周玲, 龔金炎,何光華,肖功年,許韓山,李玲*

1(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 杭州,310023)2(杭州市臨平區(qū)質(zhì)量計(jì)量監(jiān)測(cè)中心,浙江 杭州, 311199)

β-半乳糖苷酶是一種重要的酶,具有水解乳糖和合成低聚半乳糖的功能,通常來源于細(xì)菌、酵母菌、霉菌等微生物[1]。β-半乳糖苷酶在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用于制造乳糖水解物(供乳糖不耐受患者使用)以及形成糖基化產(chǎn)物,具有重要意義。牛乳中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%～5.0%,乳糖經(jīng)過人體小腸黏膜細(xì)胞中分泌的β-半乳糖苷酶水解后才能被機(jī)體吸收,缺乏該酶會(huì)導(dǎo)致乳糖不耐受。在非洲國(guó)家乳糖不耐癥人群高達(dá)90%～100%,在亞洲占70%[2]。目前,解決乳糖不耐癥的最佳方法是用β-半乳糖苷酶水解乳糖生產(chǎn)低乳糖或無乳糖乳制品[3]。常用的商業(yè)化β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度大多較高,對(duì)pH的要求比較嚴(yán)格,從而存在生產(chǎn)成本較高、消耗能量高等問題。但是,在乳制品生產(chǎn)工業(yè)中,很多操作工藝都是在低溫下進(jìn)行,因此,理想化的β-半乳糖苷酶是能夠在低溫下具有較高酶活性的適冷酶。本文從β-半乳糖苷酶的微生物來源、特性、催化特性的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。進(jìn)一步對(duì)適冷β-半乳糖苷酶的來源、特性、耐冷機(jī)制及工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的闡述。并對(duì)適冷β-半乳糖苷酶前景進(jìn)行了展望,為該酶改造的深入探索與應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 β-半乳糖苷酶來源、特性及催化機(jī)制

1.1 β-半乳糖苷酶來源及特性

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC:3.2.1.23)全稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrolase),俗稱乳糖酶,具有催化半乳糖和葡萄糖之間β-糖苷鍵功能,也參與合成半乳糖化產(chǎn)物或低聚半乳糖。根據(jù)基因序列、結(jié)構(gòu)、底物特異性和反應(yīng)機(jī)理不同,β-半乳糖苷酶分為糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)GH1、GH2、GH35和GH42家族。大部分已報(bào)道的微生物來源的β-半乳糖苷酶屬于GH2和GH42家族。

β-半乳糖苷酶來源廣泛,主要來源于微生物,如細(xì)菌、酵母和絲狀真菌。其中,酵母菌、霉菌是商業(yè)化β-半乳糖苷酶的主要來源,有曲霉菌屬(Aspergillus)和克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)[4]。不同來源的β-半乳糖苷酶在酶學(xué)特征上存在較大差異。一般霉菌來源β-半乳糖苷酶的最適pH值為2.5～5.4,最適溫度最高達(dá)到50 ℃。霉菌來源的β-半乳糖苷酶是胞外酶,便于應(yīng)用于水解乳糖。相反,酵母菌來源的β-半乳糖苷酶是胞內(nèi)酶,乳糖先通過透性酶轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)再被水解代謝[5]。來自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶最適pH值為4.8,最適溫度是50 ℃;來自脆壁克魯維酵母和黑曲霉的β-半乳糖苷酶的最適pH值為4.0～4.5,pH值為3.0～7.0時(shí)較為穩(wěn)定,最適溫度為55 ℃[6]。乳酸菌作為一般認(rèn)為安全的微生物,也是β-半乳糖苷酶的較好來源。從植物乳桿菌BFP32中所分離得到的β-半乳糖苷酶的最適溫度為60～65 ℃;從德氏乳桿菌和母乳中篩選出的發(fā)酵乳桿菌中的β-半乳糖苷酶的最適溫度為40 ℃[7-8]。從保加利亞乳桿菌L2和嗜熱鏈球菌S2 中分離出來的β-半乳糖苷酶,在42 ℃條件下發(fā)酵脫脂乳6 h時(shí),其乳糖分解率均高于65%,乳糖殘存量均低于2%[9]。MAISCHBERGER等[10]在戊糖乳桿菌中篩選的β-半乳糖苷酶的最適pH值為7.5,最適溫度為55 ℃;以乳糖為底物,最適pH值為8.0,最適溫度為60～65 ℃。從乳酸菌篩選出的β-半乳糖苷酶的活性相對(duì)高,但是,在中溫或高溫條件下其酶活性和水解乳糖能力相對(duì)高。

1.2 β-半乳糖苷酶的催化機(jī)制

1.2.1 分解乳糖的作用機(jī)制

乳糖不耐癥在世界多數(shù)地區(qū)都存在,亞洲地區(qū)成年人中有乳糖不耐癥占70%以上[2]。目前,乳制品用β-半乳糖苷酶預(yù)先處理后,乳制品中的乳糖含量可降低70%～80%。利用β-半乳糖苷酶生產(chǎn)低乳糖牛奶等乳制品成為解決乳糖不耐受問題最有效的途徑[3]。除此之外,水解乳糖可減少由于乳糖的低溶解度而引起的結(jié)晶問題,并增加了乳制品的甜度。β-半乳糖苷酶對(duì)乳糖的水解分為糖基化和去糖基化兩個(gè)步驟(圖1-a)。首先是糖基化,乳糖通過催化反應(yīng)將其分解成葡萄糖和酶-半乳糖共價(jià)中間復(fù)合物。其次是去糖基化,葡萄糖分離后使半乳糖的異頭碳原子與水分子中的羥基基團(tuán)生成半乳糖分子,從而達(dá)到把乳糖水解成為葡萄糖和半乳糖的目的[11]。

1.2.2 合成低聚半乳糖的作用機(jī)制

由半乳糖連接成聚合度為2～9的,通常在還原端含有一個(gè)葡萄糖單位的低聚糖為低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶還可在人體內(nèi)通過轉(zhuǎn)糖苷作用生成低聚半乳糖,作為一種膳食纖維,它在腸道內(nèi)作為增殖因子僅被雙歧桿菌利用,卻不會(huì)被腐敗細(xì)菌利用,可大大減少腸道有害毒素的產(chǎn)生,對(duì)預(yù)防便秘和腹瀉有很重要的作用[12]。與其他熟知的功能性低聚糖(如低聚果糖和低聚異麥芽糖)相比,低聚半乳糖是唯一能夠被人體全部腸道益生菌利用的益生元。并且,低聚半乳糖具有輕微甜味,是蔗糖甜味的30%～60%。轉(zhuǎn)半乳糖化是β-半乳糖苷酶的固有性質(zhì),在乳糖水解過程中會(huì)形成低聚糖。將乳糖的半乳糖部分轉(zhuǎn)移到含有羥基的受體分子中,可產(chǎn)生具有不同聚合度和不同糖苷鍵的低聚糖。合成低聚半乳糖有以下3個(gè)步驟:1)釋放葡萄糖殘基,剩下的酶與半乳糖基殘基復(fù)合體以進(jìn)一步反應(yīng);2)將該復(fù)合體轉(zhuǎn)移到含有羥基的受體中,溶液中低濃度的乳糖會(huì)刺激水分子充當(dāng)受體并產(chǎn)生半乳糖;3)含有高濃度乳糖溶液中的乳糖作為受體,并與該復(fù)合物結(jié)合,最終產(chǎn)生低聚半乳糖[13](圖1-b)。生產(chǎn)低聚半乳糖的商業(yè)化β-半乳糖苷酶來自于乳酸克魯維酵母、環(huán)狀芽孢桿菌、兩岐雙歧桿菌、米曲霉、嗜熱鏈球菌等[14]。RABIU等[15]在各種雙歧桿菌(如角雙歧桿菌、兩雙歧桿菌BB-12、青年雙歧桿菌ANB-7、嬰兒雙歧桿菌DSM-20088、假長(zhǎng)雙歧桿菌DSM-20099)的純培養(yǎng)物中提取β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖。PANESAR等[16]研究了對(duì)底物配比、乳糖初始濃度、溫度等因素對(duì)β-半乳糖苷酶催化乳糖轉(zhuǎn)半乳糖化生成低聚半乳糖的影響。但β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性低,并且由于同時(shí)存在底物水解反應(yīng),導(dǎo)致產(chǎn)物往往包括多樣化糖苷聚合度及糖苷鍵構(gòu)成類型,并最終限制了低聚半乳糖合成量和純度。

a-水解乳糖;b-合成低聚半乳糖圖1 β-半乳糖苷酶催化水解乳糖和合成低聚半乳糖的機(jī)理Fig.1 Mechanisms of β-galactosidase catalyzed hydrolysis of lactose and synthesis of galactooligosaccharide

2 適冷β-半乳糖苷酶

2.1 適冷β-半乳糖苷酶的來源及特性

酶的催化活性及穩(wěn)定性受溫度的明顯影響。根據(jù)溫度對(duì)酶的活性及穩(wěn)定性的影響,將酶分成適冷酶、中溫酶和高溫酶。適冷酶是一類在低溫(一般在0～30 ℃)條件下具有高催化活性的酶,并且可降低結(jié)合過程中酶的變構(gòu)作用和催化底物變化所需要的活化能,因此,適冷酶在低溫時(shí)需要較少的能量就能完成催化過程。適冷酶的最適反應(yīng)溫度與嗜溫酶相比要低20～30 ℃。目前,適冷β-半乳糖苷酶主要從適冷微生物中分離得到,這些微生物從極地、深海、高山地區(qū)等地方篩選,如節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、動(dòng)物球菌屬(Planococcus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、副球菌屬(Paracoccus)、噬鹽古細(xì)菌(Halorubrumlacusprofundi)[17-20],其酶學(xué)性質(zhì)如表1所示。除了來自Arthrobactersp.C2-2的β-半乳糖苷酶具有六聚體結(jié)構(gòu)、來自副球菌屬32 d的具有二聚體以外,適冷β-半乳糖苷酶一般都屬于GH2家族,具有四聚體結(jié)構(gòu)[17,19,30]。有些適冷微生物含有2種或多種編碼β-半乳糖苷酶的基因,屬于不同的家族。比如,節(jié)桿菌屬含有2種β-半乳糖苷酶,分別屬于GH2和GH42家族;適冷桿菌(Cryobacteriumsp.LW097)含有4種β-半乳糖苷酶,其中1種屬于GH35、3種屬于GH42[29]。這些適冷性β-半乳糖苷酶的篩選,主要通過含有X-gal的培養(yǎng)基來進(jìn)行篩選,β-半乳糖苷酶可以分解X-gal形成藍(lán)色化合物。根據(jù)不同微生物選擇不同培養(yǎng)基,如YPD培養(yǎng)基中或者乳清培養(yǎng)基加入X-gal[34-35]。

表1 不同微生物來源適冷β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Enzymatic characteristics of β-galactosidase from different microorganisms

除了從天然適冷菌中分離出適冷性β-半乳糖苷酶,可以通過DNA重組技術(shù)和基因突變的技術(shù)獲得具有適冷性能的β-半乳糖苷酶。CIELISKI等[36]在大腸桿菌中表達(dá)了來自擬交替單胞菌(Pseudoalteromonas) 22b的β-半乳糖苷酶,觀察到90%的牛奶乳糖在30 ℃下約6 h和15 ℃下28 h內(nèi)被水解[36]。來自伊氏堿性乳桿菌(Alkalilactibacillusikkense)的低溫β-半乳糖苷酶,該重組酶在0 ℃時(shí)活性能夠保持60%,在10 ℃或更低溫度下穩(wěn)定100 h以上[37]。此外,在冷休克蛋白(cspD2)基因啟動(dòng)子的控制下,從鹽藍(lán)菌(Halorubrumlacusprofundi)中擴(kuò)增并克隆了嗜極 β-半乳糖苷酶基因,并在鹽紅菌(Halorubrumsp.NRC-1)中表達(dá),表達(dá)量提高20倍,經(jīng)純化后在4 ℃條件下能夠保持10%的酶活性[20]。NIE等[34]在畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)了皺紋乳桿菌(LactobacilluscrispatusB470)的異二聚體β-半乳糖苷酶,并對(duì)重組β-半乳糖苷酶進(jìn)行了純化,也在20～30 ℃下保持20%的活性。從節(jié)桿菌(Alteromonassp.ML117)分離的β-半乳糖苷酶在大腸桿菌中的表達(dá),在10 ℃條件下24 h內(nèi)能夠降解牛奶中86%的乳糖[38]。來自海洋交替單胞菌(Alteromonassp.QD01)的β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí),金屬離子促進(jìn)了β-半乳糖苷酶的活性。該酶的最適 pH 值和溫度分別為 8.0 和 40 ℃,30 ℃時(shí)維持60%的酶活性[39]。WANG等[40]構(gòu)建了一個(gè)土壤宏基因組文庫,并成功分離到一個(gè)新的 β-半乳糖苷酶基因,并在畢赤酵母中表達(dá)和純化,純化后的酶在 38 ℃和pH=7.0 時(shí)表現(xiàn)出最高的酶活性,并在 0 ℃ 條件下可維持11%的活性,被認(rèn)為是適冷β-半乳糖苷酶。

乳酸菌是多種發(fā)酵食品的發(fā)酵劑。目前,關(guān)于乳酸菌中適冷β-半乳糖苷酶的研究極少,只有羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)L461和L103[41]。因此,通過基因突變或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化提高β-半乳糖苷酶的耐冷性也是一個(gè)新的研究方向。

2.2 適冷β-半乳糖苷酶的適冷機(jī)制

目前,研究已報(bào)道關(guān)于適冷酶結(jié)構(gòu)的一些變化:如酶分子具有更大的柔韌性和較小的功能域;減少了亞基表面之間的相互作用并增加了暴露于溶劑中的疏水殘基的數(shù)量;酶的活性中心更容易接近底物,且酶與底物的親和力更大等[42]。與中溫酶、高溫酶相比,適冷酶的催化腔中所有反應(yīng)側(cè)鏈的序列都具有高度保守型,這表明酶的催化機(jī)制并沒有發(fā)生改變。但是,與同種酶的中溫酶和高溫酶相比,適冷酶的一級(jí)序列和高級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異,如甘氨酸含量增加,脯氨酸和精氨酸含量減少,鹽橋、芳香環(huán)相互作用和疏水作用減弱;分子間、亞基間以及結(jié)構(gòu)域間的相互作用減弱;與溶液間的相互作用增強(qiáng);環(huán)狀結(jié)構(gòu)增加,使蛋白質(zhì)分子具有較高的柔韌性和較低的熱穩(wěn)定性[43]。酶活性位點(diǎn)的親和性改變也是適冷酶的一種特點(diǎn),具有大的、開放式的催化裂口[44]。雖然適冷酶的親和機(jī)理尚未清楚,但一些研究表明,適冷酶可在低能量消耗狀態(tài)下與底物親和,酶的構(gòu)象改變。因此,適冷酶分子的整體結(jié)構(gòu)變化對(duì)適冷酶在低溫下的催化效果起到重要作用。

一般情況下,溫度降低10 ℃,酶的反應(yīng)速度會(huì)降低2～3倍。研究表明,與中溫和高溫酶相比,適冷酶可以降低反應(yīng)活化能,在低溫下的催化速率(kcat)增加,其Km有所下降。然而,一般適冷酶在低溫下的活性提高是通過優(yōu)化Km值來實(shí)現(xiàn),其通過改變蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)增加蛋白質(zhì)的柔韌性。MANGIAGALLI等[45]通過減弱鹽橋、芳香環(huán)相互作用和疏水作用及降低金屬結(jié)合親和力的方法提高適冷酶的活性。適冷酶與中溫和高溫酶相比,在低溫下具有較高的比活力和較低的最適催化溫度(Topt,20～45 ℃)。雖然有些適冷酶的Topt與嗜熱酶同系物沒有差別[46]。尤其是,適冷酶的失活溫度低于蛋白質(zhì)的變性溫度(Tm),這表明酶的活性中心比整體結(jié)構(gòu)更不耐熱[47]。然而,中溫和高溫酶的失活溫度與蛋白質(zhì)變性溫度相同(Topt=Tm)。此外,與中溫酶和高溫酶相比,適冷酶具有較低的熱穩(wěn)定性。FELLER[48]測(cè)定來自適冷、中溫和高溫微生物的α-淀粉酶分別在50 ℃下完全失活的時(shí)間,其中適冷酶60 min后完全失去活性,而中溫和高溫酶100 min后還保持60%和90%的活性。

適冷酶與中溫酶同系物之間的特性比較如圖2所示。

a-最適反應(yīng)溫度;b-熱穩(wěn)定性;c-蛋白質(zhì)在折疊/伸展轉(zhuǎn)變的 差示掃描量熱法圖譜;d-圓二色光譜或熒光光譜法圖2 適冷酶與中溫酶同系物的特性分析Fig.2 Characteristic analysis of a homologue of cold-adaptive enzyme and mesophilic enzyme

圖2-a比較了適冷酶和中溫酶的最適反應(yīng)溫度,表示適冷酶在低溫下更活躍,適冷酶的最適溫度在20～45 ℃,而中溫酶在50～60 ℃。圖2-b比較了特定溫度下的酶的熱穩(wěn)定性,適冷酶的熱穩(wěn)定性低,在Topt溫度下,酶活性能維持90 min左右。相比之下,中溫酶和高溫酶在相同溫度下可維持更長(zhǎng)時(shí)間。圖2-c和2-d用差示掃描量熱法和圓二色光譜或熒光光譜法測(cè)定了蛋白質(zhì)在折疊/伸展轉(zhuǎn)變時(shí)的熱量。適冷酶具有較低的Tm值、量熱焓(ΔHcal)[49]。

3 適冷β-半乳糖苷酶的優(yōu)點(diǎn)及工業(yè)化應(yīng)用

在食品生產(chǎn)中利用適冷酶的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠保護(hù)耐冷性生物活性成分。適冷β-半乳糖苷酶主要用于乳糖的水解和低聚糖的生產(chǎn)。β-半乳糖苷酶主要用來治療乳糖不耐受癥,處理加工牛乳、乳清,生產(chǎn)低乳糖牛奶和乳制品。

3.1 適冷β-半乳糖苷酶在低乳糖和無乳糖乳制品工業(yè)中的應(yīng)用

β-半乳糖苷酶被廣泛用于生產(chǎn)無乳糖乳制品,是專門為消化系統(tǒng)中缺乏β-半乳糖苷酶的乳糖不耐受患者設(shè)計(jì)的。此外,β-半乳糖苷酶用于冰淇淋和煉乳生產(chǎn),以避免乳糖結(jié)晶,并提高這些產(chǎn)品的甜度和奶油味[3]。無乳糖牛奶是在牛奶儲(chǔ)存期間(分批過程)或在超高溫處理(無菌過程)之后添加可溶性β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的(圖3)。在無乳糖乳制品生產(chǎn)工業(yè)中,理想化的β-半乳糖苷酶在4～8 ℃具有較高的酶活性,且能夠耐受Na+、Ca2+、葡萄糖的抑制[50]。目前,用于低溫水解乳糖的適冷β-半乳糖苷酶來自于交替單胞菌屬、低溫桿菌、路氏腸桿菌(Enterobacterludwigii)、歐文氏菌屬微生物(Erwiniaamylovora)等[51]。含有適冷β-半乳糖苷酶的菌株可以在低于30 ℃的溫度下以乳糖作為唯一碳源生長(zhǎng),如假交替單胞菌DFR1和DFR6可以在添加1%乳糖的營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng),因此特性該菌株也被應(yīng)用于大規(guī)模水解乳糖[6]。WIERZBICKA-WOS等[31]從副球菌屬32 d中分離出來的適冷β-半乳糖苷酶,也適用于在冷藏溫度下水解牛奶中的乳糖。FAN等[18]將來自耐冷菌拉恩氏菌屬R3的編碼適冷β-半乳糖苷酶的基因在大腸桿菌中表達(dá),發(fā)現(xiàn)該酶在4 ℃下也具有高活性,可分解冷藏牛奶中的乳糖,并在巴氏殺菌時(shí)失活,最大限度保存牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分。適冷β-半乳糖苷酶在低溫下可水解牛奶中的乳糖保持原有味道,也提高對(duì)乳糖不耐癥人群的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外,適冷β-半乳糖苷酶乳糖水解能力高,可縮短水解時(shí)間,也可以減少細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此,在較低溫度和較大pH范圍下具有高活性的耐冷β-半乳糖苷酶,對(duì)于降低成本、節(jié)約能源,具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 適冷β-半乳糖苷酶在奶酪乳清乳糖分解中的應(yīng)用

奶酪乳清是奶酪制作過程的主要副產(chǎn)品之一。乳清是酪蛋白凝聚和凝乳分離后得到的液體相,含有乳糖、蛋白質(zhì)、脂類和礦物鹽。乳清在生產(chǎn)中常常被當(dāng)做廢液直接排放,不僅浪費(fèi)資源,而且污染環(huán)境。乳清可作為微生物發(fā)酵或化學(xué)修飾生產(chǎn)高價(jià)值化合物的乳糖來源。在此情況下,先用β-半乳糖苷酶進(jìn)行預(yù)處理,以獲得葡萄糖和半乳糖,更適合作為微生物生長(zhǎng)的底物(圖3)。但目前利用適冷β-半乳糖苷酶水解乳清的研究極少,來自擬交替單胞菌的適冷β-半乳糖苷酶水解乳清中的乳糖生產(chǎn)低熱量天然甜味劑——D-塔格糖。在此過程中,乳糖在23 ℃下進(jìn)行水解,不需要額外的進(jìn)行冷卻或加熱工藝[22]。

圖3 適冷β-半乳糖苷酶在低乳糖或無乳糖牛奶和 奶酪乳清中分解乳糖的應(yīng)用Fig.3 Application of cold-adapted β-galactosidase in lactose hydrolysis of low-lactose or non-lactose milk and cheese whey

3.3 適冷β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖合成中的應(yīng)用

低聚半乳糖是一種益生元,可以促進(jìn)有益的腸道細(xì)菌(如乳桿菌或雙歧桿菌)的生長(zhǎng),抑制病原菌在胃腸道中的定殖。并且,在化妝品和食品工業(yè)中分別用作添加劑和甜味劑。來自南極細(xì)菌Alteromonassp., 南極節(jié)桿菌屬的適冷β-半乳糖苷酶可應(yīng)用于低聚半乳糖的合成[52-53]。此外,可利用來自節(jié)桿菌屬的適冷β-半乳糖苷酶合成各種寡糖,如乳果糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖[53]。

4 展望

目前,對(duì)β-半乳糖苷酶的特性分析研究較多,也廣泛應(yīng)用于乳糖的水解和低聚半乳糖的合成。具有較高β-半乳糖苷酶活性的菌株有利于提高食品中乳糖的水解率,減少乳糖不耐受的影響,合成低聚半乳糖刺激人體小腸中有益細(xì)菌的增殖。由于實(shí)際乳制品生產(chǎn)操作在低溫下進(jìn)行,在低溫下具有較高酶活性的適冷β-半乳糖苷酶的研究和應(yīng)用也越來越多。然而,適冷β-半乳糖苷酶研究不夠成熟。目前,適冷β-半乳糖苷酶主要從極地、深海、高山地區(qū)等地方篩選出的適冷微生物中分離得到。與同種酶的中溫酶和高溫酶相比,分析它們的結(jié)構(gòu)特征推理耐冷機(jī)制,可將其小規(guī)模的應(yīng)用到乳糖、乳清的水解和低聚半乳糖合成中。對(duì)適冷β-半乳糖苷酶,從以下幾點(diǎn)進(jìn)行深入研究:1)挖掘更多的適冷β-半乳糖苷酶的微生物菌株。乳酸菌是各種乳制品中的主要微生物,可作為適冷β-半乳糖苷酶的主要微生物。可通過將耐冷微生物的β-半乳糖苷酶基因?qū)氲饺樗峋?獲得帶有適冷β-半乳糖苷酶的乳酸菌,應(yīng)用到發(fā)酵食品中。也可通過對(duì)乳酸菌中的β-半乳糖苷酶基因或氨基酸序列進(jìn)行突變或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化提高其耐冷性。2)通過分子技術(shù)提高適冷β-半乳糖苷酶在低溫下的活性及熱穩(wěn)定性研究。體外蛋白質(zhì)定向改造是獲得適冷酶的一種新型方法。LAYE等[54]最新研究對(duì)南極耐鹽性β-半乳糖苷酶的幾個(gè)氨基酸進(jìn)行突變,改變蛋白質(zhì)的水合層提高耐冷性。研究顯示,很多與耐冷性有關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性尚未發(fā)現(xiàn),需要不斷研究耐冷蛋白質(zhì)及其機(jī)制進(jìn)行研究。3)擴(kuò)大適冷β-半乳糖苷酶的應(yīng)用范圍。適冷β-半乳糖苷酶可應(yīng)用于煉乳、酸奶等乳制品加工中。在煉乳加工過程中,水解乳糖使得濃縮時(shí)避免結(jié)晶,產(chǎn)品更細(xì)膩、減少蔗糖用量。制造低乳糖酸奶,可加速和提高發(fā)酵效率,使酸奶具有獨(dú)特的風(fēng)味。