李肖蕓 方家遠(yuǎn) 閆春雷 宋華勇

肝癌是肝硬化、慢性肝病等患者中常見的死亡誘因[1-2]。目前肝癌患者的死亡率仍在繼續(xù)增長(zhǎng)[3]。目前認(rèn)為,肝癌誘發(fā)的危險(xiǎn)因素主要與以下因素存在關(guān)系,如飲酒、超重、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性感染、吸煙等[4]。臨床上常采用手術(shù)切除術(shù)、肝移植方式進(jìn)行治療,但總體療效欠佳,大部分患者術(shù)后存在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響術(shù)后恢復(fù)[5]。因此,對(duì)于肝癌患者的治療,積極尋找有效治療方案尤為重要。HAGLROS可參與多種腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展,如結(jié)直腸癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]及骨肉瘤[9]等。如吳鵬的研究中[10],HAGLROS在胃癌患者中的表達(dá)明顯上升,且患者預(yù)后較差,HAGLROS可以促進(jìn)胃癌疾病進(jìn)展,如增殖和侵襲等。又有研究稱[11],HAGLROS可參與直腸癌細(xì)胞凋亡、自噬等過程。還有研究發(fā)現(xiàn)[12],HAGLROS在肝癌患者中的表達(dá)也出現(xiàn)明顯異常。因此,關(guān)于HAGLROS的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。miR-26b為常見抑瘤基因,在多種腫瘤疾病中表達(dá)均異常。最近研究稱[13],miR-26b可與部分LncRNAs競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,參與腫瘤發(fā)展。本次研究主要基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探尋HAGLROS和miR-26b在肝癌中的作用,現(xiàn)將內(nèi)容報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

細(xì)胞:正常肝細(xì)胞系LO2及肝癌細(xì)胞系(Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721)。試劑:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000,RPMI 1640培養(yǎng)基,實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,MTT增殖檢測(cè)試劑盒,E-Cadherin、N-cadherin、FN、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3一抗抗體,HRP標(biāo)記的二抗抗體,miR-126b抑制劑(inhibitor)、HAGLROS干擾序列,qPCR引物,pmirGLO reporter檢測(cè)試劑盒,熒光檢測(cè)試劑盒等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇,接種于培養(yǎng)基,加10%胎牛血清、1%雙抗,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),環(huán)境條件為37 ℃、5% CO2,依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液處理。分別將si-NC、si-HAGLROS、miR-26b inhibitor與Lipofectamine 3000混合處理,室溫環(huán)境下培養(yǎng),15 min后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,待進(jìn)入至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,予以適量0.25%胰蛋白酶溶液傳代,預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)至50%,更換無血清培養(yǎng)基。分組,即si-NC組、si-HAGLROS組、miR-26 inhibitor組、si-HAGLROS+miR-26 inhibitor組。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

獲取對(duì)數(shù)期細(xì)胞,每孔1×104個(gè)接種至96孔板,生長(zhǎng)至80%,轉(zhuǎn)染,每組設(shè)3個(gè)重復(fù),于轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h、72 h后予以5 μg/μl MTT,孵育,4 h后,終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。再以空白孔作為對(duì)照,檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

依據(jù)5×105個(gè)/ml接種至6孔板,采用無菌槍頭劃痕,倒置顯微鏡拍照,細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),再將其置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),環(huán)境條件為37 ℃、5% CO2,24 h后,采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞劃痕情況,并進(jìn)一步計(jì)算劃痕率。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

取Transwell小室,水化包被好,重懸,密度1×105個(gè)/孔接種,下室予以10%胎牛血清培養(yǎng),24 h后,取出小室,予以4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定操作,30 min后,室溫環(huán)境下風(fēng)干處理,予以適量結(jié)晶紫溶液染色,采用顯微鏡觀察。

1.6 qPCR法

轉(zhuǎn)染48 h后,TRIzol試劑提取總RNA,分析RNA質(zhì)量,反轉(zhuǎn)錄操作,合成cDNA。反應(yīng)條件如下,95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,40 cycles,60 ℃ 30 s。內(nèi)參物均為GAPDH,miR-26b內(nèi)參為U6,采用2-△△Ct計(jì)算。HAGLROS上游引物序列:5'-GGAAGGGCTCCTTACTTTC-3',HAGLROS下游引物序列:5'-GGAGGCTTTATCCCA-GTTC-3';E-Cadherin上游引物序列:5'-GGAACGCTCTC-GGTTATTC-3',E-Cadherin下游引物序列:5'-GGCTCTAACTATGTCGGTC-3',FN上游引物序列:5'-GAAGTCCGTTCGCTGATTC-3',FN下游引物序列:5'-GATTCTCCGATGCTAGGTC-3',Bcl-2上游引物序列:5'-GAATCCGTAGCGTCTGTTC-3',Bcl-2下游引物序列:5'-GACGTAGCCTCTTGTGATC-3',GAPDH上游引物序列:5'-GAACGTATGGTGCTCTCTC-3',GAPDH下游引物序列:5'-GACTCGCCGTGTGTAATTC-3',U6上游引物序列:5'-GAAGATTGCTGTTCTCCGC-3',U6下游引物序列:5'-GAACTCCTTGTGGATTCGC-3',miR-126b上游引物序列:5'-GATCCTAGATTCGCTGTGC-3',miR-126b下游引物序列:5'-GATGTTCATCAGCGCTTGC-3'。

1.7 免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot,WB)

轉(zhuǎn)染48 h后提取各組細(xì)胞總蛋白應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度。各組分別取等量的樣本進(jìn)行SDS-PAE凝膠電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉,加入E-Cadherin(1∶200)、N-cadherin(1∶200)、FN(1∶100)、Bcl-2(1∶100)、p-JAK2(1∶100)、p-STAT3(1∶200)抗體,4 ℃過夜。應(yīng)用TBST洗膜3次,每次10 min。接著加入二抗在室溫溫育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加ECL發(fā)光劑,X線片曝光、顯影、定影。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因

miR-26b、HAGLROS序列片段擴(kuò)增,構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒pHAGLROS、突變質(zhì)粒pMut-HAGLROS,將miR-26b mimics、miR-NC與野生或突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,24 h后,收集。雙熒光報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞內(nèi)HAGLROS、miR-26b表達(dá)的差異性

肝癌細(xì)胞系Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721中HAGLROS表達(dá)均顯著高于LO2細(xì)胞,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而肝癌細(xì)胞系Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721中miR-26b表達(dá)均顯著低于LO2細(xì)胞,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于SMMC-7721細(xì)胞中HAGLROS表達(dá)最高,因此,后續(xù)研究均采用SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 不同細(xì)胞內(nèi)HAGLROS、miR-26b表達(dá)的差異性

2.2 HAGLROS、miR-26b轉(zhuǎn)染效率

與未轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞、轉(zhuǎn)染si-NC SMMC-7721細(xì)胞比較,分別轉(zhuǎn)染干擾序列HAGLROS-1、si-HAGLROS-2后,SMMC-7721細(xì)胞中HAGLROS表達(dá)均出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中si-HAGLROS-1感染后下降率更低,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取si-HAGLROS-1序列干擾SMMC-7721細(xì)胞。見表2。與未轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞、轉(zhuǎn)染si-NC SMMC-7721細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)染干擾序列 inhibitor后,SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)miR-26b水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。說明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。

表2 HAGLROS轉(zhuǎn)染效率

表3 miR-26b轉(zhuǎn)染效率

2.3 HAGLROS與miR-26b的靶向關(guān)系

采用生物信息學(xué)軟件顯示,HAGLROS與miR-26b存在互補(bǔ)核苷酸序列,見圖1。熒光酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表示,與miR-NC組比較,miR-26b-5p mimics組活性更低,P<0.05;轉(zhuǎn)染突變型HAGLROS,miR-NC組與miR-26b-5p mimics組熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。與對(duì)照組、si-NC組進(jìn)行比較,si-HAGLROS組miR-26b水平均顯著更高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表5。

圖1 靶向結(jié)合核苷酸序列

表4 相對(duì)熒光強(qiáng)度

表5 miR-26b相對(duì)表達(dá)量

2.4 SMMC-7721細(xì)胞增殖變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染0 h、24 h后,si-NC組、si-HAGLROS組、miR-26b inhibitor組、si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);轉(zhuǎn)染48 h、72 h后,與si-NC組比較,si-HAGLROS組細(xì)胞增殖活性下降,miR-26b inhibitor組與之相反,si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組與si-HAGLROS組比較,P<0.05。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細(xì)胞增殖活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 SMMC-7721細(xì)胞增殖變化

2.5 SMMC-7721細(xì)胞遷移變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組細(xì)胞劃痕愈合率更低,miR-26b inhibitor組細(xì)胞劃痕愈合率更高,同時(shí)si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細(xì)胞劃痕愈合率明顯高于si-HAGLROS組(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細(xì)胞劃痕愈合率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

表7 SMMC-7721細(xì)胞劃痕愈合率

2.6 SMMC-7721細(xì)胞侵襲變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組細(xì)胞穿膜數(shù)目更低,miR-26b inhibitor組細(xì)胞穿膜數(shù)目更高,同時(shí)si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組細(xì)胞穿膜數(shù)目明顯高于si-HAGLROS組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組比較,P>0.05。見表8。

表8 細(xì)胞穿膜數(shù)目個(gè))

2.7 EMT相關(guān)因子變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組N-cadherin、FN、Bcl-2表達(dá)更低,E-Cadherin表達(dá)更高,miR-26b inhibitor組E-Cadherin表達(dá)更低,N-cadherin、FN、Bcl-2表達(dá)更高,同時(shí)si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組N-cadherin、FN、Bcl-2表達(dá)明顯高于si-HAGLROS組,E-Cadherin明顯低于si-HAGLROS組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組E-Cadherin、N-cadherin、FN、Bcl-2比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表9。

表9 EMT相關(guān)因子變化

2.8 JAK2/STAT3通路因子變化

與si-NC組比較,si-HAGLROS組p-JAK2、p-STAT3表達(dá)更低,miR-26b inhibitor組p-JAK2、p-STAT3表達(dá)更高,同時(shí)si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組p-JAK2、p-STAT3表達(dá)明顯高于si-HAGLROS組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。si-NC組與si-HAGLROS+miR-26b inhibitor組p-JAK2、p-STAT3比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表10。

表10 JAK2/STAT3通路因子變化

3 討論

研究稱,腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移是腫瘤惡化的前提條件[14]。EMT主要參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15]。研究稱[16],EMT過程中,E-Cadherin表達(dá)異常下調(diào),可引起極性下降,甚至喪失,上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型,N-cadherin、FN表達(dá)異常上調(diào),促使腫瘤細(xì)胞遷移能力和侵襲能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)移前提為細(xì)胞獲取基質(zhì)樣特性。多項(xiàng)研究均表明[17],LncRNAs調(diào)控EMT,參與腫瘤發(fā)展。Zhang等研究[18]發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性肝癌患者SNHG3活性激活后,一定程度上可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力,還可調(diào)控EMT過程。又有研究稱[19],DANCR可通過海綿作用與miR-27a-3p結(jié)合,進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT過程,促進(jìn)肝癌疾病進(jìn)展。又有研究稱[20],ID2-ASI阻斷HDAC8與ID2結(jié)合,調(diào)節(jié)ID2基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步對(duì)EMT過程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,最終控制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

多項(xiàng)研究均證實(shí)[21],LncRNA可競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA,作為miRNAs分子海綿,參與腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HAGLROS在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞系,說明HAGLROS可能參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。本次研究還發(fā)現(xiàn),miR-26b在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)較正常肝細(xì)胞的表達(dá)更低。生物信息學(xué)軟件顯示,HAGLROS與miR-26b具有靶向關(guān)系,說明HAGLROS與miR-26b存在靶向調(diào)控的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證實(shí),HAGLROS可調(diào)控miR-26b表達(dá),且為負(fù)性調(diào)控。進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干擾HAGLROS表達(dá)后,細(xì)胞增殖活性、侵襲能力及遷移能力均明顯下降,同時(shí)EMT活性也下降,而沉默miR-126b表達(dá)后,細(xì)胞增殖、侵襲及遷移增強(qiáng),EMT活性增加;干擾HAGLROS,沉默miR-126b,原本干擾HAGLROS表達(dá)后細(xì)胞增殖活性、侵襲能力及遷移能力下降而重新被激活。研究稱[22],HAGLROS通過miR-100/ATG14或PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,影響鼻咽癌細(xì)胞自噬。又如Ye等的研究中[23],HAGLROS在肝癌組織中表達(dá)是健康組織的2.3倍。研究稱,肝癌內(nèi)HAGLROS表達(dá)與腫瘤臨床分期、分化程度有關(guān);HAGLROS可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-5095,參與凋亡過程。上述研究均進(jìn)一步表明HAGLROS參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

JAK2/STAT3通路可參與多種腫瘤疾病。JAK2/STAT3通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡有關(guān)。STAT3屬于一類致癌因子,可激活下游靶基因活性,進(jìn)而參與細(xì)胞增殖,抑制凋亡,促進(jìn)腫瘤發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,干擾HAGLROS后,Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平均明顯下降,而沉默miR-126b表達(dá)后,Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平均明顯上升,但干擾HAGLROS表達(dá)且同時(shí)沉默miR-126b表達(dá)后,因干擾HAGLROS表達(dá)Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平下降而又開始上升。此項(xiàng)研究結(jié)果說明HAGLROS可以通過靶向調(diào)控miR-126b,進(jìn)而抑制JAK2/STAT3通路活性。

綜上所述,LncRNA-HAGLROS可通過靶向下調(diào)miR-26b促進(jìn)肝癌細(xì)胞生物行為,如遷移、侵襲及EMT過程,同時(shí)可調(diào)控JAK2/STAT3通路活性,LncRNA-HAGLROS可作為肝癌治療靶點(diǎn)。但是本次研究也存在一些局限性,本研究?jī)H僅在細(xì)胞層面探討了HAGLROS在肝癌中的作用,期待后續(xù)進(jìn)行臨床研究以探討HAGLROS是否可作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物以及是否可作為肝癌患者治療靶點(diǎn)。