鐘祥,羅恒真,謝小燕

(江西科睿藥業(yè)有限公司,江西 贛州 341000)

普瑞巴林口服溶液(Lyrica)于2010年1月在FDA批準(zhǔn)上市,其適應(yīng)癥與普瑞巴林膠囊相同,可用于治療焦慮癥、癲癇、神經(jīng)痛和術(shù)后疼痛等,口服溶液批準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)在于其便于難以吞咽膠囊的患者用藥,也便于腎功能損傷及由于腎功能減退可能需要減量的老年患者調(diào)整劑量。FDA審評(píng)報(bào)告中可查詢到普瑞巴林口服溶液的處方中含有普瑞巴林、羥苯甲酯、羥苯丙酯、無(wú)水磷酸氫二鈉、無(wú)水磷酸二氫鈉、三氯蔗糖與人造草莓香精,上述原輔料最終均溶解于純化水中,即成品為水溶液體系,其中普瑞巴林標(biāo)示量質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1。

普瑞巴林化學(xué)名為(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸,含有一個(gè)手性碳原子,其對(duì)映異構(gòu)體(R)-3-氨甲基-5-甲基己酸(R-普瑞巴林,R-PRBL)的活性只有S-異構(gòu)體的十分之一[1],所以需將R-普瑞巴林作為雜質(zhì)進(jìn)行控制,建立分析方法進(jìn)行檢查。目前美國(guó)藥典、歐洲藥典與英國(guó)藥典的普瑞巴林原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均控制R-普瑞巴林含量不得超過普瑞巴林的0.15%,測(cè)定方法均為采用Marfey試劑進(jìn)行柱前衍生化的高效液相色譜法;而相應(yīng)制劑如普瑞巴林膠囊與普瑞巴林口服溶液等,則未把R-普瑞巴林定入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2-4]。為保證制劑的安全性和有效性,開展制劑的對(duì)映異構(gòu)體研究仍是必要的,即對(duì)映異構(gòu)體的含量仍是普瑞巴林口服溶液的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

由于普瑞巴林口服溶液組分復(fù)雜,抑菌劑和香精中的某些組分也會(huì)與Marfey試劑發(fā)生副反應(yīng),采用手性衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化再通過液相分離的方法進(jìn)行檢測(cè),方法的回收率與重現(xiàn)性較差,不滿足檢測(cè)要求;而有學(xué)者采用正相色譜與蒸發(fā)光檢測(cè)器聯(lián)用測(cè)定普瑞巴林的光學(xué)純度的方法也不適用于含水相的普瑞巴林口服溶液[5];最新收載的文獻(xiàn)方法為李晶等發(fā)表在《理化檢驗(yàn)》中的用HPLC-ELSD測(cè)定普瑞巴林原料藥中的R-對(duì)映異構(gòu)體方法[6],該方法采用反相液相與鍵合兩性離子手性固定相的色譜柱進(jìn)行了方法開發(fā)與優(yōu)化,建立了一個(gè)快速、有效、靈敏的方法測(cè)定原料藥中的R-普瑞巴林,把該方法應(yīng)用于普瑞巴林口服溶液的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)不揮發(fā)的輔料峰會(huì)干擾R-普瑞巴林出峰,且流動(dòng)相的背景干擾較大,信噪比不滿足要求,故本文參考該方法結(jié)合口服溶液的特殊性進(jìn)行了方法的優(yōu)化,最終建立了一個(gè)反相高效液相色譜與電霧式檢測(cè)器聯(lián)用(HPLC-CAD)的方法測(cè)定普瑞巴林口服溶液中的R-普瑞巴林,該方法操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、耐用性良好。

圖1為普瑞巴林與R-普瑞巴林結(jié)構(gòu)式。

圖1 普瑞巴林(左)與R-普瑞巴林(右)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)儀器

Waters AUQUITY Arc高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),CAD檢測(cè)器(美國(guó)Thermo公司);XS105DU型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);S220型pH計(jì)(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試驗(yàn)用藥與試劑

甲醇(色譜純,MERCK);乙醇(色譜純,MERCK);醋酸銨(LC/MS純,ACS);醋酸(分析純,廣東光華科技股份有限公司);水為超純水;普瑞巴林對(duì)照品(批號(hào)101106-201902,純度99.7%,中國(guó)食品藥品檢定研究院);R-普瑞巴林對(duì)照品(批號(hào)31225-A3,純度99.9%,上?？凭S化學(xué)技術(shù)有限公司);普瑞巴林口服溶液[批號(hào)20200605,規(guī)格2%(473 mL∶9 460 mg),江西青峰藥業(yè)有限公司];普瑞巴林口服溶液空白輔料溶液(批號(hào)20200606,江西青峰藥業(yè)有限公司)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

流動(dòng)相:0.01 mol/L醋酸銨緩沖液(pH值5.5)-乙醇(20∶80,體積比);色譜柱:CHIRALPAK ZWIX(+),4.0 mm×150 mm,3 μm;柱溫為20 ℃;流速為0.5 mL·min-1;進(jìn)樣體積20 μL;檢測(cè)器蒸發(fā)管溫度為35 ℃。

2.2 溶液的配制

溶劑為純化水。

空白輔料溶液:取本品制劑的空白輔料溶液5 mL至10 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

普瑞巴林定位溶液:取普瑞巴林對(duì)照品約50 mg,精密稱定,置5 mL量瓶中,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

R-普瑞巴林對(duì)照品貯備液:取R-普瑞巴林對(duì)照品約15 mg,精密稱定,置100 mL量瓶中,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

R-普瑞巴林對(duì)照品溶液:精密移取R-普瑞巴林對(duì)照品貯備液1 mL,置10 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液:取普瑞巴林對(duì)照品約100 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,再移入R-普瑞巴林對(duì)照品貯備液1 mL,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

供試品溶液:取普瑞巴林口服溶液5 mL,置10 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

2.3 專屬性

取空白溶劑、空白輔料溶液、普瑞巴林定位溶液、R-普瑞巴林對(duì)照品與系統(tǒng)適用性溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果表明R-普瑞巴林峰與普瑞巴林峰已基線分離,空白溶劑峰與空白輔料峰對(duì)R-普瑞巴林峰均無(wú)干擾,表明方法的專屬性良好,典型色譜圖見圖2。

(a)系統(tǒng)適用性溶液;(b)普瑞巴林定位溶液;(c)空白輔料溶液;(d)空白溶劑圖2 典型色譜圖

2.4 系統(tǒng)適用性

取“系統(tǒng)適用性溶液”按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,考察R-普瑞巴林峰的保留時(shí)間與峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)及分離度。結(jié)果顯示連續(xù)進(jìn)樣6次,R-普瑞巴林峰的保留時(shí)間RSD為0.1%,峰面積RSD為2.5%,分離度均在1.6以上,表明方法連續(xù)進(jìn)樣精密度較好。

2.5 檢測(cè)限

精密移取的“R-普瑞巴林對(duì)照品貯備液”1 mL至50 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,混勻,配制為每1 mL約含R-普瑞巴林3 μg(相對(duì)供試品溶液濃度0.03%)的溶液。

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,得R-普瑞巴林峰的信噪比(S/N)為9.4,滿足大于3的驗(yàn)證要求,表明該方法的最低檢測(cè)限可至供試品溶液濃度的0.03%,相當(dāng)于R-普瑞巴林約60 ng,滿足普瑞巴林口服溶液對(duì)于R-普瑞巴林的檢測(cè)與控制要求。

2.6 精密度

1)實(shí)際樣品檢測(cè):實(shí)驗(yàn)員A和實(shí)驗(yàn)員B分別取樣各平行配制6份供試品溶液,考察測(cè)定所得結(jié)果之間的離散程度(RSD);2)加標(biāo)樣品回收率:實(shí)驗(yàn)員A和實(shí)驗(yàn)員B分別配制6份雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液,考察R-普瑞巴林回收率的離散程度(RSD),結(jié)果見表1。

雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液:取本品5 mL,置10 mL量瓶中,再移入R-普瑞巴林對(duì)照品貯備液1 mL,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 線性與范圍

分別精密移取“R-普瑞巴林對(duì)照品貯備液”適量,用溶劑稀釋至每1 mL含有R-普瑞巴林約3,7.5,12,15,18,22.5 μg的溶液,分別為限度濃度的20%,50%,80%,100%,120%,150%,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。以峰面積對(duì)濃度作回歸處理。結(jié)果表明R-普瑞巴林的質(zhì)量濃度在2.99～22.39 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈線性,相關(guān)系數(shù)為0.999 1,說(shuō)明方法線性較好。

2.8 準(zhǔn)確度

將已知含量的R-普瑞巴林加入普瑞巴林口服溶液中,制成低(限度的50%)、中(限度的100%)、高(限度的120%)三個(gè)濃度,每個(gè)水平三份,按擬定的方法測(cè)定回收率,結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 溶液穩(wěn)定性

將對(duì)照品溶液與雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液置進(jìn)樣瓶中,室溫條件下,分別在第一次進(jìn)樣(0 h)后的第3,6,9,12,18和24 h進(jìn)樣,考察各溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在室溫條件下,對(duì)照品溶液和雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液的R-普瑞巴林峰面積在24 h內(nèi)與0 h 的變化率均在5%以下,表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 耐用性

考察某些色譜參數(shù)或操作有意或無(wú)意發(fā)生微小改變時(shí),方法依然能穩(wěn)健執(zhí)行并獲得正確的結(jié)果,見表3、4。

表3 耐用性考察的色譜參數(shù)

表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

由表3、4可知微小改變擬定方法的色譜條件,對(duì)分離度與檢測(cè)結(jié)果均無(wú)影響,說(shuō)明方法耐用性良好。

3 結(jié)論

3.1 檢測(cè)器的選擇

普瑞巴林及其對(duì)映異構(gòu)體無(wú)共軛雙鍵體系,紫外吸收弱,故選用質(zhì)量型檢測(cè)器提高檢測(cè)靈敏度,與液相匹配的檢測(cè)器可選用示差折光檢測(cè)器(RID)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)、電霧式檢測(cè)器(CAD)與質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)等,根據(jù)日常檢測(cè)的便利性,選用了靈敏度更高、重現(xiàn)性更好的CAD檢測(cè)器。

3.2 色譜柱的選擇

普瑞巴林有類似氨基酸的結(jié)構(gòu),對(duì)于普瑞巴林和R-普瑞巴林這種兩性手性化合物的分離,優(yōu)先考慮兩性離子色譜柱,另普瑞巴林口服溶液含水相,故需選擇可適用反相液相的色譜柱。本文考察了兩根手性色譜柱,分別為CHIROBIOTIC?T和CHIRALPAK ZWIX(+),兩根色譜柱均可使用常規(guī)的HPLC流動(dòng)相(甲醇、乙腈和水等)。其中CHIROBIOTIC?T色譜柱鍵合相為替考拉寧手性選擇劑,對(duì)未衍生化的α,β,γ以及環(huán)氨基酸等可提供獨(dú)特的選擇性;CHIRALPAK ZWIX(+)色譜柱的填料為硅膠表面鍵合奎寧(S,S)-ACHSA(*)衍生物(*)反式-2-氨基環(huán)己基磺酸,主要用于分離自由氨基酸的兩性離子手性固定相,對(duì)兩性手性化合物,尤其是未經(jīng)衍生的氨基酸和多肽,有顯著的立體選擇性。

3.3 流動(dòng)相體系的選擇

在兩性離子模式下,所有參與離子交換平衡的物質(zhì)需要在流動(dòng)相中較好地解離,流動(dòng)相首選能提供質(zhì)子化的溶劑,反相液相色譜中典型的能質(zhì)子化有機(jī)相溶劑主要有甲醇和乙醇,首選甲醇-水與乙醇-水體系進(jìn)行方法開發(fā)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在甲醇-水與乙醇-水體系下普瑞巴林與R-普瑞巴林未基線分離,故考慮加入緩沖鹽體系增加選擇性。根據(jù)FDA審評(píng)報(bào)告提到的普瑞巴林pKa分別為4.2與10.6,結(jié)合色譜柱的pH值耐受范圍,首選緩沖鹽的pH值范圍為5.2～6.8,緩沖鹽在該范圍的主要有醋酸鹽和磷酸鹽,由于選用的CAD檢測(cè)器優(yōu)選能揮發(fā)的緩沖鹽,故選擇醋酸鹽體系,在考察了0.01 mol·L-1醋酸鹽緩沖液-乙醇體系時(shí),發(fā)現(xiàn)了更優(yōu)的分離度,繼續(xù)優(yōu)化pH值至5.5時(shí)得到分離度最優(yōu)值,其中CHIROBIOTIC?T色譜柱在普瑞巴林與R-普瑞巴林均在低濃度時(shí)(約為30 μg·mL-1)才能有效分離,按普瑞巴林口服溶液中普瑞巴林(100%)與R-普瑞巴林的限度濃度(0.15%)比例配制的系統(tǒng)溶液圖譜中,普瑞巴林峰會(huì)完全包裹R-普瑞巴林峰,色譜柱不適用,而色譜柱CHIRALPAK ZWIX(+)在方法優(yōu)化后得到了較好的分離圖譜,詳見圖2典型色譜圖。

3.4 驗(yàn)證方法

本文驗(yàn)證的方法為雜質(zhì)定量分析方法,旨在通過高效液相色譜法測(cè)定普瑞巴林口服溶液中含量水平在0.15%以下的R-普瑞巴林。根據(jù)ICH Q2(R1)和《中國(guó)藥典》2020年版四部9101的法規(guī)要求及本方法的使用目的[7],本文驗(yàn)證了方法的專屬性、系統(tǒng)適用性、靈敏度(檢測(cè)限)、線性與范圍、準(zhǔn)確度(回收率)、精密度(重復(fù)性和中間精密度)、溶液穩(wěn)定性和耐用性,各驗(yàn)證項(xiàng)目均符合擬定的驗(yàn)證要求,證明該方法可用于檢測(cè)普瑞巴林口服溶液中的R-普瑞巴林的含量。當(dāng)然,該方法的重點(diǎn)在于色譜柱和流動(dòng)相的結(jié)合,在該體系下更換不同的檢測(cè)系統(tǒng)例如HPLC-ELSD或LC-MS等同樣可以用于檢測(cè)普瑞巴林原料藥或者普瑞巴林口服溶液的對(duì)映異構(gòu)體含量。