嚴(yán)茹雪，李 越，牛家峰，陸兆新，孟凡強(qiáng)，朱 萍，呂鳳霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又名嘔吐毒素，是主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、粉色鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌侵染谷物后所產(chǎn)生的一種有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于小麥、玉米等糧谷類原料及其制品中，對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成巨大威脅[1-2]。當(dāng)DON進(jìn)入食物鏈時(shí)，會(huì)威脅食品安全并危害人類健康，引起急性和慢性毒性，如食欲不振、惡心、嘔吐、胃腸炎腹瀉、免疫抑制和體質(zhì)量下降等[1,3-5]。因此，迫切需要制定有效的措施預(yù)防和控制食品及飼料工業(yè)中的DON污染。

近年來，DON生物降解方法倍受關(guān)注，對(duì)DON生物降解的研究主要包括微生物降解法和酶解毒法。研究已證實(shí)微生物降解法的有效性，但由于微生物及其代謝產(chǎn)物的分解能力較弱，影響了實(shí)際的降解效果，而微生物降解的本質(zhì)也是一種通過酶對(duì)毒素進(jìn)行解毒的方法。相比傳統(tǒng)的物理、化學(xué)脫毒方法存在效果不穩(wěn)定、飼料營養(yǎng)成分損失大、影響飼料適口性等缺點(diǎn)，酶解毒法具有解毒效率高、特異性強(qiáng)、對(duì)糧食、飼料和環(huán)境無污染等優(yōu)勢，因而在食品加工和食品安全領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值[6-7]。研究報(bào)道，DON的C3位上羥基和C12/13環(huán)氧基團(tuán)是DON的主要毒性基團(tuán)，也是生物降解的主要研究位點(diǎn)[8-10]。其中C3位上羥基的氧化和異構(gòu)化是目前報(bào)道最多、研究最為透徹的解毒方式，且許多DON解毒酶已被挖掘[8,10-13]。例如，醌依賴性醇脫氫酶DepA/QDDH/DDH能夠?qū)ON氧化為毒性較小的3-酮基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-keto-DON）[8,11,13]，再經(jīng)過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性醛酮還原酶DepB/AKR13B2/AKR6D1將3-keto-DON還原，生成無毒的3-異構(gòu)-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-epi-DON），即C3位的異構(gòu)化[12-13]，這也是目前闡述的最為詳細(xì)的DON生物轉(zhuǎn)化途徑，解毒效果專一。其中，DepB作為DON生物轉(zhuǎn)化途徑中第二步關(guān)鍵酶，可將中間產(chǎn)物3-keto-DON完全降解為無毒的3-epi-DON，且單向不可逆。盡管目前所挖掘出的DON解毒酶基因均實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的異源表達(dá)，但表達(dá)水平不高[12]，且DON解毒酶基因在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）安全級(jí)表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)的研究鮮見報(bào)道。

枯草芽孢桿菌作為研究最為透徹的革蘭氏陽性菌，具有無致病性、易于遺傳操作、發(fā)酵周期短等特點(diǎn)，已被食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為GRAS（generally recognized as safe）菌株[14]?？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)廣泛用于各種工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)，如普魯蘭酶[15]、L-天冬酰胺酶[16]、酰胺酶[17]和α-淀粉酶[18]等。研究表明，表達(dá)元件中的不同啟動(dòng)子具有不同的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，通過控制酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響重組酶的表達(dá)水平，單個(gè)啟動(dòng)子的替換和串聯(lián)啟動(dòng)子被用來提高重組酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平[17,19-21]。此外，核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomal binding site，RBS）是影響重組酶表達(dá)水平的另一個(gè)因素，不同RBS具有不同翻譯起始速率，它可以在翻譯水平上調(diào)控酶基因的表達(dá)水平[22-24]。因此，采用轉(zhuǎn)錄和翻譯相結(jié)合的策略可以實(shí)現(xiàn)重組酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)。

本研究實(shí)現(xiàn)DON解毒酶DepB在枯草芽孢桿菌RIK1285中的異源表達(dá)，并通過表達(dá)元件的優(yōu)化，包括信號(hào)肽篩選、單個(gè)啟動(dòng)子替換、雙啟動(dòng)子系統(tǒng)構(gòu)建、啟動(dòng)子核心區(qū)域（-35和-10區(qū)）優(yōu)化和RBS工程相結(jié)合的系統(tǒng)策略，以提高DepB在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平，旨在為DON解毒酶工業(yè)化應(yīng)用和酶制劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌168、克隆宿主大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、表達(dá)宿主枯草芽孢桿菌RIK1285和表達(dá)載體pP43NMK均由本實(shí)驗(yàn)室保存。編碼DepB的DNA序列（GenBank：KFL28068.1）由南京金斯瑞生物科技股份有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化和合成。本研究所用引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

硫酸卡那霉素 北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒DC301及質(zhì)粒小量提取試劑盒DC201、2×Phanta Master Mix、ClonExpression II One Step Cloning Kit南京諾唯贊健康科技有限公司；預(yù)染Marker 翌圣生物科技（上海）股份有限公司；蛋白Marker 26610 美國賽默飛世爾科技公司；硝酸纖維素膜 美國通用公司；ECL發(fā)光試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基[25]：45 g/L蔗糖、12 g/L玉米淀粉、15 g/L蛋白胨、0.8 g/L尿素、2.612 g/L K2HPO4·3 H2O、2.041 g/L KH2PO4、1.845 g/L MgSO4·7 H2O、3 g/L NaCl，pH 7。

1.2 儀器與設(shè)備

PTC-100TM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、HC164-5052高電流電泳儀 美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000核酸定量儀 美國Thermo公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

利用引物對(duì)DepB-F、DepB-R通過PCR擴(kuò)增C端帶有His標(biāo)簽的DepB目的基因，通過引物對(duì)V1和V2對(duì)空質(zhì)粒pP43NMK進(jìn)行線性化。后通過同源重組的方法將目的基因和線性化的質(zhì)粒組裝，得到DepB-His重組表達(dá)載體。同時(shí)，利用上述方法以枯草芽孢桿菌168及空質(zhì)粒pHT43為模板擴(kuò)增出10 條不同類型的信號(hào)肽，分別融合到目的基因DepB的N端得到相應(yīng)的表達(dá)載體。此外，為提高重組DepB在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平，8 個(gè)組成型啟動(dòng)子（PaprE、PsecA、Pylbp、Phag、PfusA、PspoVG、PyvyD和PamyE）及一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PsacB，16 個(gè)雙啟動(dòng)子用來替換原始啟動(dòng)子P43（圖1）。為了進(jìn)一步提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)啟動(dòng)子的核心區(qū)域進(jìn)行突變。采用同樣的方法，設(shè)計(jì)了19 個(gè)RBS序列替換原始的RBS序列。啟動(dòng)子和RBS工程的示意圖見圖1。測序正確的載體通過Gryczan等[26]的方法轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌RIK1285感受態(tài)細(xì)胞中。

圖1 表達(dá)元件的優(yōu)化示意圖Fig.1 Schematic diagram of the optimization of expression elements

1.3.2 重組DepB在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)情況分析

將重組菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h；含PsacB啟動(dòng)子介導(dǎo)的菌株在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm＝0.8，加入誘導(dǎo)劑（蔗糖溶液）至終質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，于20 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，收集上清液以及菌體，上清液作為胞外蛋白樣品；菌體用5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（200 mmol/L NaCl，pH 7.5）重懸，然后在4 ℃條件下超聲破碎20 min，離心取上清液，上清液為胞內(nèi)蛋白樣品。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的蛋白樣品，分析蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 DepB活力測定

依據(jù)Carere等[12]的方法，將20 μL粗酶液加入到含有50 mmol/L Tris-HCl、150 μmol/L NADPH和100 μmol/L 3-keto-DON的300 μL反應(yīng)體系（pH 7.0）中。然后，將反應(yīng)體系在30 ℃孵育5 min。使用紫外-可見分光光度計(jì)檢測340 nm波長處吸光度的下降。一個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘消耗1 μmol NADPH所需的酶量。

1.3.4 SDS-PAGE和Western blot分析

胞內(nèi)外蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，然后通過SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行分離檢測。對(duì)于Western blot實(shí)驗(yàn)，將SDS-PAGE分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后將膜置于1∶20 000稀釋的抗His-Tag抗體中，在4 ℃條件下孵育16 h。然后將該膜用TBST緩沖液洗3 次，再用TBS洗一次，每次洗膜15 min。最后用高靈敏的ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DepB在枯草芽孢桿菌RIK1285中的異源表達(dá)

N端未融合信號(hào)肽的DepB重組菌和10 個(gè)融合了不同類型信號(hào)肽的DepB重組菌經(jīng)搖瓶發(fā)酵，制備粗酶液，測定DepB活力，并對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。結(jié)果表明，融合不同類型信號(hào)肽的重組DepB未能實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)外分泌（圖2），而N端未融合信號(hào)肽的重組DepB實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)表達(dá)，其酶活力為14.45 U/mL。另外，Western blot分析結(jié)果顯示在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶，與DepB的理論分子質(zhì)量（38.5 kDa）一致（圖2B），實(shí)現(xiàn)了DepB在枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)。

圖2 不同信號(hào)肽介導(dǎo)的DepB表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of DepB mediated by different signal peptides

2.2 單啟動(dòng)子對(duì)重組菌株表達(dá)水平的影響

為了在轉(zhuǎn)錄水平上提高DepB的表達(dá)水平，選擇了9 個(gè)具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子替代原始啟動(dòng)子P43。發(fā)酵72 h后，不同啟動(dòng)子介導(dǎo)的DepB表達(dá)效果差異較大，啟動(dòng)子PsacB、PspoVG和PaprE表現(xiàn)出比P43啟動(dòng)子更好的性能，酶活力分別為28.61、29.59 U/mL和22.44 U/mL（圖3A）。其中啟動(dòng)子PspoVG所介導(dǎo)的DepB酶活力最高，是原始菌株的2.05 倍，重組菌株胞內(nèi)樣品SDS-PAGE分析如圖3B所示，在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶。研究表明，啟動(dòng)子PspoVG也是具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子，其介導(dǎo)的酰胺酶、α-淀粉酶AmyZ1和普魯蘭酶的表達(dá)水平均高于P43所介導(dǎo)的表達(dá)水平[17,27-28]，這與本研究結(jié)果一致。而在啟動(dòng)子P43介導(dǎo)下的DepB產(chǎn)量比啟動(dòng)子PyvyD更高，這與Niu Jiafeng等[29]采用啟動(dòng)子PyvyD所介導(dǎo)的I型L-天冬酰胺酶（BlAase）表達(dá)水平更高的研究結(jié)果相反。由此可見，即使是在同一啟動(dòng)子的啟動(dòng)下，不同基因的表達(dá)水平也各不相同。

圖3 不同啟動(dòng)子介導(dǎo)的重組DepB表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of recombinant DepB mediated by different single promoters

2.3 串聯(lián)啟動(dòng)子對(duì)重組菌株表達(dá)水平的影響

據(jù)報(bào)道，雙啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)是提高重組酶表達(dá)水平的有效手段。串聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)是通過將不同的單啟動(dòng)子插入到另一個(gè)啟動(dòng)子的下游構(gòu)建，其轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度也各不相同[17,30-31]。為了進(jìn)一步提高重組DepB產(chǎn)量，以單啟動(dòng)子的表達(dá)水平為基礎(chǔ)，進(jìn)行雙啟動(dòng)子系統(tǒng)的構(gòu)建。選擇了4 個(gè)具有較高DepB表達(dá)水平的啟動(dòng)子（PsacB、P43、PaprE和PspoVG），構(gòu)建了16 個(gè)雙啟動(dòng)子系統(tǒng)。如圖4A所示，P43-PaprE、P43-PspoVG、P43-P43、PsacB-PaprE、PsacB-PspoVG、PsacB-P43、PaprE-PaprE、PaprE-PspoVG、PspoVGPaprE和PspoVG-P43較最優(yōu)單啟動(dòng)子PspoVG的表達(dá)水平更高。其中，啟動(dòng)子PaprE-PspoVG所介導(dǎo)的DepB活力最高，為48.87 U/mL，是原始菌株的3.38 倍。此外，SDS-PAGE分析如圖4B所示，在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶。Guan Chengran等[30]也報(bào)道了類似結(jié)果，其研究中6 個(gè)雙啟動(dòng)子中只有2 個(gè)比單啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度高，這是因?yàn)殡p啟動(dòng)子的強(qiáng)度并不是單一啟動(dòng)子啟動(dòng)強(qiáng)度的簡單相加。

圖4 不同雙啟動(dòng)子表達(dá)載體介導(dǎo)下的重組DepB的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of recombinant DepB mediated by various dual-promoter systems

這16 個(gè)雙啟動(dòng)子系統(tǒng)所介導(dǎo)的DepB活力各不相同，與Px-PsacB雙啟動(dòng)子系統(tǒng)相比，Px-PspoVG的表達(dá)水平更高。這一結(jié)果可能是因?yàn)殡p啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)強(qiáng)度主要取決于與報(bào)告基因相鄰啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度[17,31]。結(jié)果表明，雙啟動(dòng)子系統(tǒng)是在轉(zhuǎn)錄水平上提高重組蛋白產(chǎn)量的有效策略。

2.4 啟動(dòng)子核心區(qū)域改造對(duì)重組菌株表達(dá)水平的影響

啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度與其保守區(qū)域（-35和-10區(qū)）密切相關(guān)，對(duì)這些核心區(qū)域的修飾被認(rèn)為是提高重組蛋白產(chǎn)量的有效方法[32-34]。因此，為了進(jìn)一步提高串聯(lián)啟動(dòng)子PaprE-PspoVG的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，對(duì)啟動(dòng)子PaprE和PspoVG的核心區(qū)進(jìn)行改造。PspoVG和PaprE分別是σH和σA依賴型啟動(dòng)子，其核心區(qū)域的保守序列如圖5A所示[35-36]。然而，PspoVG和PaprE的保守序列與枯草芽孢桿菌中σH和σA依賴型啟動(dòng)子的-35和-10區(qū)的保守序列并不完全匹配，故將啟動(dòng)子PaprE和PspoVG的-35和-10區(qū)分別/組合突變?yōu)橄鄳?yīng)的保守序列，構(gòu)建了5 個(gè)突變體（圖5A）。如圖5B所示，Mutant-1、Mutant-2和Mutant-3（Mutant-1和Mutant-2分別是啟動(dòng)子PaprE的-35區(qū)和-10區(qū)突變，Mutant-3是啟動(dòng)子PaprE的-35和-10區(qū)組合突變）的酶活力分別為59.55、58.58 U/mL和62.18 U/mL，分別是原始菌株的4.12、4.05 倍和4.30 倍。Mutant-4（啟動(dòng)子PspoVG的-35區(qū)突變）酶活力為67.19 U/mL，是原始菌株的4.65 倍。這表明在雙啟動(dòng)子系統(tǒng)中與報(bào)告基因相鄰的啟動(dòng)子是一個(gè)更加關(guān)鍵的啟動(dòng)子，對(duì)控制重組蛋白的表達(dá)水平至關(guān)重要。此外，Mutant-5（啟動(dòng)子PspoVG和PaprE的-35和-10區(qū)域的組合突變）酶活力為69.17 U/mL（圖5B），是原始菌株的4.79 倍。另外，SDS-PAGE分析如圖5C所示，在37 kDa附近具有特異性蛋白條帶。Li He等[27]通過啟動(dòng)子保守區(qū)域的改造，成功提高了α-淀粉酶AmyZ1在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平，這與本研究結(jié)果一致，說明通過優(yōu)化啟動(dòng)子的核心區(qū)域提高異源蛋白的生產(chǎn)水平是一種有效方法。

圖5 雙啟動(dòng)子系統(tǒng)保守區(qū)域改造Fig.5 Modification of core region of dual-promoter PaprE-PspoVG

2.5 RBS序列對(duì)重組菌株表達(dá)水平的影響

據(jù)報(bào)道，目的蛋白的表達(dá)水平不僅與啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度有關(guān)，還受翻譯起始速率的調(diào)控[37-39]。RBS序列是決定翻譯起始速率和蛋白表達(dá)水平的關(guān)鍵因素，優(yōu)化該區(qū)域被認(rèn)為是提高重組蛋白產(chǎn)量的有效策略[40]。因此，為了在翻譯水平上進(jìn)一步提高重組DepB的表達(dá)水平，選擇了19 個(gè)RBS序列替換Mutant-5的原始RBS序列（RBS 0：AAAGGAGGTGAAATGTACAC）。RBS 1～RBS 14是在枯草芽孢桿菌或大腸桿菌中使用的具有高蛋白表達(dá)水平的RBS序列，RBS 15～RBS 19是通過在線軟件RBS Calculator v2.0（https://salislab.net/software/）設(shè)計(jì)的具有不同翻譯起始速率的RBS序列。如圖6A所示，在不同RBS序列的介導(dǎo)下，DepB的表達(dá)水平各不相同。與原始RBS序列相比，RBS 1～5、RBS 8、RBS 11、RBS 13、RBS 15、RBS 16和RBS 18所介導(dǎo)的DepB具有更高的表達(dá)水平。與原始菌株相比，通過RBS Calculator v2.0設(shè)計(jì)的5 個(gè)RBS序列中有3 個(gè)（RBS 15、RBS 16和RBS 18）具有更高的表達(dá)水平，結(jié)果表明RBS Calculator v2.0是有效的預(yù)測軟件。在RBS 15的介導(dǎo)下，重組DepB的酶活力達(dá)到了115.15 U/mL，是Mutant-5的1.66 倍，是原始菌株的7.97 倍。另外，SDS-PAGE分析也證實(shí)了這一結(jié)果（圖6B），說明基于優(yōu)化RBS序列是在翻譯水平上提高重組蛋白產(chǎn)量的有效策略。

圖6 不同RBS介導(dǎo)下的重組DepB表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of recombinant DepB mediated with different RBS sequences

3 結(jié)論

本研究實(shí)現(xiàn)了DON解毒酶DepB在枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)，但其表達(dá)水平有限。為了提高其表達(dá)水平，通過轉(zhuǎn)錄和翻譯相結(jié)合的方法，包括單啟動(dòng)子的篩選和替換、雙啟動(dòng)子系統(tǒng)的構(gòu)建、啟動(dòng)子核心區(qū)域（-35和-10區(qū)）的優(yōu)化以及RBS序列的替換，提高了重組DepB的產(chǎn)量。優(yōu)化后，DepB的酶活力由14.45 U/mL提高到了115.15 U/mL，是含有P43啟動(dòng)子的原始菌株的7.97 倍。上述結(jié)果不僅提供了提高枯草芽孢桿菌中重組蛋白表達(dá)水平的系統(tǒng)性方法，也為DON解毒酶在谷物原料及飼料中的應(yīng)用提供了依據(jù)。