常晴晴 楊 艷 灑玉萍 廖 曉

（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016）

不同海拔的高原會(huì)對人體造成不同的影響。據(jù)調(diào)查［1］，人體位于1500～1800 m的環(huán)境中時(shí)，會(huì)出現(xiàn)非顯性的生理和病理變化；而位于3000 m 以上的海拔高度時(shí)，人體可明顯感受到缺氧刺激，使細(xì)胞、組織、器官均處于缺氧應(yīng)激狀態(tài)。其中，大腦是對缺氧最為敏感的人體組織器官，其次就是視覺系統(tǒng)。從組織胚胎學(xué)的角度來看，視網(wǎng)膜被視為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延伸，二者的結(jié)構(gòu)有很多相似的部分［2］。在急性缺氧條件下，可出現(xiàn)視盤水腫及視網(wǎng)膜出血；長時(shí)間處于缺氧環(huán)境當(dāng)中，還可致使視網(wǎng)膜進(jìn)一步缺血缺氧，破壞血-視網(wǎng)膜毛細(xì)血管屏障，最終引發(fā)高原視網(wǎng)膜病變（High altitude retinopathy，HAR）［3］。HAR 最早是由Singh［4］提出。研究［5，6］顯示，井穴放血療法可顯著緩解急性高原缺氧所致的海馬損傷以及保護(hù)腦缺血急性期的神經(jīng)細(xì)胞。研究針灸對視網(wǎng)膜急性缺氧后視神經(jīng)影響的分子機(jī)制，是運(yùn)用針灸治療急性缺氧疾病的關(guān)鍵切入點(diǎn)［7，8］。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠高原缺氧模型，并采用井穴放血療法進(jìn)行提前干預(yù)，從而探討其對急性高原缺氧的作用機(jī)制以及對急性高原缺氧大鼠防護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康SD 大鼠36 只，體質(zhì)量（200±20）g，來自西安交通大學(xué)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：scxk（陜）2018-001］，自然飼養(yǎng)2 d，自然照明，自由攝食、飲水。常規(guī)外眼及眼底檢查均正常。將大鼠隨機(jī)分為3 組：常氧對照組4 只、低氧模型組16 只（再分為D6、D24、D48、D72 組，每組4 只）、低氧+井穴放血干預(yù)組16 只（再分為S6、S24、S48、S72 組，每組4 只）。常氧對照組在2260 m 海拔的常氧環(huán)境里喂養(yǎng)（西寧），模型組給予井穴放血預(yù)處理。

1.2 主要試劑及儀器鹽酸（成都市科龍化工試劑廠）、10%水合氯醛（成都市科隆化學(xué)有限公司）和4%多聚甲醛溶液（西安化學(xué)試劑廠），冰冷無菌PBS（上海遠(yuǎn)慕生物），臺(tái)式離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司），封板試劑（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司），蘇木精-伊紅（HE）染色液（G1005，武漢賽維爾生物科技有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低壓氧艙（西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司），酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）。

1.3 干預(yù)方法井穴放血干預(yù)組：一人固定大鼠頭部和尾部，另一人分別點(diǎn)刺大鼠雙側(cè)肢趾端的十二井穴，即手太陰肺經(jīng)井穴少商、手厥陰心包經(jīng)井穴中沖、手少陰心經(jīng)井穴少?zèng)_、手陽明大腸經(jīng)井穴商陽、手少陽三焦經(jīng)井穴關(guān)沖、手太陽小腸經(jīng)井穴少澤，每穴以用毫針點(diǎn)刺出血3～5 滴為度，每日上午定時(shí)治療1 次，左右兩側(cè)交替進(jìn)行，持續(xù)5 d。

低氧模型組與常氧對照組：2組大鼠均予同樣抓取1次，但不給予放血干預(yù)，共5 d。

1.4 造模方法在第6天將低氧模型組與低氧+井穴放血干預(yù)組的大鼠移入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低壓模擬艙內(nèi)以制備急性視網(wǎng)膜缺氧模型，模擬倉內(nèi)海拔7000 m，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，在艙內(nèi)暴露相應(yīng)時(shí)間（6 h、24 h、48 h、72 h）后出艙，根據(jù)大鼠視網(wǎng)膜損傷判定造模成功與否。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法取材：第6 天時(shí)取材常氧對照組、低氧模型組與低氧+井穴放血干預(yù)組大鼠。于相應(yīng)時(shí)間（6 h、24 h、48 h、72 h）出艙后，立即麻醉，隨后取出眼球，去除玻璃體和晶狀體，完整剝離視網(wǎng)膜，最后將視網(wǎng)膜一部分置于-80 ℃低溫保存，用于制作勻漿液；另一部分用4%多聚甲醛溶液固定，用于制作病理切片。

ELISA 法檢測：按照ELISA 檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行操作：（1）解凍、勻漿、離心再保存：解凍視網(wǎng)膜組織，取0.2 g 于試管中，加PBS 緩沖液1.8 mL，制備視網(wǎng)膜組織勻漿液（10%），采用低溫離心機(jī)離心15 min，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心半徑12 cm；（2）稀釋與加樣、溫育、配液、洗滌后靜置：吸取上清液，再次加入PBS 溶液進(jìn)行稀釋，制作成組織勻漿液，濃度為1%，用封板膜封板，恒溫溫育30 min，用蒸餾水稀釋30 倍，取下封板膜，甩干液體后滴上洗滌劑靜置，反復(fù)操作后甩干；（3）加酶、溫育、洗滌、顯色、終止：加入酶標(biāo)試劑，溫育洗滌后加入顯色劑A 和顯色劑B，恒溫箱內(nèi)避光顯色15 min，加終止液 50μL，終止反應(yīng)；（4）測值與計(jì)算：計(jì)算大鼠視網(wǎng)膜組織血清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的含量。

視網(wǎng)膜HE 染色觀察：首先取片、烤片，再進(jìn)行脫蠟、復(fù)水，用蘇木精液染色及1%鹽酸酒精分色，用流水沖洗至返藍(lán)后鏡檢。接著進(jìn)行脫水、透明，用中性樹膠封片，最終觀察結(jié)果并拍片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化比較常氧對照組大鼠視網(wǎng)膜組織未見明顯異常，組織細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)正常，各層結(jié)構(gòu)完整、清晰、厚度均勻，且核仁明顯，無水腫表現(xiàn)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈密集單層排列分布，細(xì)胞核大小形狀不一，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布。

低氧模型6 h 組大鼠視網(wǎng)膜可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞部分輕度水腫，結(jié)構(gòu)欠清楚；而24 h、48 h、72 h的3組中，大鼠視網(wǎng)膜的各層組織水腫，疏松明顯，多見空泡變性，細(xì)胞核減少，結(jié)構(gòu)層次紊亂。

低氧+井穴放血干預(yù)組相較于同時(shí)點(diǎn)低氧模型組，視網(wǎng)膜損傷較輕，但仍有不同程度損傷。見圖1。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化（HE染色）

2.2 3 組大鼠視網(wǎng)膜血清VEGF、HIF-1α 含量比較與常氧對照組比較，低氧模型組大鼠的血清VEGF、HIF-1α 含量明顯增加（P＜0.01）；與同時(shí)點(diǎn)低氧模型組比較，低氧+井穴放血干預(yù)組大鼠血清VEGF、HIF-1α 含量明顯下降（P＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜血清VEGF、HIF-1α含量比較（±s，pg/g）

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜血清VEGF、HIF-1α含量比較（±s，pg/g）

注：與常氧對照組比較，1）P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)低氧模型組比較，2）P＜0.01。

VEGF 1038.40±50.33 2521.40±296.771）2189.06±235.391）1995.53±275.971）2280.02±331.911）2018.06±214.422）1376.64±353.622）903.92±276.042）689.74±224.092）63.598＜0.001組別常氧對照組低氧模型D6組低氧模型D24組低氧模型D48組低氧模型D72組低氧+井穴放血干預(yù)S6組低氧+井穴放血干預(yù)S24組低氧+井穴放血干預(yù)S48組低氧+井穴放血干預(yù)S72組F值P值鼠數(shù)444444444 HIF-1α 357.40±50.33 615.67±60.861）548.56±40.091）562.25±56.511）629.29±55.161）515.09±53.742）458.72±48.182）393.60±46.662）395.75±47.192）44.968＜0.001

3 討論

本研究中視網(wǎng)膜組織病理變化表明，在海拔7000 m的條件下暴露72 h，能夠較好地建立大鼠急性視網(wǎng)膜缺氧損傷模型，同時(shí)顯示低氧+井穴放血干預(yù)組相較于同時(shí)點(diǎn)低氧模型組大鼠急性視網(wǎng)膜缺氧損傷的程度更輕。

《醫(yī)宗金鑒》中載述，針刺商陽能治療中風(fēng)、突發(fā)暈厥、頭暈?zāi)垦?、痰液流涎，少商、關(guān)沖和商陽等井穴能夠促進(jìn)氣血的運(yùn)行，為搶救的關(guān)鍵要點(diǎn)［9］。因井穴系陰陽經(jīng)氣相交之處，針刺此處可達(dá)到通調(diào)十二經(jīng)之氣的效果?；仡櫧甏罅繃鴥?nèi)外關(guān)于針灸治療缺血性腦卒中的研究［10］，發(fā)現(xiàn)針灸可能是通過參與缺血性腦損傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能的修復(fù)與重塑，來達(dá)到治療缺血性腦卒中的目的。視網(wǎng)膜被視作神經(jīng)中樞系統(tǒng)的延伸，對缺氧刺激極為敏感，針灸的放血治療對于缺氧所致的視網(wǎng)膜損傷改善效果明顯［11］。

HIF-1α 是受缺氧調(diào)控的一種轉(zhuǎn)錄因子［12］。有研究［13］在光鏡下觀察各組大鼠的視網(wǎng)膜，發(fā)現(xiàn)缺氧模型組大鼠的視網(wǎng)膜在神經(jīng)感覺層發(fā)生了水腫，以神經(jīng)纖維層為著，此時(shí)大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹且視網(wǎng)膜HIF的表達(dá)顯著增多。本實(shí)驗(yàn)顯示，正常大鼠視網(wǎng)膜血清HIF-1α、VEGF含量較低，而在模擬海拔7000 m的環(huán)境中，大鼠血清HIF-1α、VEGF 含量顯著增加，且HIF-1α 與VEGF 的變化趨勢基本相似，這也表明VEGF 的表達(dá)受到了HIF-1α的調(diào)控。但低氧+井穴放血干預(yù)組與同時(shí)點(diǎn)低氧模型組比較，大鼠的視網(wǎng)膜血清HIF-1α、VEGF含量顯著下降，這提示井穴放血可能通過降低視網(wǎng)膜新生血管中VEGF的表達(dá)來抑制VEGF mRNA、HIF-1α，從而減輕缺氧對視網(wǎng)膜組織造成的損傷，這對急性缺氧所致的視網(wǎng)膜損傷有一定的保護(hù)作用。井穴放血對于視網(wǎng)膜HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)的影響仍有待進(jìn)一步研究［14］。

綜上所述，井穴放血對于急性缺血視網(wǎng)膜組織損傷有明顯的保護(hù)作用，從分子機(jī)制觀察，可能與降低視網(wǎng)膜HIF-1α、VEGF含量有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)研究僅從視網(wǎng)膜血清HIF-1α、VEGF含量的角度研究井穴放血對視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用，且大鼠的樣本量相對偏少，后續(xù)仍需加大樣本數(shù)量，對視網(wǎng)膜HIF-1α、VEGF的基因表達(dá)與調(diào)控及細(xì)胞線粒體機(jī)制等方面進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步闡釋井穴放血治療急性高原缺氧的作用機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。