惠朋利 朱社教 王成 謝紅 沈維艷 王謐 張濤 鄒崇偉 高宏君 曾紅梅

(安康市中醫(yī)醫(yī)院,陜西 安康 710000)

炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一種特發(fā)性、慢性、復(fù)發(fā)性疾病,通常累及回腸、直腸和結(jié)腸,包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s Disease,CD)[1-2]。臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘液膿血便、甚至癌變。盡管目前確切病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確,但現(xiàn)有研究結(jié)果認(rèn)為該病是一種免疫介導(dǎo)的腸道炎癥[3-4]。流行病學(xué)研究顯示UC通常發(fā)生在20-30歲的青年人群,但也可見(jiàn)于其他年齡階段[5-6]。UC治療原則是控制急性起病,維持病情緩解,減少?gòu)?fù)發(fā),預(yù)防并發(fā)癥[4-7]。UC的治療藥物包括氨基水楊酸,皮質(zhì)類固醇和免疫調(diào)節(jié)劑,但大多數(shù)藥物在副作用和安全性方面都有很大局限性[8-9]。

近年來(lái),一些學(xué)者對(duì)中藥復(fù)方治療UC的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了研究,如芍藥湯、半夏瀉心湯和烏梅丸等等,已發(fā)表的研究結(jié)果表明這些復(fù)方在改善腹痛和腹瀉癥狀、減輕炎癥方面發(fā)揮著重要作用[10-11]。葛根芩連湯出自《傷寒論》,主治傷寒表邪未解,誤用下法導(dǎo)致表邪里陷、協(xié)熱下利之證。方中葛根解表邪、清里熱、升陽(yáng)止瀉;黃芩、黃連清熱燥濕、善清腸胃濕熱而厚腸止利;甘草緩急止痛、補(bǔ)益脾胃。王萍麗[10]和王傳頌[8]兩項(xiàng)臨床研究對(duì)照組分別采用柳氮磺吡啶和美沙拉嗪為對(duì)照組,治療組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上聯(lián)用葛根芩連湯,兩者的結(jié)論均提示葛根芩連湯能夠顯著提高有效率,縮短黏膜愈合時(shí)間?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示葛根芩連湯能夠改善UC大鼠消化道癥狀、降低炎癥因子和5-HT含量[12]。為進(jìn)一步了解該藥治療UC的作用機(jī)制,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法找出其作用靶點(diǎn)及可能的通路。

1 材料與方法

1.1葛根芩連湯化合物及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 本研究采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)對(duì)葛根芩連湯中藥物的化合物和靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),首先將藥物名稱(葛根、黃芩、黃連、甘草)分別輸入檢索框,本研究納入所有檢索到的化合物,并將化合物與靶點(diǎn)進(jìn)行匹配。最后將上述靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)查詢靶點(diǎn)的名稱,將靶點(diǎn)的蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因名稱以方便后續(xù)分析。

1.2UC的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及靶點(diǎn)映射 本研究采用OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/search/advanced/geneMap)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/search)對(duì)UC的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),首先以“Ulcerative Colitis”為檢索詞分別檢索兩個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù),然后將所獲得的UC靶點(diǎn)進(jìn)行匯總并去除重復(fù)靶點(diǎn),最后將1.1中所得GGQL靶點(diǎn)與UC靶點(diǎn)進(jìn)行映射,即可獲得GGQL治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò) 本研究采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/),首先選擇 “multiple proteins”,然后將1.2中所得關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入搜索框,物種選擇“Homo sapiens”,繼續(xù)下一步操作,即可得到基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。為了更清晰地看到網(wǎng)絡(luò)中哪些靶點(diǎn)處于核心位置,故將基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件并按照節(jié)點(diǎn)度值大小對(duì)圖形進(jìn)行調(diào)整。

1.4GO富集分析和通路富集分析 本研究采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進(jìn)行GO富集分析和通路富集分析,首先將1.2中所得交集靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),然后將Backgroung和List定義為“Homo sapiens”,最后即可進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1GGQL化合物及靶點(diǎn) 通過(guò)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,將化合物與靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)并去除重復(fù)靶點(diǎn),共得到藥物的化合物278中,靶點(diǎn)410個(gè)。詳見(jiàn)圖1。然后將其輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行名稱轉(zhuǎn)化。最后利用R軟件VennDiagram程序包對(duì)四種藥物的靶點(diǎn)繪制韋恩圖,共得到交集靶點(diǎn)62個(gè)。詳見(jiàn)圖2。

(紅色的節(jié)點(diǎn)表示藥物,綠色的節(jié)點(diǎn)表示化合物,黃色的節(jié)點(diǎn)表示藥物靶點(diǎn)。)

圖2 藥物潛在靶標(biāo)交集

2.2UC靶點(diǎn)及靶點(diǎn)映射 通過(guò)對(duì)DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索,將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所的UC靶點(diǎn)進(jìn)行匯總并去除重復(fù)靶點(diǎn)后共得到疾病靶點(diǎn)914個(gè)。然后利用R軟件VennDiagram程序包將GGQL與UC靶點(diǎn)進(jìn)行映射,共得到交集靶點(diǎn)113個(gè)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 “藥物靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)

2.3基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò) 將上述關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中有節(jié)點(diǎn)113個(gè),邊621條,平均節(jié)點(diǎn)度值11。將最小的相互作用分調(diào)整為0.7,并隱藏獨(dú)立的節(jié)點(diǎn)。將輸出結(jié)果中的TSV文件格式導(dǎo)入到Cytoscape軟件,然后按照節(jié)點(diǎn)度值的大小進(jìn)行圖形繪制,圖形中相互作用越多、越重要,并且居于核心位置的靶點(diǎn)圖形越大。從圖中不難看出IL6、STAT3、IL1B、VEGFA、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、ICAM1、MMP9等十個(gè)節(jié)點(diǎn)圖形明顯大于其他節(jié)點(diǎn),表明這些節(jié)點(diǎn)在葛根芩連湯治療UC中發(fā)揮關(guān)鍵作用。圖中藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)表示GGQL靶點(diǎn)與UC靶點(diǎn)交集,紫色的部分表示藥物共有靶點(diǎn)與圖3所得靶點(diǎn)的交集。詳見(jiàn)圖4。

圖4 基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

2.4GO富集分析和通路富集分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析,其中GO富集分析共聚為16類,涉及89個(gè)條目,按照P<0.05和FDR<0.05進(jìn)行篩選并去除重復(fù)值,最終得到有顯著意義的條目9條,分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)、血紅素結(jié)合、對(duì)氨基酸的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核糖核酸聚合酶2轉(zhuǎn)錄因子活性以及配體激活的序列特異性脫氧核糖核酸結(jié)合、細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)、趨藥性、參與凋亡過(guò)程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活。而血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核糖核酸聚合酶2轉(zhuǎn)錄因子活性以及配體激活的序列特異性脫氧核糖核酸結(jié)合屬于分子功能,其他則屬于生物過(guò)程。詳見(jiàn)圖5。通路富集分析共聚為26類,涉及218個(gè)條目,按照P<0.05和FDR<0.05進(jìn)行篩選并去除重復(fù)值,最終得到有顯著意義的條目17條,其中TNF信號(hào)通路、炎癥性腸病(IBD)、TLR信號(hào)通路、NLR信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等通路UC關(guān)系密切。詳見(jiàn)圖6。圖5和圖6中節(jié)點(diǎn)形狀越大,表示GO和KEGG條目所富集的靶點(diǎn)數(shù)目越多;節(jié)點(diǎn)的顏色越紅,表示GO和KEGG富集分析的P值越小。

圖5 GO富集分析圖

3 討論

UC是一種影響人類健康的慢性復(fù)發(fā)性胃腸道疾病,根據(jù)其癥狀應(yīng)屬于中醫(yī)“痢疾、泄瀉”的范疇[13]。無(wú)論是痢疾還是泄瀉,其實(shí)都與腸道關(guān)系密切,目前研究認(rèn)為腸道菌群是人體的重要組成部分,腸道菌群與宿主之間存在著相互依存、相互制約的關(guān)系[14]。正常情況下,腸道菌群參與宿主消化、營(yíng)養(yǎng)吸收和免疫調(diào)節(jié),保證微生物與宿主的穩(wěn)定和平衡[15]。然而,腸道微生物群的破壞會(huì)誘發(fā)包括UC在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生[16]?！秲?nèi)經(jīng)》首先提出“大腸小腸皆屬于胃”的說(shuō)法,脾胃相鄰?fù)佑谥薪?脾氣以升、胃氣以降,兩者功能正常則胃腸道功能才能協(xié)調(diào),二便方可正常[17]。本研究所納入之葛根芩連湯即是在這一理論指導(dǎo)下的組方,其中方中葛根,入脾胃二經(jīng),解表邪、清里熱,現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為葛根主要成分為異黃酮類化合物,這些成分具有較強(qiáng)的抗氧化作用,可以提高機(jī)體免疫力[18];黃芩味苦性寒,歸脾、胃、大腸、小腸經(jīng),現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為黃芩主要成分黃芩素和黃芩苷具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗炎和抗氧化作用,它能夠抑制細(xì)胞因子的表達(dá)促使免疫平衡[19-20];黃連味苦性寒,歸脾、胃、大腸經(jīng),作用與黃連相同具有清熱燥濕、厚腸止利之功,現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為黃連含量最高的化合物小檗堿具有抗菌、抗炎、抗氧化的作用,能夠顯著抑制血清中炎癥因子的表達(dá)[21];甘草味甘性平,具有緩急止痛、補(bǔ)益脾胃之效,現(xiàn)代研究認(rèn)為該藥具有較好的抗炎、抗氧化活性[22-23]?？傊?UC炎癥以及免疫失衡密切相關(guān),而葛根芩連湯中單藥均具有較好的抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用,表明該方治療UC具有較大的實(shí)際意義。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析葛根芩連湯的作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制,對(duì)葛根芩連湯治療UC的113個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?研究結(jié)果顯示IL6、STAT3、IL1B、VEGFA、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、ICAM1、MMP9等十個(gè)靶點(diǎn)度值較高。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)IL6基因編碼一種細(xì)胞因子,在炎癥和B細(xì)胞成熟中發(fā)揮作用,與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[24]。STAT3基因編碼的蛋白質(zhì)是通過(guò)對(duì)各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的磷酸化來(lái)激活的,這種蛋白調(diào)節(jié)多種基因?qū)?xì)胞刺激的反應(yīng),因此在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等許多細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[25]。IL1B基因編碼的蛋白質(zhì)是白細(xì)胞介素1細(xì)胞因子家族的成員,是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),參與多種細(xì)胞活動(dòng),包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡[26]。VEGFA基因是PDGF/VEGF生長(zhǎng)因子家族的成員,這種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,對(duì)生理和病理血管生成都是必不可少的,其表達(dá)與腫瘤的分期和進(jìn)展有關(guān)[27]。MAPK1基因編碼MAP激酶家族的成員,MAP激酶是多種生化信號(hào)的整合點(diǎn),通過(guò)上游激酶的磷酸化參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等多種過(guò)程[28]。EGF基因編碼表皮生長(zhǎng)因子超家族的一個(gè)成員,這些蛋白是一種有效的有絲分裂因子,在多種細(xì)胞類型的生長(zhǎng)、增殖和分化中起著重要作用,并且該基因的失調(diào)與某些癌癥的生長(zhǎng)和發(fā)展有關(guān)[29]。PTGS是PG合成的關(guān)鍵,它分為兩種功能酶,即PTGS1和PTGS2,他們主要分布在胃腸道平滑肌細(xì)胞中表達(dá),在炎癥刺激的組織中表達(dá)并參與炎癥反應(yīng)[30]。EGFR基因編碼的蛋白質(zhì)是一種跨膜糖蛋白,這種蛋白是表皮生長(zhǎng)因子家族成員的受體,蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合誘導(dǎo)受體二聚化和酪氨酸自磷酸化,并導(dǎo)致細(xì)胞增殖,最終可以導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[31]。細(xì)胞粘附分子(CAMs)是一大類跨膜蛋白,參與細(xì)胞與另一細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合,在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、運(yùn)輸、凋亡和組織結(jié)構(gòu)中起作用,而ICAM1基因編碼一種細(xì)胞表面糖蛋白,通常在內(nèi)皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞上表達(dá)[32]。MMP家族的蛋白質(zhì)參與正常生理過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)的分解,可能在細(xì)胞外基質(zhì)的局部蛋白水解和白細(xì)胞遷移中起重要作用[33]。UC是一種慢性炎癥性腸病,結(jié)直腸癌是UC的并發(fā)癥之一,因此這些與炎癥相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能在UC的治療中也起著關(guān)鍵作用,也可能同時(shí)對(duì)UC并發(fā)癌變具有一定的預(yù)防作用[34-35]。

目前UC的體外實(shí)驗(yàn)中以NF-kB通路最為多見(jiàn)[36],其次為TLR信號(hào)通路[37-38],NLR信號(hào)通路[39]和STAT信號(hào)通路[40]等等,表明干預(yù)NF-kB信號(hào)通路在UC的治療中發(fā)揮著重要作用[41]。UC是由于腸道菌群紊亂,慢性炎癥反復(fù)發(fā)作所致,本項(xiàng)研究葛根芩連湯干預(yù)UC的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中113個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)不僅富集在包括這四條與UC密切相關(guān)的通路上,也富集在其他與炎癥有關(guān)的通路上,表明葛根芩連湯在UC的治療具有一定的理論基礎(chǔ)。中藥成分復(fù)雜,通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路的干預(yù)疾病,但是本研究根據(jù)富集中的P值和FDR值進(jìn)行篩選后發(fā)現(xiàn)TNF信號(hào)通路值最低、富集的靶點(diǎn)最多,據(jù)此推測(cè)葛根芩連湯可能是通過(guò)干預(yù)TNF信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)UC的治療作用。