陳希瑞 張超杰 張 偉 陳靠山

（1.山東大學(xué)生命科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；2.山東博德醫(yī)藥研究院有限公司，山東 德州 253084）

牛蒡（Arctium lappaL.），作為菊科牛蒡?qū)僦备刀晟笮筒荼局参铮r嫩多汁、營養(yǎng)豐富［1］；既是食材，也被作為中藥用于治療疾?。?］。牛蒡菊糖灌胃可使酒精損傷小鼠的肝臟質(zhì)量、肝指數(shù)顯著降低［3］；牛蒡根中水溶性膳食纖維菊糖、綠原酸等組分也具有較強(qiáng)的抗氧化活性［4］；相關(guān)研究［5］表明，以果蠅為動(dòng)物模型進(jìn)行的動(dòng)物生存實(shí)驗(yàn)，牛蒡根可以在一定程度上延緩衰老；牛蒡葉多糖通過清除DPPH 自由基，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較明顯的抑制作用［6］。由此可見，無論從細(xì)胞水平還是動(dòng)物水平，從牛蒡根部獲得的化合物都有很重要的研究價(jià)值。

多糖由單糖以糖苷鍵連接而成［7］。人類皮膚中的黏多糖主要包括透明質(zhì)酸（HA）、硫酸軟骨素和肝素等。其中大部分多糖通過發(fā)揮各自的生物學(xué)功能來影響細(xì)胞的生命活動(dòng)，如機(jī)體免疫能力的提高，機(jī)體抗衰老能力的提高，抵抗腫瘤、病毒能力的改善和凝血功能的改善等［8］。另外，由于多糖本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)為多羥基，從而使得多糖具備很強(qiáng)的吸水性、乳化性、高黏度等特性，并且這些特性正是化妝品保濕原料所需要的。隨著大眾消費(fèi)觀念的改善，普眾對(duì)護(hù)膚的層次要求越來越高，因此就要求化妝品的品質(zhì)有相應(yīng)的提高，所以具備天然、有效、安全特性的護(hù)膚品越來越受到大眾的矚目。因此，從動(dòng)植物中提取天然組分，作為保濕劑應(yīng)用于化妝品，成為保濕化妝品的發(fā)展趨勢(shì)。本研究中的牛蒡根低聚菊糖，根據(jù)前期郝林華等［9］的研究成果表明是由糖苷鍵相連，由葡萄糖和果糖鏈接形成的聚合度為13的低聚果糖。作為天然多糖，牛蒡多糖易溶于水、無毒副作用，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、生物醫(yī)用材料等健康領(lǐng)域。本文主要研究牛蒡多糖的保濕效果及相關(guān)的作用機(jī)制，為其在化妝品領(lǐng)域的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料SPF 級(jí)健康SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（170±10）g，許可證號(hào)：SCK（魯）2017-003；普通豚鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±30）g，合格證編號(hào)：SCXK（魯）-2017-0010；KC 人表皮細(xì)胞、KC Growth 培養(yǎng)基、人透明質(zhì)酸ELISA試劑盒（廣東博溪生物科技有限公司）；膠原蛋白1試劑盒、水通道蛋白3（AQP3）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；2，4-二硝基氯苯、HA、透明質(zhì)酸酶（HAase）、對(duì)二甲氨基苯甲酸、乙酰丙酮、醋酸緩沖液［福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司］；MULTISKAN GO型酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）、CO2培養(yǎng)箱［日本三洋（SANYO）公司］、超凈工作臺(tái)［蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司］、倒置顯微鏡［尼康儀器（上海）有限公司］。

1.2 研究方法

1.2.1 牛蒡多糖的制備參照郝林華等［9］的制備方法，獲得牛蒡多糖。

1.2.2 牛蒡多糖對(duì)豚鼠皮膚致敏性研究豚鼠適應(yīng)性培養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為3 組，每組12 只，雌雄各半，分別為空白對(duì)照組（無菌水）、陽性對(duì)照組（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的2，4-二硝基氯苯）、牛蒡多糖組（1%牛蒡多糖）。實(shí)驗(yàn)前24 h，豚鼠背部脊柱2 側(cè)的毛去掉，不能損傷皮膚，去毛范圍左右各1.5 cm×1.5 cm，取受試藥物0.5 g，直接涂抹在1 cm×1 cm大小的1側(cè)皮膚上，樣品不得損失。另外一側(cè)作為空白對(duì)照，每天1次，連續(xù)涂抹14 d。從第2天開始，每次涂抹前剪毛，用水清除殘留受試藥物，1 h后觀察并記錄涂抹部位有無紅斑和水腫等情況，并按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》［10］中的“皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分”表進(jìn)行評(píng)分。見表1。

表1 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分表

1.2.3 牛蒡多糖對(duì)大鼠皮膚HA含量的影響實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置空白對(duì)照組KC Growth培養(yǎng)液接種細(xì)胞（BC）、陰性對(duì)照組0.2%十二烷基硫酸鈉（SLS）+KC Growth 培養(yǎng)液接種細(xì)胞（NC）、陽性對(duì)照組0.2%SLS+PPARα激活劑（WY14625）+KC Growth 培養(yǎng)液接種細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組0.2%SLS+牛蒡多糖液（1.5%）接種細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按照細(xì)胞密度1×104個(gè)/孔接種至96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞離心取上清液，用于HA 檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說明書。

1.2.4 牛蒡多糖對(duì)大鼠皮膚水含量影響實(shí)驗(yàn)將適應(yīng)性培養(yǎng)7 d 的SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組（HA 組）、實(shí)驗(yàn)組（牛蒡多糖組）3 組，每組12 只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前24 h，去掉大鼠背部脊柱兩側(cè)的毛，不能損傷皮膚，去毛范圍左右各1.5 cm×1.5 cm，取受試藥物0.5 g，直接涂抹在1 cm×1 cm 大小的一側(cè)皮膚上，樣品不得損失。另外一側(cè)作為空白對(duì)照，每天1 次，連續(xù)涂抹14 d?？瞻捉M無菌水清潔背部兩側(cè)的無毛區(qū)域，約為1 cm×1 cm，清洗干凈后不做任何處理；對(duì)照組用等劑量濃度的HA樣品溶液，實(shí)驗(yàn)組給予等劑量濃度牛蒡多糖樣品溶液。每天涂抹1 次，連續(xù)涂抹7 d；涂抹完成后麻醉大鼠并且對(duì)實(shí)驗(yàn)皮膚進(jìn)行取材。單一的一側(cè)皮膚保存于液氮中，以備AQP3、膠原蛋白1的測(cè)定；另外一側(cè)的皮膚清除脂肪稱重，然后平展于載玻片上，溫度設(shè)置80 ℃，烘箱中干燥。干燥12 h后稱重。皮膚含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行分析，測(cè)定數(shù)據(jù)以（±s）表示，行t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡多糖對(duì)豚鼠皮膚致敏性研究本實(shí)驗(yàn)中2，4-二硝基氯代苯作為陽性對(duì)照，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的致敏性；而空白對(duì)照組及牛蒡多糖組的豚鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中皮膚于肉眼觀察不到明顯變化，像痘印、紅斑、水腫等不良反應(yīng)均未出現(xiàn)；同時(shí)，豚鼠呼吸平穩(wěn)、四肢有力，對(duì)其他豚鼠未表現(xiàn)出攻擊性。因此，我們得出結(jié)論牛蒡多糖對(duì)豚鼠皮膚無刺激性，致敏性為零，未見到明顯的皮膚變態(tài)反應(yīng)。見表2。

表2 3組豚鼠皮膚過敏性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（分）

2.2 牛蒡多糖對(duì)大鼠皮膚HA 含量的影響實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為縱坐標(biāo)，OD 值（OD450）為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-349.15x+446.53（R2=0.9743）。根據(jù)樣本的OD450值，可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)，得出樣品實(shí)際濃度。由此細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們得出牛蒡多糖液在一定濃度范圍時(shí)可以促進(jìn)人角質(zhì)形成HA。而HA 作為一種酸性黏多糖，是肌膚水嫩的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，具有特殊的保水作用，是最為理想的天然保濕因子。所以，我們得出結(jié)論牛蒡多糖也可以通過提高皮膚HA的含量來維持皮膚含水量。見表3。

表3 牛蒡多糖對(duì)3組大鼠皮膚HA含量的影響實(shí)驗(yàn)（±s，μg/g）

表3 牛蒡多糖對(duì)3組大鼠皮膚HA含量的影響實(shí)驗(yàn)（±s，μg/g）

HA含量142.13±3.12 205.29±5.341）179.78±2.961）組別空白組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組鼠數(shù)12 12 12

2.3 牛蒡多糖對(duì)大鼠皮膚的保濕性實(shí)驗(yàn)作為一種快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油和尿素等小分子的膜整合蛋白，水通道蛋白在皮膚屏障功能、保持皮膚水分中扮演重要角色。AQP3 作為人體皮膚中含量最高的水通道蛋白亞型，主要位于細(xì)胞的胞漿膜上。膠原蛋白作為皮膚組織的主要蛋白之一，對(duì)維持皮膚彈性起到重要作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，HA 組與牛蒡多糖組皮膚的含水量相對(duì)較高。與空白組相比，HA 組和牛蒡多糖組對(duì)AQP3 的表達(dá)起到負(fù)調(diào)控的作用，可以降低AQP3在皮膚中的表達(dá)。另外，牛蒡多糖組可以提高皮膚膠原蛋白的含量，HA 組的皮膚膠原蛋白1 的含量次之。因此，牛蒡多糖擁有良好的保濕效果，具有較好的保濕化妝品開發(fā)潛力。見表4。

表4 3組大鼠皮膚含水量、AQP3及膠原蛋白1含量（±s）

表4 3組大鼠皮膚含水量、AQP3及膠原蛋白1含量（±s）

組別空白組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組膠原蛋白1/（ng/mL）1021.29±121.12 1123.51±116.591）1249.89±123.461）鼠數(shù)12 12 12皮膚水含水量/%0.55±0.02 0.62±0.011）0.63±0.021）AQP3/（ng/mL）0.31±0.02 0.24±0.021）0.23±0.011）

3 討論

隨著年齡增長，人體逐漸衰老，皮膚的保濕結(jié)構(gòu)不可避免地受到一定程度的損傷，導(dǎo)致皮膚組織細(xì)胞和細(xì)胞間的含水量減少。而水分的丟失導(dǎo)致膠原蛋白硬化［11］，當(dāng)皮膚的角質(zhì)層水分丟失到一定程度時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致皮膚干燥、失去彈性、皺紋增加，從而加快皮膚老化的速度。所以，水分在維持皮膚健康中起著至關(guān)重要的作用，因此，護(hù)膚化妝品所使用的保濕劑是廣大化妝品研發(fā)人員最關(guān)注的課題。作為親水性物質(zhì)，保濕劑分子中都含有大量的親水基團(tuán)，如羥基和羧基等，而甘油、木糖醇、山梨醇等化合物正是因?yàn)檫@種化學(xué)結(jié)構(gòu)成為常用的保濕原料。這類化合物通過自身的結(jié)構(gòu)羥基與水分子結(jié)合，從而使皮膚保持一定的濕度來延緩水分的散失［12］。另外，眾多的研究［13，14］表明牛蒡根水提物可以提高大鼠肝臟和血清中的SOD 活性，提高細(xì)胞的抗氧化能力。由此可以得出結(jié)論，天然提取的多糖作為自然保濕劑，由于自身化學(xué)結(jié)構(gòu)多羥基及其他可同水形成氫鍵的極性基團(tuán)的優(yōu)勢(shì)，可以使自身形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，來減緩水分子的流失。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)牛蒡多糖溶液的失水率及對(duì)大鼠皮膚水含量影響的測(cè)定，確定了牛蒡多糖具有一定的保濕能力，并且隨其濃度的升高，保濕能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明，牛蒡多糖不僅具有較好的皮膚保濕性，并且在一定濃度范圍內(nèi)可以提高皮膚HA 和膠原蛋白的含量，可以改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚的含水量，并且無致敏性，可以作為一種天然安全的化妝品原料。