趙玥琪,徐銘陽,郝婧瑋,許麗穎,劉斗南

( 1.牡丹江師范學院生命科學與技術(shù)學院,黑龍江 牡丹江 157011;2.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,長春 130000;3.牡丹江師范學院化學化工學院,黑龍江 牡丹江 157011)

龍葵(SolanumnigrumL.),茄科一年生草本植物,漿果、葉子可食用。全株皆可入藥,散瘀消腫、利尿降壓、清熱解毒、祛痰止咳等作用[1-2]。龍葵中含有多種生物活性成分,因其抗腫瘤作用日益成為研究熱點[3-4]。研究表明,具抗腫瘤作用的主要活性成分為龍葵中的甾體生物堿,包括澳洲茄堿、澳洲茄邊堿、β-澳洲茄邊堿等[5-7]。實驗證明,澳洲茄堿、澳洲茄邊堿在體外抗腫瘤過程中可有效抑制腫瘤細胞的增殖和生長[8-10]。澳洲茄堿、澳洲茄邊堿有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式[11],經(jīng)加酸處理可將結(jié)合態(tài)澳洲茄堿、澳洲茄邊堿水解出來[12],但龍葵莖葉中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的酸水解工藝未見報導。利用超聲波輔助提取法提取龍葵莖葉中的澳洲茄堿、澳洲茄邊堿,考察提取時間、料液比、乙醇濃度,酸水解條件對龍葵莖葉中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿提取率的影響,優(yōu)化其提取條件,以期提高龍葵莖葉的利用率,為進一步開發(fā)龍葵資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥材。龍葵莖葉(牡丹江地區(qū)野生資源,經(jīng)實驗室鑒定為茄科茄屬龍葵)。采收時間:2022年9月。

1.1.2 實驗儀器。鼓風干燥箱(上海-恒科學儀器有限公司,DHG-9140A);電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司,FA2304);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,KQ-400DB);電熱恒溫水浴鍋(上海-恒科技有限公司,HWS28型);高效液相色譜(waters公司,2695)。

1.1.3 實驗試劑。澳洲茄堿、澳洲茄邊堿標準品,純度≥98%(成都普菲德生物技術(shù)有限公司);無水乙醇、鹽酸、硫酸、甲醇,均為分析純,乙腈為色譜純;水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍葵莖葉干燥。龍葵莖葉部分置于背陰處自然風干5～7 d后,放入鼓風干燥箱,溫度設(shè)定為50 ℃,烘干至恒重,粉碎機粉碎密封于背光處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取時間考察。稱取干重5.0 g樣品,80%乙醇,料液比1∶20,溫度40 ℃,分別超聲波震蕩10、20、30、40、50、60、70 min。

1.2.3 料液比考察。稱取干重5.0 g樣品,80%乙醇、溫度40 ℃、提取時間40 min,料液比分別設(shè)置為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶40,進行超聲波輔助提取。

1.2.4 乙醇濃度考察。稱取干重5.0 g樣品,料液比1∶20、溫度40 ℃、提取時間40 min,乙醇濃度分別為:10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。

1.2.5 最優(yōu)單因素條件下提取率考察。以單因素實驗結(jié)果為依據(jù),設(shè)定提取條件。

1.2.6 酸水解考察。稱取干重5.0 g樣品,溫度80 ℃,配置5%鹽酸乙醇溶液、10%鹽酸乙醇溶液、20%鹽酸乙醇溶液作為提取溶劑。其余條件參考乙醇提取單因素實驗結(jié)果;稱取干重5.0 g樣品,溫度80 ℃,配置2.5%硫酸乙醇溶液、5%硫酸乙醇溶液、10%硫酸乙醇溶液作為提取溶劑。其余條件參考乙醇提取單因素實驗結(jié)果。

1.2.7 實驗處理。將1.2.2、1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6實驗所得提取液各取1 mL,經(jīng)離心機離心取上清液。采用HPLC含量測定法,測定澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量。色譜條件為,色譜柱:Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相:乙腈-2 mmol/L 磷酸鈉水溶液(39∶61);流速:1.0 mL/min;進樣量20 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長203 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量的影響

2.1.1 澳洲茄堿標準曲線建立。以峰面積為縱坐標,澳洲茄堿濃度為橫坐標,雙方的線性回歸方程為:y= 7×107x-872038,相關(guān)系數(shù)R2= 0.9997,說明澳洲茄堿標準品在0.1～2.0 mg/mL范圍內(nèi),峰面積與澳洲茄堿濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如圖1所示。

圖1 澳洲茄堿標準曲線

2.1.2 澳洲茄邊堿標準曲線建立。以峰面積為縱坐標,澳洲茄邊堿濃度為橫坐標,雙方的線性回歸方程為:y=7×105x-232112,相關(guān)系數(shù)R2= 0.9999,說明澳洲茄邊堿標準品在0.1～2.0 mg/mL范圍內(nèi),峰面積與澳洲茄邊堿濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如圖2所示。

圖2 澳洲茄邊堿標準曲線

2.1.3 提取時間對提取率的影響。由圖3所示,在料液比1∶20、溫度40 ℃、80%乙醇提取條件下,提取率隨時間增加呈先升高后下降趨勢,在60 min達到最高,分別為澳洲茄堿0.221%、澳洲茄邊堿0.131%,故最優(yōu)提取時間為60 min。

圖3 提取時間對提取率的影響

2.1.4 提取料液比對提取率的影響。由圖4所示,在提取溫度40 ℃、提取時間40 min、80%乙醇提取條件下,提取率隨料液比減小呈現(xiàn)先升高后下降趨勢,料液比1∶20時,提取率達到最高,分別為澳洲茄堿0.227%、澳洲茄邊堿0.138%,故最優(yōu)料液比為1∶20。

圖4 料液比對提取率的影響

2.1.5 乙醇溶液濃度對提取率的影響。由圖5所示,在料液比1∶20、溫度40 ℃、時間40 min提取條件下,提取率隨增加乙醇溶液濃度增加呈先升高后下降趨勢,乙醇濃度為80%時,提取率達到最高,分別為澳洲茄堿0.224%、澳洲茄邊堿0.136%,故最優(yōu)乙醇溶液濃度為80%。

圖5 乙醇溶液濃度對提取率的影響

2.1.6 最優(yōu)單因素條件下提取率。在80%乙醇、提取時間60 min、提取溫度40 ℃、料液比1∶20提取條件下,龍葵莖葉中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的含量分別為0.229%、0.141%。

2.1.7 酸水解對提取率的影響。如圖6和圖7所示,隨著水解酸濃度的增加,提取率呈上升趨勢。結(jié)果顯示,在酸水解作用下,澳洲茄堿、澳洲其邊堿提取率均有所提高。在所設(shè)定條件范圍內(nèi),料液比1∶20、提取時間60 min、溫度80 ℃、10%硫酸乙醇溶液為提取溶劑時,澳洲茄堿、澳洲茄邊堿提取率最高,分別為0.275%、0.168%。

圖6 硫酸水解對提取率的影響

圖7 鹽酸水解對提取率的影響

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明,采用超聲波輔助提取法,優(yōu)化提取條件可有效提高龍葵莖葉中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的提取率。

以乙醇作為提取溶液,控制溫度40 ℃,防止溫度過高至乙醇揮發(fā),影響提取效果。通過單因素實驗考察,獲得最佳提取條件:乙醇濃度80%、提取時間60 min、提取溫度40 ℃、料液比1∶20,龍葵莖葉中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的含量分別為0.229%、0.141%,證實提取工藝穩(wěn)定、可靠。

實驗首次采用酸水解法優(yōu)化提取工藝。加熱反應有利于促進酸水解反應的進行,并縮短反應時間,故實驗選擇80 ℃為提取溫度。在料液比1∶20、提取時間60 min、提取溫度80 ℃條件下,以10%硫酸乙醇作為提取溶液,澳洲茄堿與澳洲茄邊堿提取率分別為0.275%、0.168%。與乙醇提取相比,提取率分別提高1.2倍、1.19倍。實驗證明,在酸水解作用下,可使結(jié)合態(tài)澳洲茄堿、澳洲茄邊堿中糖苷鍵斷裂,轉(zhuǎn)化為游離態(tài),進而有效提高龍葵莖葉中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的提取率。超聲輔助酸水解提取條件有待進一步優(yōu)化。