張春芝 江志國 莫寅斌 吳立國 謝惠芳

摘要 從賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)篩選出適合該產(chǎn)區(qū)“馬瑟蘭”干紅葡萄酒的本土酵母，與釀酒酵母CECA以1∶1混合發(fā)酵“馬瑟蘭”干紅葡萄酒。結(jié)果表明：通過葡萄酒理化指標(biāo)檢測結(jié)果可知，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，5號(hào)）、畢赤酵母屬克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri，8號(hào)）、有孢漢遜酵母屬葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum，12號(hào)）、紅酵母屬膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa，13號(hào)）、梅奇酵終屬美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，14號(hào)）在葡萄酒釀造中均具有良好的釀酒特性和廣闊的應(yīng)用前景。通過葡萄酒香氣成分檢測結(jié)果可知，8號(hào)酵母菌與釀酒酵母CECA混合發(fā)酵和5號(hào)酵母菌單獨(dú)發(fā)酵“馬瑟蘭”干紅葡萄酒中乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、異戊酸乙酯、月桂酸乙酯、α-乙酸萜品酯、苯乙醇、香茅醇、異丁醇的濃度較高，具有果香與花香濃郁的特點(diǎn)，尤其8號(hào)酵母菌與釀酒酵母CECA混合發(fā)酵具有蜂蜜及淡甜味。

關(guān)鍵詞 本土酵母；混菌發(fā)酵；馬瑟蘭干紅葡萄酒；香氣分析

中圖分類號(hào) TS261 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）02-0152-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.034

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effect of Indigenous and Commercial Saccharomyces cerevisiae Mixed Fermentation on the Quality of Marselan Dry Red Wine

ZHANG Chun-zhi， JIANG Zhi-guo， MO Yin-bin et al

（Ningxia Technical College of Wine and Desertification Prevention， Yinchuan， Ningxia 750199）

Abstract The indigenous Saccharomyces cerevisiae suitable for Marcelan dry red wine was selected from Ningxia′s Helan Mountain′s Eastern Region， mixed fermentation with CECA in a 1∶1 ratio.The results showed that indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 5， No. 8， No. 12，? No. 13 and No. 14 had good winemaking characteristics and application prospects in Marselan wine making. Based on wine aroma analysis， the indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 8 with commercial Saccharomyces cerevisiae CECA mixed fermentation，and use indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 5 only， the concentration of wine compounds is higher， such as isoamyl acetate， isoamyl alcohol， ethyl caproate， ethyl caprylate， ethyl decanoate， ethyl 9-decenoate， phenyl acetate， ethyl acetate， ethyl isovalerate， ethyl laurate， terpene acetate α-acetate， phenyl ethanol， citronellate， isobutanol， etc，with fruity and floral characteristics. The wine has honey and light sweetness to use indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 8 with commercial Saccharomyces cerevisiae CECA mixed fermentation.

Key words Indigenous Saccharomyces cerevisiae;Mixed fermentation;Marselan dry red wine;Aroma analysis

基金項(xiàng)目 寧夏高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（NGY2020186）。

作者簡介 張春芝（1977—），女，河北撫寧人，副教授，從事食品微生物研究。

收稿日期 2023-02-01

我國采用進(jìn)口的活性干酵母釀造葡萄酒，提高了葡萄酒的產(chǎn)量，但難以充分突出各產(chǎn)地葡萄酒的地域特色，因此，從賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)篩選出適合該產(chǎn)區(qū)特定葡萄品種的專用酵母，突出賀蘭山東麓葡萄酒的獨(dú)特風(fēng)格特征，對(duì)于我國自主研發(fā)葡萄酒酵母，以提高工業(yè)生產(chǎn)葡萄酒品質(zhì)有著極其重要的應(yīng)用價(jià)值。

“馬瑟蘭”是寧夏引入的釀酒葡萄新品種，在賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)出良好的生態(tài)適應(yīng)性，果實(shí)成熟度好，香氣濃郁，品種典型性突出，經(jīng)過“馬瑟蘭”葡萄釀造的干紅葡萄酒，品質(zhì)優(yōu)良，整體表現(xiàn)優(yōu)于“赤霞珠”葡萄酒。因此，“馬瑟蘭”葡萄適合在產(chǎn)區(qū)內(nèi)推廣種植，并適宜釀造優(yōu)質(zhì)干紅葡萄酒。目前，國內(nèi)外對(duì)葡萄酒香氣組分研究的報(bào)道很多，對(duì)“馬瑟蘭”干紅葡萄酒的香氣成分分析很少，而利用分離到的本土酵母發(fā)酵的“馬瑟蘭”干紅葡萄酒香氣成分研究鮮見報(bào)道。筆者利用寧夏賀蘭山東麓“馬瑟蘭”葡萄分離到的本土酵母菌和商業(yè)酵母CECA，分別釀造“馬瑟蘭”干紅葡萄酒，探索不同酵母對(duì)“馬瑟蘭”葡萄釀酒特性的影響，進(jìn)一步分析評(píng)價(jià)其香氣成分，為深入研究應(yīng)用本土酵母釀造地區(qū)特色葡萄酒的應(yīng)用潛力，選擇適合“馬瑟蘭”葡萄釀酒的本土酵母及提升“馬瑟蘭”干紅葡萄酒的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 試驗(yàn)材料?！榜R瑟蘭”釀酒葡萄，采自賀蘭山東麓甘城子產(chǎn)區(qū)。葡萄酒活性干酵母CECA，購于安琪酵母股份有限公司。菌株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，5號(hào)）、畢赤酵母屬克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri，8號(hào)）、有孢漢遜酵母屬葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum，12號(hào)）、紅酵母屬膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa，13號(hào)）、梅奇酵母屬美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，14號(hào)），均為分離自“馬瑟蘭”釀酒葡萄自然發(fā)酵醪液，保藏于寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract protein dextrose，YEPD）培養(yǎng)基、WLN（Wallerstein laboratory nutrient）培養(yǎng)基，配制后于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、亞硫酸，均為國產(chǎn)分析純，天津化學(xué)試劑公司；乙酸乙酯、乙酸異丁酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、2，3-丁二醇、苯乙醇、乙酸異戊酯、β-大馬酮、丁酸乙酯、里哪醇、辛酸乙酯、1-丁醇、2-辛醇、辛酸、（Z）-3-己烯-1-醇、己酸等42種化學(xué)標(biāo)品，均為色譜純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）裝置[配有57330-U聯(lián)用手柄、DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30 μm，2 cm）]，美國Supelco公司；QP2020氣相色譜-質(zhì)譜（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀，日本島津公司；色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌活化。

將保藏的酵母菌經(jīng)WLN培養(yǎng)基劃線分離、YEPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期備用；將活性干酵母CECA、CEC01置于28 ℃溫水中活化20 min后備用。

1.3.2 葡萄酒釀造。

將“馬瑟蘭”葡萄分揀除梗破碎后添加60 mg/L二氧化硫（6%亞硫酸），分裝于20 L玻璃罐中，浸漬過夜，將分離到的優(yōu)良酵母畢赤酵母屬克魯維畢赤酵母（8號(hào)）、有孢漢遜酵母屬葡萄汁有孢漢遜酵母（12號(hào)）、紅酵母屬膠紅酵母（13號(hào)）、梅奇酵母屬美極梅奇酵母（14號(hào)）分別與釀酒酵母CECA同時(shí)接種進(jìn)行混合發(fā)酵，以釀酒酵母CECA與分離到的釀酒酵母（5號(hào)）分別單獨(dú)發(fā)酵作為對(duì)照，發(fā)酵溫度為25 ℃，每天測定各發(fā)酵罐中比重以監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程，直到比重達(dá)到0.099 6以下，發(fā)酵10 d后添加60 mg/L SO終止發(fā)酵，過濾后經(jīng)過蘋果酸-乳酸自然發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后分離裝瓶。在陰涼處貯存。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測。

發(fā)酵結(jié)束后參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定葡萄酒基本理化指標(biāo)。

1.3.4 香氣成分測定。

SPME條件：取8 mL葡萄酒樣于裝有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（2-辛醇，0.4 mg/L）和磁力攪拌子的15 mL頂空瓶中，加入2.0 g NaCl，啟動(dòng)攪拌子，在40 ℃水浴中平衡15 min，而后插入DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭，40 ℃吸附30 min，立即將萃取頭在GC進(jìn)樣口解吸5 min后手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS分析。

GC-MS條件：不分流進(jìn)樣；柱升溫程序：以3 ℃/min從40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min從130 ℃升至25 ℃，保持8 min；離子源、連接桿及進(jìn)樣口的溫度均為250 ℃；電子源電壓70 eV；質(zhì)譜掃描范圍25～350 u，掃描頻率0.2次/s。

定性定量方法：采用與標(biāo)準(zhǔn)品特征離子比對(duì)、NIST2017譜庫檢索的方法定性。采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，無標(biāo)準(zhǔn)品的化合物以化學(xué)結(jié)構(gòu)相似和分子質(zhì)量相近為原則，選擇標(biāo)準(zhǔn)品曲線進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒理化指標(biāo)

由表1可知，所有酒樣密度均低于0.991 0 g/mL，說明酒精發(fā)酵完全，符合比重降至0.992～0.996進(jìn)行分離的工藝要求；結(jié)合總糖含量來看，8號(hào)、13號(hào)和商業(yè)酵母CECA的發(fā)酵性能基本一致，而12號(hào)、14號(hào)酵母發(fā)酵優(yōu)勢更加明顯和徹底。所有酒樣中乙醇含量接近或超過17%，可以用于生產(chǎn)高酒度的葡萄酒，而且5號(hào)、13號(hào)和商業(yè)酵母CECA差異不大；酒樣中固形物含量最低為32.7 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GB 15037葡萄酒規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（即紅葡萄酒≥18 g/L），對(duì)于改善和保證“馬瑟蘭”葡萄酒產(chǎn)品品質(zhì)具有積極作用；從酒樣中總多酚含量來看，5號(hào)、8號(hào)、14號(hào)與商業(yè)酵母CECA的應(yīng)用特性相近，而且總多酚含量的微小差距主要是由于浸漬管理、酒精發(fā)酵環(huán)境、人為工藝操作等差異性造成的。酒樣中的可滴定酸、揮發(fā)酸、pH、丙三醇等均處于葡萄酒正常發(fā)酵的指標(biāo)范圍，且酵母在各項(xiàng)目的發(fā)酵特性差異不大。因此，5號(hào)、8號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、14號(hào)在葡萄酒生產(chǎn)中具有良好的釀酒特性及廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)于提升“馬瑟蘭”本土化酵母研究具有重要的借鑒意義。

2.2 香氣成分

2.2.1 香氣成分的GC-MS分析。

6種不同酵母菌發(fā)酵處理酒樣中共定量分析出香氣成分61種（表2），其中包括醇類29種，酯類23種，醛類1種，酸類4種，酮類2種，萜烯類2種。所有酒樣中酯類化合物種類較多，是“馬瑟蘭”干紅葡萄酒的主要香氣成分，賦予葡萄酒果香氣味；醇類化合物種類最多，是葡萄酒主要香氣物質(zhì)之一，賦予葡萄酒更復(fù)雜的香氣；其他類化合物種類相對(duì)較少，也賦予了葡萄酒的花香和果香。所有的酒樣中含量均較高的香氣物質(zhì)是乙酸乙酯、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯、苯乙醇、2，3-丁二醇和癸酸乙酯。

大多數(shù)醇類物質(zhì)是在發(fā)酵過程中形成的，其濃度<300 mg/L時(shí)，可以增強(qiáng)葡萄酒的香氣復(fù)雜性，但濃度>400 mg/L時(shí)，使葡萄酒香氣失去平衡而產(chǎn)生不好的影響。由表3可知，12號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣含有27種醇類，8號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣含有22種醇類，鑒于各酒樣中醇類濃度均小于400 mg/L，未產(chǎn)生負(fù)面影響。異戊醇濃度均大于300 mg/L，使酒具有威士忌、香蕉和溶劑味，在5號(hào)和8號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣中含量相對(duì)較高。而苯乙醇和異丁醇濃度也明顯高于其他醇類，賦予酒樣苯乙醇的玫瑰花和蜂蜜的香氣，異丁醇的淡甜味和醇香的香氣，均在5號(hào)和8號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣中含量相對(duì)較高。其中，苯甲醇只存在于5號(hào)和12號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣中，使其具有果香、烘烤、杏仁的香氣，12號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣中更為突出。

2.2.2 不同酵母菌對(duì)“馬瑟蘭”干紅葡萄酒中香氣物質(zhì)的影響。

酯類物質(zhì)是葡萄酒中芳香性氣味的主要物質(zhì)，使葡萄酒具有果香和花香。由表2可知，檢測出的23種酯類中，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、異戊酸乙酯和9-癸烯酸乙酯9種酯類物質(zhì)的濃度較高，主要貢獻(xiàn)了酒樣的香氣物質(zhì)。其中，8號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣中包括這9種酯類物質(zhì)中的乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯和9-癸烯酸乙酯6種酯類，且其物質(zhì)濃度在供試酵母菌中均最高，賦予其酒樣復(fù)雜的果香與花香。

酸類物質(zhì)濃度在其閾值范圍內(nèi)會(huì)增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，超過閾值會(huì)給酒樣帶來負(fù)面影響。由表3可知，4種酸類物質(zhì)中的己酸均超過其閾值（420 μg/L），超過辛酸閾值（500 μg/L）的有8號(hào)、12號(hào)、13號(hào)和14號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣，具有奶酪味。

在檢出的其他物質(zhì)中，壬醛、α-萜品烯給5號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣貢獻(xiàn)了玫瑰、柑橘和檸檬香氣，香葉基丙酮使8號(hào)、12號(hào)和13號(hào)酵母菌發(fā)酵的酒樣具有木蘭、玫瑰的花香，β-大馬酮和β-法尼烯能夠貢獻(xiàn)葡萄酒中的花香。

3 結(jié)論

以賀蘭山東麓甘城子產(chǎn)區(qū)的““馬瑟蘭””釀酒葡萄為原料，將分離到的優(yōu)良酵母畢赤酵母屬克魯維畢赤酵母（8號(hào)）、有孢漢遜酵母屬葡萄汁有孢漢遜酵母（12號(hào)）、紅酵母屬膠紅酵母（13號(hào)）、梅奇酵母屬美極梅奇酵母（14號(hào)）分別與釀酒酵母CECA同時(shí)接種進(jìn)行混合發(fā)酵，同時(shí)釀酒酵母CECA與分離到的釀酒酵母（5號(hào)）分別單獨(dú)發(fā)酵釀造干紅葡萄酒，6種不同酵母菌發(fā)酵處理酒樣中共分析出香氣成分61種，其中包括醇類29種，酯類23種，醛類1種，酸類4種，酮類2種，萜烯類2種。所有酒樣中醇類物質(zhì)種類最多，其次是酯類物質(zhì)，這2類物質(zhì)賦予葡萄酒豐富復(fù)雜的香氣。所有酒樣檢測出的主要香氣物質(zhì)種類相近，但不同酵母菌發(fā)酵的香氣物質(zhì)濃度差異較大，畢赤酵母屬克魯維畢赤酵母（8號(hào)）發(fā)酵的酒樣中乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇的濃度均較高，果香與花香濃郁，有蜂蜜及淡甜味，釀酒酵母（5號(hào)）單獨(dú)發(fā)酵的酒樣中苯乙醇、香茅醇、異丁醇、α-乙酸萜品酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、異戊酸乙酯、月桂酸乙酯濃度較高，香氣物質(zhì)僅次于畢赤酵母屬克魯維畢赤酵母（8號(hào)）發(fā)酵的酒樣。因此，分離到的本土優(yōu)良酵母克魯維畢赤酵母（8號(hào)）和釀酒酵母（5號(hào)）適用于發(fā)酵“馬瑟蘭”干紅葡萄酒，可以作為符合“馬瑟蘭”葡萄酒生產(chǎn)、有廣闊應(yīng)用潛力的本土化酵母進(jìn)行研究、應(yīng)用和轉(zhuǎn)化。

隨著應(yīng)用不同酵母菌株混合發(fā)酵釀造葡萄酒的深入研究，本土化酵母混合發(fā)酵既能改善葡萄酒香氣，又能提升品質(zhì)。在后續(xù)研究中，將不同菌株的互作關(guān)系及對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響作為研究重點(diǎn)，為釀造高品質(zhì)的“馬瑟蘭”葡萄酒提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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