察了不同提取溶劑（甲醇、水飽和正丁醇萃?。?，不同取樣量（0.5、1.0、1.5 g）對養(yǎng)胃湯基準樣品中人參皂苷類成分含量的影響，結果表明在取樣量為1.0 g 采用水飽和正丁醇萃取時人參皂苷類成分提取率較高。

3.3 指紋圖譜結果分析

15 批基準樣品指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明15 批養(yǎng)胃湯基準樣品物質基礎組成較穩(wěn)定。通過對照品比對共指認出20 個色譜峰。指紋圖譜表征了10 味藥，由于人參中主要皂苷類成分為紫外末端吸收[17]，指紋圖譜中無共有峰歸屬于人參，但建立了人參皂苷的含量測定方法，綜合2 種方法，養(yǎng)胃湯中11 味藥都得以表征。

3.4 定量指標成分的選擇與限度范圍

養(yǎng)胃湯所含藥味眾多，化學成分復雜。在前期研究中，臣藥廣藿香葉專屬性成分百秋李醇、廣藿香酮為揮發(fā)性成分且含量較低，不適宜作為含量測定指標[18]；佐藥草果仁主要化學成分包括揮發(fā)油、酚類等，在前期研究中，對草果仁藥材中專屬性成分兒茶素進行含量測定發(fā)現其含量較低，兒茶素為脂溶性成分，水溶性較差，不適宜作為含量測定指標[19]；佐藥烏梅專屬性成分為新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸，含量相對較高，但由于很多中藥材均含有該3 種成分，專屬性較差，故上述3 種成分不適宜作為含量測定指標[20-23]；茯苓主要成分為多糖和三萜類成分[24]，半夏中主要有效成分為氨基酸、生物堿、核苷等[25]，含量較低，暫未建立質量分析方法，后續(xù)本課題組將做進一步研究。

養(yǎng)胃湯中人參為君藥，人參皂苷是其主要活性成分[26]，通過ELSD 建立了人參含量測定分析方法，其中Rg1的含量波動范圍0.081～0.163 mg/g，均值的±30%為0.084～0.155 mg/g，S5、S8 的Rg1含量分別高于上限和低于下限；Re 含量波動范圍0.053～0.175 mg/g，均值的±30%為0.065～0.120 mg/g，S5、S10 的Re 含量分別高于上限和低于下限；Rb1含量波動范圍0.225～0.554 mg/g，均值的±30%為0.246～0.457 mg/g，S5、S8、S13 的Rb1含量分別高于上限和低于下限，可能是取樣時參須和參身比例的差異使其離群[27-28]。佐藥姜厚樸專屬性成分和厚樸酚＋厚樸酚總量波動范圍 0.834～2.865 mg/g，均值的±30%為0.971～1.804 mg/g，S1、S3、S5 的和厚樸酚與厚樸酚總含量不在范圍內，可能是飲片中有根皮、枝皮或2 個混合等用藥部位的差異使其離群[29-30]。佐藥橘紅專屬性成分橙皮苷波動范圍5.778～8.926 mg/g，均值的±30%為4.911～9.120 mg/g，均在范圍內；使藥炒甘草專屬性成分甘草酸波動范圍1.060～1.825 mg/g，均值的±30%為0.990～1.838 mg/g，所有批次均在范圍內。上述結果表明養(yǎng)胃湯基準樣品各批次間指標性成分含量差異較小。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突