劉開文，馬 雯,2，金 剛,2,*

（1.寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏葡萄與葡萄酒研究院，寧夏 銀川 750021）

乳酸菌真空冷凍干燥簡稱凍干，是指將乳酸菌細(xì)胞懸液置于冰點(diǎn)以下的溫度進(jìn)行預(yù)凍，利用真空環(huán)境下冰晶低溫升華去除水分，進(jìn)而以凍干粉形式保存的技術(shù)。凍干可使菌體保持原有生化特性及活性[1]。但凍干過程也會(huì)造成乳酸菌的活性降低，甚至死亡[2]。

保持較高的存活率是乳酸菌凍干粉充分發(fā)揮其功能的重要保障[3]，為了探究凍干過程中致使乳酸菌菌粉失活的機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥后乳酸菌存活率降低的原因主要有以下幾個(gè)方面：凍干過程造成的細(xì)胞膜通透性增加[4]、膜流動(dòng)性降低[5]、酶及蛋白質(zhì)類物質(zhì)變性[6]、遺傳物質(zhì)改變[7]等。為進(jìn)一步提高凍干后乳酸菌存活率及延長貯藏期，本文就凍干過程中影響乳酸菌存活率的因素及提高其存活率、延長貯藏時(shí)間的措施進(jìn)行總結(jié)，旨在為制備活性高且耐貯藏乳酸菌制劑提供依據(jù)與參考。

1 真空冷凍干燥對乳酸菌的影響

真空冷凍干燥分為冷凍和干燥兩個(gè)階段，均會(huì)導(dǎo)致乳酸菌活力下降甚至死亡。目前，諸多學(xué)者對凍干引起的乳酸菌失活機(jī)理進(jìn)行了深入的探討。凍干過程主要通過以下方面影響乳酸菌的存活率。

1.1 凍干對菌體的物理損傷

在凍干過程中溫度的急劇下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶，損傷細(xì)胞膜，進(jìn)而對乳酸菌菌體產(chǎn)生物理損傷。眾多研究表明，冷卻速率會(huì)極大地影響冰晶的產(chǎn)生，冷卻速率過快，容易產(chǎn)生較大的冰晶，從而刺破細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[8]。在凍干過程中，存在兩個(gè)最大的冰晶生成溫度帶，即0～－3.7 ℃和－30～－37.4 ℃。在上述溫度區(qū)間內(nèi)，若物料溫度升降緩慢，會(huì)產(chǎn)生較多冰晶，更易損傷菌體[9]。因此，快速通過最大冰晶生成帶可以有效減少菌數(shù)損失。

1.2 凍干對細(xì)胞膜的損傷

細(xì)胞膜能隔絕外界環(huán)境，是乳酸菌的重要保護(hù)屏障[8]，其完整性是凍干成功的關(guān)鍵。

在干燥脫水環(huán)節(jié)，磷脂雙分子層頭部基團(tuán)上的水分子被?；鎿Q，致使鏈間的作用力增大，同時(shí)磷脂分子的狀態(tài)也從液晶態(tài)向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)化，使磷脂分子之間產(chǎn)生空隙，細(xì)胞膜的通透性增大，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄露，從而降低細(xì)胞的活力[7]（圖1）。Basholli-Salihu等[10]比較冷凍干燥和冷凍之后的菌體活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥后的菌體活性較冷凍后的菌體活性有明顯的下降。此外，有研究表明未添加保護(hù)劑的菌體相較于添加保護(hù)劑的菌體β-半乳糖苷酶（細(xì)胞衰老標(biāo)志物）活性有明顯增大[11-12]，這也進(jìn)一步說明在凍干過程中細(xì)胞膜發(fā)生變化，造成物質(zhì)流失，影響細(xì)胞活力。

膜的流動(dòng)性與磷脂分子脂肪酸飽和度及長度密切相關(guān)[13]。增加不飽和脂肪酸的比例可以提高細(xì)胞膜對不良環(huán)境的抵抗力[14]。乳酸菌菌體可通過增加膽固醇在細(xì)胞膜中的比例、調(diào)節(jié)飽和/不飽和脂肪酸的比例從而調(diào)節(jié)外界環(huán)境對其造成的影響[15]。如Zhao Yinsuo等[16]的研究表明菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性提高與細(xì)胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸比例的增加有關(guān)。Fonseca等[17]研究表明培養(yǎng)基中加入吐溫-80能夠增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的比例，隨之改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，降低凍干過程中的菌體死亡率。

1.3 凍干對菌體內(nèi)外滲透壓的損傷（溶質(zhì)損傷）

由于細(xì)胞內(nèi)外液組成成分不同，故凝固點(diǎn)也不同，即凍干過程中，菌體內(nèi)外液的凍結(jié)時(shí)間不同步。胞外液凝固點(diǎn)較內(nèi)液高，在冷凍過程中更早被凍結(jié)、濃縮，為維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，細(xì)胞內(nèi)液向外移動(dòng)，致使內(nèi)液溶質(zhì)濃縮，此現(xiàn)象又稱“溶質(zhì)效應(yīng)”[18]。“溶質(zhì)效應(yīng)”可使細(xì)胞物質(zhì)代謝紊亂或蛋白失活，甚至造成細(xì)胞死亡。

1.4 凍干對酶類及蛋白質(zhì)的損傷

細(xì)胞內(nèi)酶的活力與菌體的物質(zhì)交換、能量代謝以及生長速度等密切相關(guān)[19]，而凍干會(huì)因?yàn)槊撍鸺?xì)胞內(nèi)酶類及蛋白質(zhì)失活[20]；細(xì)胞失水會(huì)破壞蛋白質(zhì)與水分子、細(xì)胞膜之間的相互作用力，從而削弱蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，降低酶的活性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使其失去功能[4]。故在凍干后細(xì)胞中保持一定的水分很關(guān)鍵。

1.5 凍干對遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的損傷

遺傳穩(wěn)定性改變是導(dǎo)致細(xì)胞失去活性的主要原因之一。干燥引起的DNA結(jié)構(gòu)變化是導(dǎo)致細(xì)胞生理損傷的主要原因[2]。乳酸菌的遺傳物質(zhì)為DNA雙螺旋，常與載體蛋白形成復(fù)合體存在。凍干過程中脫水會(huì)導(dǎo)致載體蛋白變性，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。此外，由于失水量的增加，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)濃度升高，電荷發(fā)生改變，削弱DNA中堿基對之間的疏水性，使菌體的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制，甚至發(fā)生基因變異[21]。

2 優(yōu)化凍干保護(hù)條件提高乳酸菌存活率

2.1 優(yōu)化培養(yǎng)基組成提高乳酸菌活菌密度

2.1.1 優(yōu)化培養(yǎng)基營養(yǎng)能有效提高乳酸菌細(xì)胞生理活性

乳酸菌的體外培養(yǎng)與培養(yǎng)基密切相關(guān)，培養(yǎng)基是適合微生物生長所需的碳源、微量元素、氮源、水分等各類營養(yǎng)物質(zhì)組成的混合物[22]。通過對MRS培養(yǎng)基中各組分的比例進(jìn)行優(yōu)化，能夠?qū)θ樗峋x關(guān)鍵酶（β-半乳糖苷酶、K＋-ATP酶等）起到保護(hù)作用，從而提高乳酸菌的生理活性[23]。李娜等[24]通過優(yōu)化培養(yǎng)基各成分及比例發(fā)現(xiàn)：當(dāng)培養(yǎng)基為蔗糖43 g/L、玉米漿干粉60 g/L、Na2HPO4-檸檬酸0.12 mol/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 0.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316的活菌數(shù)較對照組提高了3.44 倍。趙玉鑒等[25]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌C88在優(yōu)化培養(yǎng)基上的活菌數(shù)相比于MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了2 倍。Choi等[26]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化MRS培養(yǎng)基中，植物乳桿菌200665的生長活性得到明顯增強(qiáng)，相同時(shí)間內(nèi)菌種產(chǎn)生量較對照組提高1.58 倍。此外，由于乳酸菌的菌株特異性和多樣性，不同種類的乳酸菌對培養(yǎng)基中各種成分的偏愛程度不同，因此，可以根據(jù)不同菌株的喜好對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，從而提高菌株的活性。孫瑞胤等[27]在MRS培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L的Ca2＋，可以使植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率提升21.52%。Chen He等[28]通過將6 種天然分子分別添加到MRS培養(yǎng)基中優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl、山梨醇二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.6%、0.15%時(shí)，對乳桿菌菌株的凍干存活率有顯著影響，保加利亞乳桿菌的凍干存活率分別達(dá)到了為42.7%和45.4%。因此，可以根據(jù)不同乳酸菌的特異性，開發(fā)出特異性優(yōu)化培養(yǎng)基，從而增強(qiáng)菌體的生理活性，進(jìn)而提高菌體的凍干存活率。

2.1.2 促進(jìn)乳酸菌生物膜的合成從而有效提高菌體抵抗凍干損傷的能力

生物膜是乳酸菌的重要保護(hù)屏障，同時(shí)也是維持細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的場所，并具有一定的機(jī)械穩(wěn)定性[29]。研究表明，細(xì)胞膜的形成與培養(yǎng)基中的碳源密切相關(guān)，如培養(yǎng)基中缺乏碳源，可使細(xì)胞膜形成困難，反之，碳源濃度過高又會(huì)抑制細(xì)胞膜形成[30]，故合適的碳源濃度有助于菌體細(xì)胞膜合成。另外Mn2＋、Mg2＋和Fe3＋等一些金屬離子也對細(xì)胞膜的形成有影響。E Jingjing等[31]將細(xì)胞膜測定和轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的K＋能顯著促進(jìn)植物乳桿菌LIP-1生物膜的形成，增強(qiáng)菌體的抗逆能力。但并非所有的金屬離子都對細(xì)胞膜形成有積極作用，如Cu2＋、Al3＋、Zn2＋和Pb＋等金屬離子可抑制生物膜形成，不利于菌體抵抗逆境[32-33]。因此，在培養(yǎng)基中選擇性地添加一些金屬離子，如K＋、Ca2＋等能夠促進(jìn)細(xì)胞膜的形成，增強(qiáng)菌體抗逆性，進(jìn)而提高凍干存活率。

2.1.3 改變細(xì)胞膜不飽和酸脂肪酸比例從而影響菌體逆境耐受性

凍干過程中細(xì)胞會(huì)因?yàn)槊撍畬?dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，代謝功能受阻，菌株凍干存活率降低。脂肪酸對細(xì)胞膜的流動(dòng)性起著至關(guān)重要的作用，其中較高的不飽和脂肪酸含量可提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而增強(qiáng)細(xì)胞對逆境的抗性。為此，研究者們采用了多種方法，如通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值、加入適當(dāng)濃度的油酸、無機(jī)鹽離子、吐溫-80等組分可使不飽和脂肪酸含量增加。陳境等[34]研究表明，若將MRS培養(yǎng)基的初始pH值從7.4下調(diào)至6.8，植物乳桿菌LIP-1凍干存活率也隨之變化，其凍干存活率從72.43%增加至81.76%。錢志浩等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入2 mL/L吐溫-80能夠提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量，從而提升鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2的凍干存活率。E Jingjing等[36]研究表明，K＋可以上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，有助于延長脂肪酸碳鏈，促進(jìn)不飽和脂肪酸含量的合成，提高細(xì)胞膜流動(dòng)性，增強(qiáng)菌體耐凍干性。何棕柏等[37]研究不同濃度油酸對菌株凍干存活率的影響發(fā)現(xiàn)，加入0.001%油酸到培養(yǎng)基中，同樣可以提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量，提升菌體凍干存活率。

總之，通過對培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，能夠增強(qiáng)乳酸菌生理活性，提升乳酸菌自我保護(hù)能力，增加乳酸菌細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量，增強(qiáng)乳酸菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性，顯著提升其凍干存活率。

2.2 脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

脅迫預(yù)處理是指將乳酸菌菌液放置特定環(huán)境中一段時(shí)間，鍛煉菌體在該環(huán)境下的耐受性，增強(qiáng)其對逆境的抵抗能力，從而提升菌株的凍干存活率。一般的脅迫預(yù)處理方式有冷脅迫、酸脅迫和熱脅迫等[38-39]。

2.2.1 冷脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

冷脅迫預(yù)處理可以顯著增強(qiáng)菌株對低溫的耐受性，其作用機(jī)理可能與維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性及促進(jìn)冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)有關(guān)。在此過程中，低溫可以使乳酸菌細(xì)胞膜上的脂肪酸成分發(fā)生變化，進(jìn)而增強(qiáng)其對低溫的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，隨著不飽和脂肪酸含量的增加，細(xì)胞膜的流動(dòng)性相應(yīng)增強(qiáng)，抗凍性能也隨之增強(qiáng)。王曉萌等[40]將嗜酸乳桿菌ATCC4356在8 ℃低溫條件下培養(yǎng)16 h，其凍干存活率比正常對照組提高了17.56%。此外，冷脅迫還可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)冷應(yīng)激蛋白（cold shock proteins，CSPs）的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對冷凍的耐受能力。李夢洋等[41]以保加利亞乳酸菌為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對其低溫脅迫下的應(yīng)激蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)被處理的菌株冷應(yīng)激蛋白基因cspA mRNA的拷貝量增加3.34 倍左右，說明冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)量得到了明顯提高。先前有研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌體內(nèi)CSPs的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)在低溫環(huán)境下有較高的穩(wěn)定性，并且保持著良好的催化活性。同時(shí)，CSPs還能防止細(xì)胞由于相關(guān)酶的變性失活引起的菌體損傷，提高了細(xì)胞的低溫耐受性[42]。因此，針對不同的乳酸菌進(jìn)行不同的預(yù)冷脅迫處理可以提高其凍干存活率。

2.2.2 熱脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

熱脅迫是將乳酸菌置于比其生長適宜溫度更高的條件下，使其進(jìn)行一段時(shí)間的高溫脅迫，提高乳酸菌的逆境耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，熱脅迫預(yù)處理的微生物有較高的凍干存活率，且經(jīng)過處理的微生物在真空冷凍干燥后能快速恢復(fù)生長和產(chǎn)酸[43]。Zhen Ni等[44]將嗜酸乳桿菌ATCC4356在45 ℃條件下脅迫處理30 min，發(fā)現(xiàn)菌體凍干存活率提升了17.2%。此外，菌體的糖代謝和能量代謝能力也得到了提高，與對照組相比，多糖含量增加了32.24%，半乳糖產(chǎn)量增加9%。王慧君等[45]通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)了10.5 h的嗜酸乳桿菌在56 ℃環(huán)境下熱脅迫處理30 min，嗜酸乳桿菌的凍干存活率比對照組提升了50.66%。此外，將熱脅迫處理與篩選的優(yōu)良保護(hù)劑結(jié)合，45 ℃熱脅迫處理嗜酸乳桿菌ATCC 4356 30 min后，菌體的凍干存活率達(dá)到了92.8%[46]。綜上，熱脅迫處理促進(jìn)了菌體的熱激蛋白的表達(dá)，對維持細(xì)胞的能量代謝，維持細(xì)胞的生存有積極作用，從而提高細(xì)胞的抗凍性和存活率。

2.2.3 酸脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳酸菌抗凍能力

酸脅迫預(yù)處理是指將乳酸菌放置于其適宜酸性環(huán)境下一段時(shí)間，以提高菌體的凍干存活率，不同種類的乳酸菌有各自專屬的酸脅迫預(yù)處理?xiàng)l件。酸脅迫預(yù)處理主要通過調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞的糖酵解途徑和脂肪酸代謝途徑以增強(qiáng)抗凍能力[47]。有研究發(fā)現(xiàn)，酸脅迫促進(jìn)了菌株糖酵解途徑中丙酮酸與乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，為菌體細(xì)胞提供更多生長所需的能量，菌體細(xì)胞通過利用這些能量增強(qiáng)對逆境的耐受性[47]。E Jingjing等[48]研究表明，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）家族基因、脂肪酸合成（fatty acid binding，F(xiàn)AB）家族基因和丙酮酸脫氫酶基因在經(jīng)過酸脅迫后會(huì)表達(dá)上調(diào)。ACC家族基因和FAB家族基因的表達(dá)對延伸脂肪酸碳鏈和碳鏈上不飽和雙鍵的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，從而提高了不飽和脂肪酸的相對含量，而丙酮酸脫氫酶基因表達(dá)上調(diào)影響了細(xì)胞膜脂肪酸的代謝和合成。綜上所述，經(jīng)過酸脅迫預(yù)處理的乳酸菌，其在凍干過程中細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性均得到改善，凍干存活率也明顯提高。

除單一脅迫外，國內(nèi)外學(xué)者還開展了多因素協(xié)同脅迫的研究。如楊婕等[49]通過對酸-冷交互脅迫條件下乳酸菌ATM的凍干存活率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其凍干存活率可達(dá)87.19%，較對照組有顯著提高。交互脅迫預(yù)處理需要在不同的脅迫條件下進(jìn)行，故對各種脅迫條件的要求很嚴(yán)格，因此有待于進(jìn)一步的研究。

2.3 添加保護(hù)劑降低乳酸菌凍干的損傷

國內(nèi)外學(xué)者多年的研究發(fā)現(xiàn)，有很多因素會(huì)對乳酸菌凍干存活率產(chǎn)生影響，包括細(xì)胞生理狀態(tài)、細(xì)胞大小、菌液濃度、pH值以及冷凍保護(hù)劑等，其中保護(hù)劑對菌體的保護(hù)效果較為突出。保護(hù)劑可以增強(qiáng)菌體凍干過程中各生理機(jī)能的穩(wěn)定性，優(yōu)良的凍干保護(hù)劑可以改善菌體凍干時(shí)的環(huán)境，能較好地緩解菌體在冷凍干燥過程中受到的各種損傷。最大限度地保留菌體原有的各種生理生化特性和生物活性[50-54]。如曾小群等[55]通過使用脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑，制備出了凍干存活率達(dá)98.74%的高活性Lactobacillus casei發(fā)酵劑。

2.3.1 保護(hù)劑種類

為使人臉人耳的特征向量在多模身份識(shí)別中具有相同表現(xiàn)力，在特征向量融合之前，要將經(jīng)過特征提取后的訓(xùn)練樣本矩陣和測試樣本向量分別進(jìn)行歸一化處理，用向量來代表人臉訓(xùn)練樣本中第i個(gè)類別的第j個(gè)向量，對歸一化處理：，其中μf為Df中所有列向量的均值向量，σf為Df中所有列向量的方差向量。同理，用相同處理方法對經(jīng)過核映射后的人耳訓(xùn)練矩陣進(jìn)行歸一化處理。對特征提取后的測試向量進(jìn)行歸一化處理：zf=(zf-μf)/σf，ze=(ze-μe)/σe。

凍干保護(hù)劑分類的方法有很多，按其滲透性可以分為3 類，即滲透性保護(hù)劑、半滲透性保護(hù)劑及非滲透性保護(hù)劑[56]。如圖2所示，滲透性保護(hù)劑指可以很容易的透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用的物質(zhì)，如甘油就是一種典型的滲透性保護(hù)劑，它可以提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對菌體的保護(hù)[57]；半滲透性保護(hù)劑指能穿過細(xì)胞壁而不能穿過細(xì)胞膜發(fā)揮作用的物質(zhì)，其能誘導(dǎo)菌體質(zhì)壁分離，抑制冰晶的形成，包括單糖、蔗糖、氨基酸等[58]；非滲透性保護(hù)劑指被排除在細(xì)胞外部，在細(xì)胞外側(cè)為菌體提供保護(hù)的物質(zhì)，包括多糖、海藻糖、脫脂乳等大分子，這類保護(hù)劑通過在細(xì)胞壁外側(cè)形成保護(hù)層實(shí)現(xiàn)對菌體的保護(hù)，從而減輕細(xì)胞的損傷[57-58]。

圖2 不同滲透性保護(hù)劑的作用原理Fig.2 Action mechanisms of cryoprotectants with of different permeability

按凍干保護(hù)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為有機(jī)保護(hù)劑和無機(jī)保護(hù)劑，如表1所示，由于有機(jī)保護(hù)劑所特有的結(jié)構(gòu)與乳酸菌的有效抗冷凍密不可分，而無機(jī)保護(hù)劑僅表現(xiàn)為無機(jī)鹽，故在乳酸菌發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中廣泛應(yīng)用有機(jī)保護(hù)劑提升凍干存活率[59]。

表1 常見凍干保護(hù)劑及其作用機(jī)理Table 1 Common lyophilized protective agents and their action mechanisms

2.3.2 復(fù)配保護(hù)劑的保護(hù)作用

不同的組織、細(xì)胞對冷凍處理有不同的響應(yīng)。由于不同保護(hù)劑的作用機(jī)理存在很大差別，并且在多數(shù)情況下，單一的保護(hù)劑只能發(fā)揮單一的效果，不能為組織、細(xì)胞提供最佳的保護(hù)效果[66]。因此，復(fù)配多種保護(hù)劑以達(dá)到最佳保護(hù)效果是重要的優(yōu)化途徑。

國內(nèi)外研究表明，通過正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法，將不同種保護(hù)劑以一定比例進(jìn)行復(fù)配對菌體的保護(hù)效果更好，顯著提高了活菌數(shù)和發(fā)酵活力。辛明等[67]采用響應(yīng)面法對植物乳桿菌L5、L12凍干保護(hù)劑中的脫脂奶、海藻糖、硫酸錳的最佳配比進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，當(dāng)凍干保護(hù)劑的配比為脫脂奶30.98 g/100 mL、海藻糖22.15 g/100 mL、硫酸錳0.19 g/100 mL時(shí)，植物乳桿菌L5發(fā)酵劑的生長速度更快，產(chǎn)酸能力更強(qiáng)，且凍干存活率達(dá)82.55%；而植物乳桿菌L12的最佳凍干保護(hù)劑配方為15.98 g/100 mL脫脂乳、10.85 g/100 mL海藻糖、0.05 g/100 mL硫酸錳，凍干存活率達(dá)到了83.66%[67]。Stefanello等[68]研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖、蔗糖和脫脂牛奶的組合為乳桿菌IAL454提供了最有效的保護(hù)，使其凍干存活率保持在83%～85%之間。綜上所述，不同的保護(hù)劑配方對凍干乳酸菌的存活率有很大的影響。

但截至目前，由于菌種的特異性以及不同保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)理不同，仍沒有發(fā)現(xiàn)一種有效適合所有乳酸菌的凍干保護(hù)劑配方。如表2所示，為了最大限度地提高乳酸菌真空冷凍干燥的存活率，研究者們針對不同種類的乳酸菌篩選出了不同的保護(hù)劑組合。其中，5%蔗糖、2%甘油、0.8%谷氨酸鈉、1%抗壞血酸、5%海藻糖為嗜熱鏈球菌MN002的最優(yōu)保護(hù)劑配方；而10%脫脂乳、7%海藻糖、2%山梨醇和0.6%酪氨酸為復(fù)合凍干保護(hù)劑時(shí)，冷凍干燥植物乳桿菌L2的存活率高達(dá)92%。雙歧乳桿菌的最佳保護(hù)條件為甘氨酸5.5%、碳酸氫鈉0.8%、低聚木糖7%、精氨酸4.5%、脫脂乳25%時(shí)，可使其凍干存活率達(dá)到90.37%。因此，對于不同的種類要篩選不同的保護(hù)劑配方。

表2 不同乳酸菌對應(yīng)的凍干保護(hù)劑Table 2 Cryoprotectants for freeze drying of different lactic acid bacteria

2.4 優(yōu)化真空冷凍干燥工藝條件降低乳酸菌的凍干損傷

為獲得更高的菌體存活率，需要嚴(yán)格控制真空冷凍干燥工藝。目前有研究表明菌體在凍干過程中的活性損失大部分發(fā)生在預(yù)凍階段。預(yù)凍處理是將物料中的游離水凍結(jié)，為之后的干燥處理做準(zhǔn)備，預(yù)凍處理主要影響菌體產(chǎn)生的冰晶大小。故合適的預(yù)凍溫度和冷卻速率也是真空冷凍干燥工藝的重要環(huán)節(jié)。若冷卻速率過快，會(huì)產(chǎn)生大的冰晶，同時(shí)延長細(xì)胞的脫水過程，會(huì)對菌體造成極大的傷害，但快速冷卻可以避免溶質(zhì)效應(yīng)和細(xì)胞過度收縮[75]。同時(shí)凍干厚度、菌泥與保護(hù)劑的比例也對冷凍干燥質(zhì)量產(chǎn)生影響。

如果冷凍溫度不夠，則會(huì)使菌液凍結(jié)得不夠徹底，造成菌液在升華干燥時(shí)發(fā)生膨脹、起泡現(xiàn)象，從而影響菌粉的品質(zhì)；但若預(yù)凍溫度太低，不但會(huì)造成菌液的浪費(fèi)，而且還會(huì)加劇對菌體的傷害，影響其凍干存活率。因此，合適的預(yù)凍溫度對乳酸菌的凍干至關(guān)重要。不同類型的乳酸菌，其最適預(yù)冷凍溫度差別很大。如表3所示，針對不同種類的乳酸菌，研究人員篩選了不同的預(yù)冷凍溫度，鼠李糖乳桿菌LR-1的最佳預(yù)冷凍溫度為－20 ℃[73]，植物乳桿菌LP-7501S的最佳預(yù)冷凍溫度為－80 ℃[50]，而植物乳桿菌SC1的最佳預(yù)冷凍溫度為－70 ℃[76]；同屬的乳酸菌處在不同條件下，最佳的預(yù)冷凍溫度也會(huì)有所差異。Wang Guangqiang等[77]的研究表明，當(dāng)使用山梨醇作為保護(hù)劑時(shí)，植物乳桿菌AR113、AR307、WCFS1的最佳預(yù)冷凍溫度分別為－196、－40 ℃和－20 ℃，而當(dāng)使用海藻糖為保護(hù)劑時(shí)，它們?nèi)叩淖罴杨A(yù)冷凍溫度為－20、－60 ℃和－60 ℃。因此，最佳預(yù)凍溫度的選擇是乳酸菌凍干過程中的重要環(huán)節(jié)。

表3 不同乳酸菌對應(yīng)的預(yù)冷凍溫度Table 3 Pre-freezing temperatures for freeze drying of different lactic acid bacteria

2.4.2 冷卻速率對乳酸菌凍干存活率的影響

在預(yù)凍過程中，冷卻速率是乳酸菌活力的關(guān)鍵因素。如圖3所示，在預(yù)冷凍階段，合適的冷卻速率可以減輕細(xì)胞在凍干過程中受到的損傷[54]。a表示冷卻速率過慢，細(xì)胞由于過度脫水收縮，容易發(fā)生“溶質(zhì)損傷”，過度收縮，可導(dǎo)致蛋白失去活性，從而使細(xì)胞失去活性而死亡；c表示冷卻速率過快，易導(dǎo)致胞內(nèi)和胞外的水分子結(jié)成冰晶，進(jìn)而穿透細(xì)胞，給菌體帶來嚴(yán)重的物理傷害；b表示最適的冷卻速率，在此條件下，細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)過度脫水收縮和胞內(nèi)結(jié)冰，能夠最大程度降低細(xì)胞受到的損傷。不同種的乳酸菌有其不同的最適冷卻速率，在冷卻速率為－1 ℃/min時(shí)植物乳桿菌ST-3的凍干存活率最高，而在－10 ℃/min條件下，干酪乳桿菌LC2W可以得到最高的凍干存活率[53]。目前，冷卻速率在乳酸菌真空冷凍干燥過程中對其凍干存活率影響的研究比較匱乏，因此，研究乳酸菌的最適冷卻速率至關(guān)重要。

圖3 不同冷卻速率對乳酸菌存活的影響Fig.3 Effect of cooling rate on the survival of lactic acid bacteria

2.4.3 保護(hù)劑與菌泥的混合比例對乳酸菌凍干存活率的影響

凍干保護(hù)劑與菌泥的配比也會(huì)影響乳酸菌的凍干活性。保護(hù)劑濃度過低，不能充分保護(hù)乳酸菌在真空冷凍干燥過程中的活性；保護(hù)劑濃度過高，細(xì)胞凍干存活率也會(huì)下降，究其原因可能是保護(hù)劑濃度過高時(shí)阻礙了水分的揮發(fā)，導(dǎo)致冰晶的生成，從而提升了細(xì)胞的死亡率[79]。如許女等[80]的研究表明，以甘油0.5%、山梨醇2%、麥芽糊精1%、脫脂奶粉10%、海藻糖1.5%為凍干保護(hù)劑配方，保護(hù)劑與菌泥的混和比例為1∶3時(shí)，植物乳桿菌MA2的凍干存活率為61%。因此，選擇合適的混合比例非常重要。

2.4.4 凍干厚度對乳酸菌凍干存活率的影響

在凍干過程中，凍干厚度也是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。凍干厚度會(huì)對后續(xù)凍干時(shí)間以及最后凍干產(chǎn)品的性狀產(chǎn)生影響，研究表明，如果樣品太薄，不僅極易融化，而且在真空冷凍干燥后，樣品的凍干存活率較低，復(fù)水率也相對較低；反之，增加樣品厚度則不易融化，降低了對菌體的傷害；但是，過厚的樣本，會(huì)延長凍干所需的時(shí)間[81]。張雅碩等[79]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 cm是副干酪乳桿菌的最佳凍干厚度。植物乳桿菌299的最佳凍干厚度為1.2 cm[82]。因此，選擇最優(yōu)的凍干厚度有利于乳酸菌的凍干保護(hù)。

3 優(yōu)化貯藏條件以降低乳酸菌活菌數(shù)的損失

3.1 貯藏溫度

貯藏溫度對保持益生菌的活性至關(guān)重要，過高的溫度會(huì)導(dǎo)致氧化反應(yīng)或膜脂質(zhì)相轉(zhuǎn)變，這對益生菌的存活不利[83]；而低溫環(huán)境保存能使凍干菌體的活力得到很好的保護(hù)[84]。如馬雁等[85]研究表明，－20 ℃是乳桿菌grxo7可以長時(shí)間貯藏的最適溫度，在該溫度下，菌粉的存活率、β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶等活力得到了較好維持。楊一兵[86]、姚國強(qiáng)[87]等研究表明，4 ℃有利于短期貯藏菌粉，而對于長期貯藏，－20 ℃的貯藏效果更好。Shu Guowei等[88]研究發(fā)現(xiàn)，低溫可以有效保持菌粉活性，而常溫狀態(tài)下貯藏的菌粉，由于細(xì)胞內(nèi)水分比較活躍，故容易導(dǎo)致細(xì)胞喪失活力。因此，凍干粉最好保存在低溫環(huán)境中，并且在使用時(shí)必須進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，以免引起過敏現(xiàn)象。

3.2 氣體成分

眾多研究表明凍干粉貯藏環(huán)境中的氣體組成、含氧量等對凍干菌體的保存性能有很大的影響。如張曉寧等[89]的研究表明，當(dāng)凍干后的植物乳桿菌LIP-1在真空環(huán)境下貯藏，菌體的β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶、K＋-ATP酶活性都比氮、氧兩種貯藏環(huán)境下的酶活性高。因此，在低氧環(huán)境下貯藏凍干粉，可有效地增加微生物數(shù)量，并保持其良好的活性。

3.3 水分含量

含水量對乳酸菌貯藏期間的存活具有顯著影響。乳酸菌的酶活性、物理反應(yīng)速率等都對水分活度有所依賴。如王淑敏等[90]研究表明，乳雙岐桿菌A04菌粉水分活度在0.03～0.1之間時(shí)，其貯藏效果最好。Jiménez等[91]將副干酪LBC81用膠囊包裹起來，在25、35 ℃和45 ℃，水分活度為0.103～0.846條件下貯存7 周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌粉的菌體存活率在水活度為0.536時(shí)下降得很快。任琳等[92]研究發(fā)現(xiàn)，具有不同水分含量的凍干樣品中，植物乳桿菌在凍干過程中的存活率無明顯變化，而隨水分含量的減少，樣品復(fù)水后進(jìn)入對數(shù)生長階段的時(shí)間變長，其恢復(fù)能力變?nèi)?。因此，只有保持較低且穩(wěn)定的含水量和水分活度，才能保證乳酸菌凍干粉的貯藏穩(wěn)定性。

3.4 包裝形式

包裝指使用一種或多種封裝材料，在微生物與周圍環(huán)境之間形成物理屏障，從而保護(hù)微生物[93]。一般凍干菌粉的貯藏時(shí)間受陽光、濕度、氧氣、pH值、滲透變化等因素的影響，為保存凍干產(chǎn)品常采用阻氧、阻光的包裝材料以排除這些因素的影響[94]。此外，還需考慮凍干產(chǎn)品和包裝材料之間的交互作用。如桑躍等[95]發(fā)現(xiàn)充氮包裝的乳桿菌A6菌粉和BBMN68菌粉與普通包裝的菌粉相比，其存活率分別提升了4.2 倍和7.2 倍。張敏等[96]研究發(fā)現(xiàn)，采用不同包裝材料的植物乳桿菌LN66在4 ℃環(huán)境下貯藏1 個(gè)月，真空鋁箔袋、棕色玻璃瓶包裝的菌粉存活率均高于普通鋁箔紙包裝的菌粉，并分別上升2.8%和2.10%。

目前，真空冷凍干燥制品的包裝材料使用最多的是玻璃、塑料、橡膠和一些金屬材料，但玻璃具有易碎性、質(zhì)量大等缺點(diǎn)；塑料的阻氧性等客觀因素使其推廣受限[96]。因此，將不同材料復(fù)合應(yīng)用可以彌補(bǔ)缺陷，多層復(fù)合薄膜外層是可印刷的雙向拉伸聚丙烯薄膜、聚對苯二甲酸乙二醇酯，內(nèi)部是封熱性能高的流延聚丙烯薄膜、聚乙烯材料等，中間還可采用鋁箔、乙烯-乙烯醇共聚物等材料提高阻隔能力。

4 結(jié)語

近年來，真空冷凍干燥技術(shù)已經(jīng)成為醫(yī)藥、食品工業(yè)中的一種非常重要的技術(shù)。利用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)出高活菌數(shù)且能長期保持活性的乳酸菌菌粉是醫(yī)藥及食品發(fā)酵工業(yè)的重要研究目標(biāo)。本文分析了乳酸菌細(xì)胞在真空冷凍干燥過程中的損傷及保護(hù)機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上對其生長培養(yǎng)基、脅迫預(yù)處理、凍干保護(hù)劑、工藝條件、封裝材料等方面對乳酸菌凍干存活率和貯藏時(shí)間的影響因素進(jìn)行了總結(jié)，對乳酸菌發(fā)酵劑的凍干保藏技術(shù)在保護(hù)性條件選擇方面有一定的參考作用。保護(hù)性條件不僅能夠提高乳酸菌在凍干過程中的存活率，同時(shí)也對貯藏過程中乳酸菌的活力與穩(wěn)定性有一定積極的影響。目前研究者們在提高乳酸菌生物膜合成與抗凍性、篩選最佳保護(hù)劑組合、貯藏保護(hù)性條件等方面開展了大量研究，但仍有不足。首先，有關(guān)具有普適性保護(hù)效果凍干保護(hù)劑的配方研究較少；其次，研究表明，乳酸菌凍干粉在低溫、避光及真空環(huán)境下能基本實(shí)現(xiàn)長期貯藏，開發(fā)新型復(fù)合封裝材料能更好地維持其貯藏穩(wěn)定性；最后，應(yīng)加強(qiáng)促進(jìn)開發(fā)乳酸菌生長發(fā)育的新型益生元類保護(hù)劑，減少在凍干過程中營養(yǎng)元素的損失，進(jìn)而提高乳酸菌凍干存活率、延長貯藏期。