董瑩瑩 郭琴 高煥 張立石 柏冬

杜仲為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv的干燥樹皮,是我國(guó)歷史悠久的名貴中藥材,該植物是稀有瀕危植物,已被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種。它是中國(guó)最有價(jià)值的補(bǔ)藥之一,具有養(yǎng)肝補(bǔ)腎、強(qiáng)身健骨、預(yù)防流產(chǎn)的作用[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,杜仲在降低血壓[2]、抑制炎癥[3]、降低血糖[4]、減輕肝損傷[5]、減輕神經(jīng)炎癥[6]、抗骨關(guān)節(jié)炎[7]等方面具有重要作用。正是由于杜仲具有多種藥理活性,在臨床上應(yīng)用廣泛,主要用于片劑、膠囊劑、顆粒劑、配方顆粒四種劑型。

目前,雖然對(duì)杜仲的藥代動(dòng)力學(xué)有一些研究[8-9],但對(duì)杜仲及其制劑的藥代動(dòng)力學(xué)分析尚未進(jìn)行研究。本研究基于超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技術(shù)建立杜仲及其制劑中原兒茶酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、無(wú)梗五加苷B、松脂醇葡萄糖苷、京尼平苷、綠原酸、咖啡酸等8個(gè)成分的同時(shí)測(cè)定方法,并應(yīng)用于四種杜仲制劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260高分離度快速液相色譜儀,Agilent 6410質(zhì)譜儀,美國(guó)Agilent科技公司;TGL-16MC型低溫離心機(jī);SB-5200DT超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;VORTEX 3型渦旋混合器,德國(guó)IKA公司

1.2 藥品和試劑

杜仲飲片,江西普真藥業(yè)有限公司,批號(hào):20190322;杜仲全粒膠囊,江西普真藥業(yè)有限公司,批號(hào):Z20055116;杜仲顆粒,貴州參芪藥業(yè)有限公司,批號(hào):Z52020394;杜仲配方顆粒,廣東伊芳藥業(yè)有限公司,批號(hào):20160214;京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、無(wú)梗五加苷B、松脂醇葡萄糖苷,上海源葉生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為Y02A9H57757、J06J9T65071、X26D9L78667、B21724;原兒茶酸、京尼平苷、綠原酸、咖啡酸,中國(guó)北京國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局,批號(hào)分別為110809-200604、111828-201604、0753-200111、110885-201703;3,4-二羥基苯乙酸,美國(guó)Sigma-Aldrich 公司,批號(hào):850217-1G;乙腈,美國(guó)Fisher Scientific公司;甲醇、甲酸,Thermo Fisher Scientific中國(guó)公司。

1.3 動(dòng)物

24只清潔級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量(300±20)g,購(gòu)于SPF(北京)生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK (京) 2016-0002,該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)由中國(guó)中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):2019-052)。

1.4 檢測(cè)條件

安捷倫SB C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm);流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)組成,流速為0.3 mL/min,梯度洗脫(0～1分鐘,5%B;1～3分鐘,45%B;3～6.4分鐘,65%B),停止時(shí)間和后處理時(shí)間分別為6.4分鐘和8分鐘,進(jìn)樣體積為2 μL,柱溫為35℃。

電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI),負(fù)離子模式掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式。離子源溫度為350 ℃,鞘氣為氮?dú)?99.9%),氣體流速設(shè)定為12 L/min,毛細(xì)管電壓為4 000 V,霧化氣體壓力為40 psi。待測(cè)成分定量分析離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)。見表1。

表1 8種化合物和內(nèi)標(biāo)成分(IS)的優(yōu)化參數(shù)

1.5 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取原兒茶酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、無(wú)梗五加苷B、松脂醇葡萄糖苷、京尼平苷、綠原酸、咖啡酸對(duì)照品適量,加甲醇制成濃度分別為10.00 μg/mL、10.22 μg/mL、10.14 μg/mL、8.85 μg/mL、10.18 μg/mL、10.02 μg/mL、7.98 μg/mL、10.45 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。用甲醇將上述混合對(duì)照品溶液稀釋10個(gè)系列濃度,比例為5倍,置于在4 ℃下保存,備用。

1.6 內(nèi)標(biāo)溶液(IS)的制備

精密稱取內(nèi)標(biāo)物3.4-二羥基苯乙酸適量,加甲醇制備成濃度為10.05 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液,置于在4 ℃下保存,備用。

1.7 供試品溶液

杜仲飲片:稱取杜仲飲片260 g,用8倍量去離子水煎煮40分鐘,過(guò)濾后,濾渣再采用6倍量去離子水煎煮30分鐘,合并濾液,減壓濃縮至100 mL。全杜仲膠囊:取全杜仲膠囊過(guò)60目篩,精密稱取50 g,用去離子水溶解至100 mL溶解樣品。杜仲顆粒:稱取杜仲顆粒135 g,用去離子水100 mL溶解樣品。杜仲配方顆粒:稱取杜仲配方顆粒13 g,用去離子水100 mL溶解樣品。

1.8 血漿樣品的制備

向100 μL血漿中加入20 μL內(nèi)標(biāo)物溶液(10.05 μg/mL)和310 μL酸化乙腈(300 μL乙腈+10 μL 5%甲酸)。將混合物渦旋3分鐘,在冰浴中超聲提取10分鐘,以12 000 r/min離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中,并通過(guò)真空冷凍干燥蒸發(fā)至干燥狀態(tài)。然后加入100 μL流動(dòng)相(乙腈∶水=1∶4)渦旋3分鐘溶解殘?jiān)?超聲提取10分鐘,12 000 r/min離心10分鐘后取上清液,即為血漿樣品。

1.9 給藥以及血漿的收集

24只雄性SD大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成4組,包括杜仲飲片組、全杜仲膠囊組、杜仲顆粒組和杜仲配方顆粒組,每組6只。實(shí)驗(yàn)前,大鼠禁食12小時(shí)。按照1.7項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,灌胃給藥,劑量分別為杜仲飲片組(104 g/kg)、全杜仲膠囊組(20 g/kg)、杜仲顆粒組(54 g/kg)、杜仲配方顆粒組(5.2 g/kg)。在給藥前和給藥后15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)摘眼球取血,置于肝素鈉抗凝管中,3 000 r/min離心15分鐘,取上清液即為血漿,置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 專屬性

分別對(duì)空白血漿樣品,加入混合對(duì)照的空白血漿樣品,以及口服給藥后從大鼠收集的血漿樣品,按照1.8項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析,所有化合物和內(nèi)標(biāo)物的代表性MRM色譜圖如圖1所示,在8種化合物和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間內(nèi),基質(zhì)中沒(méi)有出現(xiàn)任何干擾,說(shuō)明該方法的專屬性良好。

注:A為空白血漿;B為加入標(biāo)準(zhǔn)化合物和內(nèi)標(biāo)的空白血漿;C為口服給藥從鼠中收集血漿樣品,1為原兒茶酸;2為京尼平苷酸;3為松脂醇二葡萄糖苷;4為無(wú)梗五加苷B;5為松脂醇葡萄糖苷;6為京尼平苷;7為綠原酸;8為咖啡酸;9為3.4-二羥基苯乙酸(IS)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將混合對(duì)照品溶液加入到空白血漿中,按照1.4項(xiàng)下方法操作,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品,測(cè)定各成分的含量,每種濃度制備三個(gè)樣品。標(biāo)準(zhǔn)方程由分析物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度之比(X)和相應(yīng)的峰面積比(Y)構(gòu)成。采用加權(quán)最小二乘法(1/χ2)得到各化合物及其峰面積的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。結(jié)果如表2所示,8種成分的r值均在0.9971～0.9988之間,表明所有化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

表2 8種化合物的線性回歸方程r、線性范圍LLOD和LLOQ(n=3)

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

取大鼠空白血漿100 μL,加入3種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液20 μL(高濃度為1 000 μg/mL;中濃度為200 μg/mL;低濃度為50 μg/mL)制備質(zhì)控樣品,每種濃度平行制備5個(gè)樣品,按照1.8項(xiàng)下方法處理后,按照1.4項(xiàng)檢測(cè)條件進(jìn)行 UPLC-MS/MS 分析,連續(xù)測(cè)定3天,分別計(jì)算精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果如表3所示,8種成分的精密度均小于15%,8種成分的準(zhǔn)確度均在±15 %以內(nèi),這表明該方法具有良好的可靠性和重復(fù)性。

表3 8種化合物的精密度和準(zhǔn)確度(n=5)

2.4 穩(wěn)定性

取大鼠空白血漿100 μL,加入3種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液(高:1 000 μg/mL;中:200 μg/mL;低:50 μg/mL)制備質(zhì)控樣品,按照1.8項(xiàng)下方法處理后,對(duì)不同儲(chǔ)存環(huán)境下的樣品(凍融循環(huán)3次;樣品在-80℃下保存15天;樣品在25℃的室溫下放置24小時(shí))按照1.4項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行 UPLC-MS/MS 分析,每種環(huán)境平行制備5個(gè)樣品。結(jié)果如表4所示,8種成分的RSD均小于15%,表明血漿樣品在不同環(huán)境中是穩(wěn)定的。

表4 8種化合物的穩(wěn)定性考察(n=5)

2.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

取大鼠空白血漿100 μL,加入3種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液20 μL(高:1 000 μg/mL;中:200 μg/mL;低:50 μg/mL)制備質(zhì)控樣品,按照1.8項(xiàng)下方法處理后,按照1.4項(xiàng)檢測(cè)條件進(jìn)行 UPLC-MS/MS 分析,記錄各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(A);取大鼠空白血漿100 μL,按照1.8項(xiàng)下方法處理后加入質(zhì)控樣品,進(jìn)樣分析,記錄各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(B);取上述高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,進(jìn)行分析,記錄峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(C);每種質(zhì)量濃度平行制備5個(gè)樣品。提取回收率=A/B×100%,基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。結(jié)果如表5所示,8種成分的提取物回收率在73.7%到95.0%之間,這表明在處理血漿樣品以沉淀蛋白質(zhì)的過(guò)程中,分析物沒(méi)有顯著損失。8種成分的基質(zhì)效應(yīng)范圍為71.7%～130.5%,表明無(wú)明顯基質(zhì)干擾。

表5 8種化合物的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)

大鼠灌胃給藥4種杜仲制劑后,采用UPLC-MS/MS分析不同采樣點(diǎn)的血藥濃度,以時(shí)間為橫坐標(biāo)(x),血藥濃度為縱坐標(biāo)(y)作圖。通過(guò)Phoenix Winnonlin 8.1軟件進(jìn)行非房室模型分析,計(jì)算血藥濃度—時(shí)間曲線下面積(AUC0-∞),半衰期(t1/2z)、達(dá)峰時(shí)(Tmax)、最大血藥濃度(Cmax)、表觀分布容積(Vz/F)、清除率(CLz/F)、平均駐留時(shí)間(MRT0-∞)等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果見表6、表7。

表6 口服杜仲制劑后化合物的AUC0-∞、t1/2z、Tmax和Cmax參數(shù)比較鼠只=6)

表7 口服杜仲制劑后化合物的Vz/FCl2/F和MRT0-∞參數(shù)鼠只=6)

3 討論

杜仲包含多種活性成分,其中木脂素類成分最豐富。例如在《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)中,松脂醇二葡萄糖苷是杜仲質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分,在調(diào)節(jié)高血壓、炎癥、氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]。松脂醇葡萄糖苷在成骨細(xì)胞分化和基質(zhì)礦化中具有生物學(xué)作用,這表明它可能在骨質(zhì)疏松癥和牙周炎等骨病中具有合成代謝作用[11]。據(jù)報(bào)道,京尼平苷和京尼平苷酸具有抗氧化和抗凋亡活性,是修復(fù)DEP誘導(dǎo)的皮膚損傷的潛在候選藥物[12]。原兒茶酸可通過(guò)抗氧化和抗炎活性在腦和肝臟中發(fā)揮保護(hù)作用,其潛在機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/COX-2途徑[13]。Zang H等[14]人通過(guò)順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠和人類腎臟-2細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)無(wú)梗五加苷B是治療AKI的潛在藥物。綠原酸可劑量依賴性地抑制人肝癌細(xì)胞Hep-G2和Huh-7的活性,但不影響正常人肝細(xì)胞QSG-7701的活性和生長(zhǎng)[15]。由于相鄰羥基和分子內(nèi)雙鍵的結(jié)構(gòu),咖啡酸具有良好的抗氧化活性[16]。因此,本研究選擇原兒茶酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、無(wú)梗五加苷B、松脂醇葡萄糖苷、京尼平苷、綠原酸和咖啡酸作為杜仲的指標(biāo)成分進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究。

為了在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳的分離和獲得良好的峰形,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考察。在本研究中,分別測(cè)試了甲醇、乙腈和水中不同比例的酸和鹽。最后,選擇0.1%甲酸水溶液(溶劑A)和0.1%甲酸乙腈溶液(溶劑B)作為流動(dòng)相。

本研究采用液液萃取的方法處理血漿樣品,采用UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明該方法具有良好的專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性。杜仲補(bǔ)肝腎藥效明確,采用該方法研究杜仲及其制劑中的8種成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué),對(duì)于進(jìn)一步揭示不同杜仲制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有重要意義。由于非房室模型限制條件少,適合于大部分藥物,因此本研究采用非房室模型估算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示,不同杜仲制劑中的成分在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征不同。根據(jù)血藥濃度—時(shí)間曲線下面積(AUC0-∞)可得出,杜仲顆粒中的原兒茶酸、無(wú)梗五加苷B、綠原酸、咖啡酸四種成分在大鼠體內(nèi)暴露高于其他劑型,全杜仲膠囊中的京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇葡萄糖苷、京尼平苷四種成分在大鼠體內(nèi)的成分高于其他劑型。根據(jù)達(dá)峰時(shí)間(Tmax)可得出,杜仲飲片中的原兒茶酸、京尼平苷酸、咖啡酸三種成分在大鼠體內(nèi)的吸收快于其他劑型,杜仲顆粒中的松脂醇二葡萄糖苷、無(wú)梗五加苷B、綠原酸三種成分在大鼠體內(nèi)的吸收快于其他劑型,杜仲配方顆粒中的京尼平苷在大鼠體內(nèi)的吸收快于其他劑型。通過(guò)口服給藥后,8種成分在不同劑型中的表觀分布容積(Vz/F)和清除率(Clz/F)差異較大,說(shuō)明在體內(nèi)的過(guò)程不一致。根據(jù)不同制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)看,8種成分在AUC0-∞、t1/2z、Tmax、Cmax、Vz/F、Clz/F、MRT0-∞方面均不相同,這表明同一藥物的不同劑型,它們的釋藥速度、起效快慢及作用強(qiáng)度均不相同。

綜上所述,本研究基于UPLC-MS/MS法的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,建立同時(shí)測(cè)定原兒茶酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、無(wú)梗五加苷B、松脂醇葡萄糖苷、京尼平苷、綠原酸、咖啡酸8種成分的分析方法,并用該方法分析杜仲及其制劑在大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué),對(duì)杜仲制劑在臨床應(yīng)用上具有重要指導(dǎo)意義。