李 倩， 湯凱潔， 冀坤霞， 聶馨夢， 郎濟(jì)洲， 杜華英， 顧小紅

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 江西 南昌 330045; 2. 食品科學(xué)與資源挖掘全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

磺胺類藥物 （SAs） 是一類以對氨基苯磺酰胺（sulfanilamide，SN） 為基本結(jié)構(gòu)的合成抗菌藥的總稱，是我國目前使用量居第二的獸用抗菌藥。SAs 具有抗菌譜廣、價(jià)格低、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于治療、預(yù)防動(dòng)物疾病或促進(jìn)動(dòng)物生長[1]。 SAs 的超劑量、超范圍使用導(dǎo)致其在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，并通過食物鏈傳給消費(fèi)者[2]，引起人體的過敏反應(yīng)、急慢性毒性，使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，甚至有致癌、致畸、致突變等風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。 為保障消費(fèi)者安全，多個(gè)國家和政府都制定了SAs 最大殘留限量 （maximum residue limit，MRL） 標(biāo)準(zhǔn)。 如國際食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC） 規(guī)定動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟、脂肪等食品中SAs 的MRL 為100 μg/kg[5]；我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235 號公告規(guī)定所有動(dòng)物源性食品中SAs 總的MRL 為100 μg/kg，磺胺二甲基嘧啶在牛奶中的MRL 為25 μg/kg[6]；歐盟地區(qū)、日本等國家也對SAs 的MRL 做出了相同規(guī)定。 可見SAs在國內(nèi)外都有嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，為加強(qiáng)監(jiān)管，建立一種準(zhǔn)確度好、靈敏度高的SAs 多殘留檢測方法具有重要意義。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國SAs 在2013 年的年消耗量達(dá)到了7 890 t， 而其中88.5%是用于養(yǎng)殖業(yè)[7]。SAs 在畜禽類（豬肉、雞肉、鴨肉）[8]、蜂蜜[9]、奶牛糞污[10]中都有檢出。 在飲用水[11]、蝦[12]以及泰國進(jìn)口的鯰魚[13]中都檢測出了磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑與磺胺甲惡嗪。 董燕等對昌吉市3 種食用魚（草魚、鯉魚、鰱魚）體內(nèi)磺胺類藥物殘留進(jìn)行分析，在20 批次不同季度的鯉魚體內(nèi)均檢出了SAs[14]?？梢娝a(chǎn)品中SAs 的殘留不容樂觀，而江西水產(chǎn)中SAs 殘留目前未見報(bào)道。目前，檢測SAs 殘留的主要方法有免疫分析法與儀器分析法。 免疫分析法有酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[15]與膠體金法 （colloidal gold -based immunochromato-graphic assay，CGIA）[16]， 這兩種方法都是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合進(jìn)行檢測，具有靈敏度高、檢測速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。 但目前國內(nèi)外這種快速檢測方法僅用于篩查，篩查到的陽性樣品仍然需要采用儀器方法進(jìn)一步確證。 儀器分析法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[17-18]、 高效液相色譜法[19-21]、超/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra/high liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC/LC-MS/MS）[22-26]等。這些方法操作自動(dòng)化程度高，定性定量準(zhǔn)確，HPLC 儀器相比其他兩種儀器價(jià)格更便宜，是目前國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和檢測中心都配備的儀器，因此其應(yīng)用更廣。 由于雜質(zhì)峰會(huì)干擾檢測和堵塞色譜柱， 因此使用HPLC 檢測前需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的凈化富集預(yù)處理。 食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，為了去除樣品中雜質(zhì)的干擾，通常都需要采用固相萃取柱凈化和富集處理， 如采用MCX 固相萃取柱[27]、PCX 固相萃取柱[28]和HLB 固相萃取柱[29]凈化富集雞肉樣品，QuEChERS 凈化管[30]處理魚肉制品等。 這幾種凈化富集小柱中，PCX 固相萃取柱填料為混合型弱陽離子交換聚合物材料，具有離子交換和反相保留雙重作用，其比表面積大，適用的pH范圍廣，結(jié)合容量大，而且價(jià)格較MCX 固相萃取柱與HLB 固相萃取柱低50%~70%， 適用于富集和提取堿性化合物，如SAs。 但目前未見采用PCX 固相萃取柱預(yù)處理魚肉樣品報(bào)道。 以對氨基苯磺酰胺為SAs 母體結(jié)構(gòu)， 在酰胺鍵上異構(gòu)不同官能團(tuán)衍生了30 多種不同的SAs 抗菌藥，不同SAs 由于其極性和分子大小不同，其高效液相色譜分離條件不同。 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中13 種磺胺類藥物多殘留的測定高效液相色譜法》（GB 29694—2013）[27]報(bào)道了13 種SAs 的檢測方法， 作者選擇了15 種SAs 為研究對象， 其中有7 種是國家標(biāo)準(zhǔn)方法中沒有包含的。 研究15 種SAs 的HPLC 分離條件和價(jià)格更低廉的PCX 固相萃取柱對水產(chǎn)品中SAs 提取凈化條件， 建立了同時(shí)測定水產(chǎn)品中15 種SAs 的SPE-HPLC 分析方法。該方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法比較，不僅增加了兩種SAs 的檢測，且有7 種SAs 與國家標(biāo)準(zhǔn)中不同， 另外篩選的PCX 固相萃取柱價(jià)格低，重復(fù)和重現(xiàn)性好，方法的檢出限和靈敏度能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)中的限量要求，為水產(chǎn)品中SAs 的殘留檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 15 種SAs 標(biāo)準(zhǔn)品磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、 磺胺噻唑 （sulfathiazole，ST）、 磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、 磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SM1）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfameter，SMD）、磺胺甲噻二唑 （sulfamethizole，SMT）、 磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine，SM2）、磺 胺 甲 氧 噠 嗪（sulfamethoxypyridazine，SMP）、 磺 胺 氯 噠 嗪（sulfachloropyridazine，SCP）、 磺 胺 甲 惡 唑（sulfamethoxazole，SMZ）、 磺 胺 間 甲 氧 嘧 啶（sulfamonomethoxine，SMM）、 磺胺多辛（sulfadoxin，SDO）、磺胺異噁唑（sulfisoxazole，SIZ）、磺胺氯吡嗪鈉 （sulfachloropyrazine sodium，SPZ）、 磺胺喹噁啉（sulfachinoxalin，SQ）： 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 其他試劑與材料甲醇、 乙腈 （均為色譜純）：美國TEDIA 天地試劑公司；冰乙酸、乙酸乙酯、正己烷（均為色譜純）、無水硫酸鈉（分析純）：美國Macklin 公司；十二水合磷酸氫二鈉、氨水（均為分析純）： 西隴科學(xué)股份有限公司； 無水磷酸二氫鈉（分析純）： 阿拉丁生化科技股份有限公司；QuEChERS 凈化管（15 mL，含有吸附劑PSA 0.15 g、C180.15 g、MgSO40.9 g）： 逗點(diǎn)生物科技有限公司；PCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL）：博納艾杰爾科技有限公司；HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL）：德國CNW公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。 草魚：購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters E2695 高效液相色譜儀 （ 配有Waters2998 光電二極管陣列檢測器 （PDA）和Empower 色譜工作站）、Waters C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）色譜柱：美國Waters 公司；HC-2518R 型高速冷凍離心機(jī)： 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HSE-24B 真空固相萃取裝置：上海皓莊儀器有限公司；WD-12 氮吹儀： 杭州奧盛儀器有限公司；Milli-Q 純水儀：德國Millipore 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件Waters C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm） 色譜柱；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流量1 mL/min；PDA 波長270 nm；流動(dòng)相：溶液A 為甲醇， 溶液B 為含體積分?jǐn)?shù)1.1%乙酸的PBS 緩沖液（0.01 mol/L）； 梯度洗脫程序：0~30 min， 體積分?jǐn)?shù)95% 溶液B；30~50 min， 體積分?jǐn)?shù)80%溶液B；50~55 min，體積分?jǐn)?shù)60%溶液B；55~60 min，體積分?jǐn)?shù)60%溶液B；60~65 min，體積分?jǐn)?shù)95%溶液B。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與流動(dòng)相的配制分別準(zhǔn)確稱取15 種SAs 標(biāo)準(zhǔn)品15.0 mg 于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為300 μg/mL 的單標(biāo)儲(chǔ)備液。 再由300 μg/mL 的單標(biāo)儲(chǔ)備液配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL 的單標(biāo)和系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0 μg/mL），于-18 ℃下避光密閉保存。

1.3.3 流動(dòng)相的配制含體積分?jǐn)?shù)1.1%乙酸的PBS 緩沖液（0.01 mol/L）：準(zhǔn)確稱取3.58 g Na2HPO4、1.56 g NaH2PO4， 用超純水溶解， 加11 mL 的冰醋酸，超純水定容至1 L。

1.3.4 樣品的前處理

1） 提取 參考國家標(biāo)準(zhǔn) 《水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》（GB/T 30891—2014）[31]，取肌肉、魚皮等可食部分?jǐn)囁榛靹騻溆茫Q取勻漿試樣1.00 g（精確至0.01 g），置于50 mL 已加有5.00 g 無水硫酸鈉的聚丙烯具塞離心管中，加入3 mL 的乙酸乙酯提取溶劑，渦旋混勻2 min， 超聲提取30 min，8 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，殘?jiān)儆? mL的乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。

2） 凈化與過柱 將乙酸乙酯提取液在45 ℃氮?dú)庀麓蹈桑?加入5 mL 0.1 mol/L HCl 和10 mL 正己烷， 渦旋混勻1~2 min， 然后以8 000 r/min 離心5 min，棄去上層正己烷，下層的鹽酸層留待PCX 固相萃取柱凈化。

PCX 固相萃取柱洗脫程序：PCX 固相萃取柱依次用3 mL 甲醇、3 mL 0.1 mol/L HCl 活化， 將離心所得的鹽酸層樣液以5 滴/s 的速度過PCX 固相萃取柱，再用3 mL 甲醇、3 mL 0.1 mol/L HCl 淋洗，最后用4 mL 體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇洗脫。HLB 固相萃取柱洗脫程序：HLB 固相萃取柱依次用3 mL 甲醇、3 mL 超純水活化， 將離心所得的鹽酸層樣液以5滴/s 的速度過HLB 固相萃取柱， 依次用3 mL 水、3 mL 體積分?jǐn)?shù)5%甲醇淋洗， 最后用4 mL 體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇洗脫。 QuEChERS 凈化管應(yīng)用程序：將離心所得的鹽酸層樣液轉(zhuǎn)移到QuEChERS 凈化管中，渦旋混勻1 min，8 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。 分別收集PCX 固相萃取柱、HLB 固相萃取柱的洗脫液與QuEChERS 凈化管中凈化后的上清液，于45 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL 初始比例流動(dòng)相復(fù)溶，復(fù)溶液過0.22 μm 濾膜，留待高效液相色譜測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)進(jìn)行3 次，不同提取溶劑的提取回收率顯著性分析采用IBM SPSS Statistics 27 處理，P<0.05 表示差異顯著；HPLC 數(shù)據(jù)采用Empower 色譜工作站采集； 使用Origin 2018 和Excel 2016 進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 15 種SAs 紫外吸收波長的確定

采用高效液相色譜在200~400 nm 波長進(jìn)行掃描，確定了15 種SAs 的最大吸收波長，結(jié)果見表1。由表1 可知，所檢測的15 種SAs 在250~285 nm 時(shí)有較強(qiáng)的吸收， 后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇270 nm 作為15 種SAs 的最大吸收波長，即檢測波長。

表1 15 種SAs 的最大吸收波長Table 1 Maximum absorption wavelengths of 15 kinds of SAs

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序1Table 2 Mobile phase gradient elution procedure 1

表3 流動(dòng)相梯度洗脫程序2Table 3 Mobile phase gradient elution procedure 2

表4 流動(dòng)相梯度洗脫程序3Table 4 Mobile phase gradient elution procedure 3

2.2 流動(dòng)相與梯度洗脫程序優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)15 種SAs 完全分離， 流動(dòng)相條件采用梯度洗脫，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3 種不同的梯度洗脫分離程序， 考察不同梯度洗脫對15 種SAs（各組分質(zhì)量濃度均為2 μg/mL）分離效果的影響， 梯度洗脫程序1、2、3 分別如表1、2、3 所示，分離色譜圖如圖1 所示。 采用梯度洗脫程序1 分離得到的色譜圖如圖1 中A 所示， 在15~35 min，SD、ST、SPD、SM1 四種SAs 完全分離， 但響應(yīng)較低；在40~47 min，9 種SAs 響應(yīng)較好，但未實(shí)現(xiàn)完全分離。采用梯度洗脫程序2 分離得到的色譜圖如圖1 中B所示，絕大部分SAs 的出峰時(shí)間提前，13~37 min 色譜峰完全分離， 但SAs 響應(yīng)值較低；SDO 與SIZ 未實(shí)現(xiàn)完全分離。 采用梯度洗脫程序3 分離得到的色譜圖如圖1 中C 所示，色譜圖SMD（峰5）與SMT（峰6） 兩峰之間的分離度為1.2， 實(shí)現(xiàn)了98%的分離，其余相鄰兩峰之間分離度均不小于1.5，實(shí)現(xiàn)了完全分離，且峰形對稱，更尖銳。 因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇梯度洗脫程序3 進(jìn)行分析與定量。

圖1 15 種SAs 3 種梯度洗脫程序高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatograms of 15 kinds of SAs under 3 kinds of elution procedures

2.3 SAs 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將1.3.2 中所配制的系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)行高效液相色譜測定，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制SAs 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，15 種SAs 的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。

2.4 提取條件的優(yōu)化

2.4.1 樣品提取溶劑的選擇15 種SAs 的衍生基團(tuán)不同，其極性大小不同。 不同的提取溶劑會(huì)影響其提取回收率，一般采用極性有機(jī)溶劑進(jìn)行提取以避免提取出過多的脂肪。 根據(jù)15 種SAs 的理化性質(zhì)和相關(guān)文獻(xiàn)，對比了體積分?jǐn)?shù)3%乙酸乙腈、乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇、乙腈、體積分?jǐn)?shù)80%乙腈與二氯甲烷6 種提取溶劑對15 種SAs 提取效果（n=6）。 在空白魚肉樣品中加入1 mL 5 μg/g SAs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.4 中的提取方法處理，計(jì)算不同提取溶劑的提取回收率（n=6），比較結(jié)果如圖3所示， 此外， 采用新復(fù)極差法 （shortest significant ranges，SSR） 比較不同提取溶劑的提取回收率是否具有顯著差異，結(jié)果如表5 所示。 由圖3 與表5 可見，采用乙酸乙酯提取時(shí)雜峰干擾小，對15 種SAs的提取回收率在84.1%~102.7%， 這與鄭斌等運(yùn)用高效液相色譜測定水產(chǎn)品中的14 種SAs （88.9%～98.6%）[32]結(jié)果一致且提取回收率略高；乙腈的提取回收率在64.6%~92.0%，其對極性弱的SAs 提取效果不佳，尤其對SIZ 與SPZ，提取回收率僅為65.0%左右，而且在用正己烷凈化過程中會(huì)產(chǎn)生乳化貼壁現(xiàn)象，且色譜圖上雜峰較多，雜質(zhì)干擾大；體積分?jǐn)?shù)3%乙酸乙腈與二氯甲烷提取回收率在70.8%~99.0%，其對弱極性SAs 提取效果較好，而對ST 與SPZ 提取回收率較低；體積分?jǐn)?shù)80%乙醇和體積分?jǐn)?shù)80%乙腈雜質(zhì)干擾相對較小， 對15 種SAs 的提取回收率在68.3%~94.9%。 由表5 可見，因檢測的SAs 和所比較的提取溶劑種類較多，6 種不同的提取溶劑間對每種磺胺類藥物提取回收率間差異的顯著性均不完全一致， 但乙酸乙酯對大部分的SAs提取回收率與其他提取溶劑相比存在顯著差異（P<0.05），因此，綜合考慮，最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對15 種SAs 的提取回收率比較Fig. 3 Comparison of extraction recoveries of 15 kinds of SAs using different solvents

表5 6 種不同提取溶劑對15 種SAs 提取回收率的差異顯著性分析（SSR0.05）Table 5 Significance analysis of the differences in the extraction recoveries of 15 kinds of SAs with 6 different extraction solvents （SSR0.05）

2.4.2 凈化小柱的篩選樣品按照1.3.4 中的提取與正己烷脫脂，下層的HCl 層樣液分別過PCX 固相萃取柱、HLB 固相萃取柱與QuEChERS 凈化管，對SAs 的加標(biāo)回收率進(jìn)行比較。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCX 固相萃取柱凈化效果好，雜質(zhì)干擾少，加標(biāo)回收率在72.1%~100.2%，略高于其他學(xué)者[33-34]用PCX 固相萃取柱對豬肉（70.2%~89.9%）與蜂蜜（77%~99%）樣品中SAs 檢測的加標(biāo)回收率；雖然HLB 固相萃取柱凈化后雜質(zhì)干擾也少，但加標(biāo)回收率低， 僅為6%~10%， 說明HLB 固相萃取柱對SAs 吸附能力差；QuEChERS 凈化管凈化后雜質(zhì)干擾最大，且加標(biāo)回收率低，為9%~17%。 因此，選擇PCX 固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化。

2.4.3 上樣溶劑的篩選實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同極性的上樣溶劑會(huì)影響PCX 固相萃取柱對SAs 的保留效果。 為了最大程度地保留SAs，提高加標(biāo)回收率，溶解樣品的溶液極性必須較弱。 實(shí)驗(yàn)分別對體積分?jǐn)?shù)2%乙酸水溶液（pH 3）、 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% NaOH溶液（pH 7）、PBS 緩沖液、0.1 mol/L HCl 4 種上樣溶劑的SAs 吸附效果進(jìn)行了比較。 樣品按照1.3.4 中的方法提取后， 分別加入5 mL 上述的4 種上樣溶劑與10 mL 正己烷，凈化后棄去正己烷層過PCX 固相萃取柱后供HPLC 分析，結(jié)果如圖4 所示。由圖可見，以0.1 mol/L HCl 為上樣溶劑時(shí)，檢測上樣流出液幾乎未檢測到15 種SAs 的色譜峰， 說明15 種SAs 基本被PCX 固相萃取柱保留（見圖4 中A），加標(biāo)回收率為73.1%~109.6%； 以PBS 緩沖液為上樣溶劑時(shí)， 檢測上樣流出液也幾乎未檢測到15 種SAs，但在5~7 min 處雜峰干擾較多（見圖4 中B），加標(biāo)回收率為68.7%~97.5%； 而體積分?jǐn)?shù)2%乙酸水溶液 （pH 3） 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% NaOH 溶液（pH 7）為上樣溶劑時(shí)，在上樣流出液中檢測到多種明顯的SAs 色譜峰， 兩者對15 種SAs 的加標(biāo)回收率偏低，分別為56.6%~84.2%與9.0%~47.6%。 尤其是質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% NaOH 溶液（pH 7）為上樣溶劑時(shí)，流出液中有6 種SAs 色譜峰很高，說明采用這兩種溶劑上樣時(shí)對絕大部分的SAs 保留效果較差，可能是SAs 易溶于稀堿溶液，導(dǎo)致加標(biāo)回收率降低。

圖4 不同上樣溶液對15 種SAs 的保留效果Fig. 4 Effects of different loading solutions on the retention of 15 kinds of SAs

2.4.4 淋洗條件的選擇淋洗是為了洗掉干擾組分，而SAs 被保留。 分別比較了3 mL 的水、體積分?jǐn)?shù)2%甲酸水溶液與0.1 mol/L HCl 淋洗PCX 固相萃取柱，分別收集不同淋洗液后采用高效液相色譜檢測分析，發(fā)現(xiàn)均未檢測到15 種SAs，說明三者淋洗液極性強(qiáng)度適中，都可以淋洗雜質(zhì)。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇3 mL 0.1 mol/L HCl 作為淋洗液。

2.4.5 洗脫條件的選擇為了完全洗脫P(yáng)CX 固相萃取柱吸附的15 種SAs，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本文中比較了3 種洗脫液（甲醇-乙酸乙酯-氨水（體積比為49∶49∶2） 混合液[35]、甲醇[36]、體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇[37]）對SAs 的洗脫效果，結(jié)果如圖5 所示。 當(dāng)以體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇洗脫時(shí)，樣品中15 種SAs 幾乎完全被洗脫，洗脫回收率在78.7%~89.3%（見圖5中A）；以甲醇-乙酸乙酯-氨水（體積比為49∶49∶2）混合液洗脫時(shí)，除SPD 未被洗脫，其余SAs 均被洗脫，洗脫回收率略低于體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇（見圖5 中B）；以甲醇洗脫時(shí)，只有少部分的目標(biāo)物能被洗脫， 且洗脫回收率僅為7.0%~26.0%（見圖5 中C）。因此，強(qiáng)極性的體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇洗脫效果最好。 此外， 比較了4 種不同體積分?jǐn)?shù) （1%、3%、5%、7%）的氨化甲醇對15 種SAs 的洗脫效果。結(jié)果顯示隨著氨化甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫回收率呈上升趨勢。 這與王宏宇等采用SPE-UPLC 同時(shí)測定豬肉中22 種磺胺類藥物殘留所優(yōu)化的洗脫條件[38]一致。 體積分?jǐn)?shù)為5%和7%的氨化甲醇對15 種SAs 的洗脫回收率分別為78.7%~89.3%、82.5%~103.5%，兩者洗脫回收率比較接近。體積分?jǐn)?shù)1%氨化甲醇洗脫回收率僅為21.4%~45.8%，而體積分?jǐn)?shù)3%氨化甲醇為62.1%~82.3%。最終選擇以體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇作為PCX 固相萃取柱的洗脫液。

圖5 不同洗脫液對15 種SAs 的洗脫效果Fig. 5 Elution effects of different eluents on 15 kinds of SAs

2.5 加標(biāo)回收率與精密度

準(zhǔn)確稱取1.00 g 空白魚肉樣品，進(jìn)行3 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平（500、1 000、2 000 μg/kg） 的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)； 按照1.3.4 的前處理方法對樣品進(jìn)行處理后采用高效液相色譜檢測。 每個(gè)水平重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線校正并測定SAs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算加標(biāo)回收率、日內(nèi)與日間的RSDs，空白魚肉樣品與加標(biāo)魚肉樣品色譜圖見圖6 中A 和B，其結(jié)果見表6。由表6 可見， 除2 000 μg/kg SPZ 的加標(biāo)回收率略低（73.1%）， 其他SAs 在3 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的加標(biāo)回收率在78.6%~109.6%，RSDs 在1.0%~6.7%，日內(nèi)與日間的RSDs 分別在1.3%~6.7% 與1.0%~6.4%，說明所建立方法準(zhǔn)確，重復(fù)性與重現(xiàn)性均較好。

圖6 空白魚肉樣品及加標(biāo)樣品的高效液相色譜圖Fig. 6 High performance liquid chromatograms of the blank and spiked fish samples

表6 15 種SAs 的加標(biāo)回收率與精密度Table 6 Recoveries and precision of 15 kinds of SAs

2.6 檢出限與定量限

準(zhǔn)確取1.00 g 的空白草魚樣品，并向其中添加不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 按照1.3.4 的前處理方法對樣品進(jìn)行處理后上機(jī)檢測。 按照相關(guān)文獻(xiàn)所報(bào)道的關(guān)于分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則[39-40]，用基于響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來定義方法的檢出限 （limits of detection，LODs） 和定量限（limits of quantitation，LOQs），結(jié)果見表7。方法的檢出限與定量限分別在10~20 μg/kg 與20~60 μg/kg，該方法的檢出限和定量限能滿足標(biāo)準(zhǔn)的需要。

表7 該方法的線性范圍、線性方程、檢出限與定量限Table 7 Linear range, linear equation, LOD, and LOQ of the method

2.7 實(shí)際樣品的測定

采用實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法，對從當(dāng)?shù)厥袌霾少彽啮a魚、鱸魚、巴沙魚、黑魚、蝦、草魚、鯰魚、鰱魚、鳙魚與鱖魚10 種不同水產(chǎn)品進(jìn)行了檢測， 每種樣品重復(fù)檢測5 次，采用保留時(shí)間定性的方式對樣品中的SAs 進(jìn)行篩查， 均未檢測出陽性樣品，10 種不同水產(chǎn)品HPLC 色譜圖如圖7 所示， 可見江西水產(chǎn)品中SAs 殘留情況并不嚴(yán)重。

圖7 10種樣品高效液相色譜圖Fig. 7 High performance liquid chromatograms of 10 samples

3 結(jié) 語

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了15 種SAs 的HPLC 檢測條件，篩選了適用于水產(chǎn)品富集與凈化的PCX 固相萃取柱，采用高效液相色譜法結(jié)合SPE 技術(shù)，建立了一種同時(shí)測定水產(chǎn)品中15 種SAs 殘留的方法。 樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，PCX 固相萃取柱凈化后，采用Waters C18色譜柱分離檢測， 除2 000 μg/kg SPZ 的加標(biāo)回收率略低（73.1%），其他SAs 在3 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平下的加標(biāo)回收率在78.6%~109.6%，RSDs 在1.0%~6.7%，方法的檢出限與定量限分別在10~20 μg/kg 與20~60 μg/kg。采用該方法對江西10種水產(chǎn)品中的15 種SAs 殘留進(jìn)行了檢測， 結(jié)果均未檢出，可見江西水產(chǎn)品SAs 殘留情況并不嚴(yán)重。