許曉剛,張春江,付彥杰,董王鈺,楊曉萍
(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832000)
在我國(guó),腎小球腎炎仍是引起慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD)的主要原因[1]。系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN)為原發(fā)性腎小球腎炎最常見(jiàn)的類型[2-3],其以腎小球系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)積累為主要病理特征,隨著病情發(fā)展可出現(xiàn)腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化,并進(jìn)一步進(jìn)展至CKD乃至終末期腎?。?]。
目前,有關(guān)于MsPGN 的發(fā)病原因及進(jìn)展機(jī)制尚未完全闡明,有研究指出,在MsPGN 大鼠腎組織中,TGF-β1、p-Smad2/3 及p-ERK1/2 表達(dá)升高[5-6]。TGF-β/Smads 信號(hào)通路在多種類型腎臟疾病中被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵,是CKD 進(jìn)展的核心[7]。ERK 作為MAPK 的家族成員之一,參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移[8],有學(xué)者認(rèn)為活化的ERK1/2 是出現(xiàn)蛋白尿和腎小球硬化的主要上游中介[9]。因此,靶向TGF-β/Smads 和ERK 信號(hào)通路延緩腎臟病進(jìn)展是MsPGN 的主要治療策略。
多項(xiàng)臨床研究表明,益腎化濕顆??蓽p輕慢性腎小球腎炎患者尿蛋白,具有消腫及延緩腎功能惡化功效,然而其分子機(jī)制尚未闡明[10-11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),益腎化濕顆??上抡{(diào)PI3K/Akt 信號(hào)通路降低MsPGN 大鼠蛋白尿,同時(shí)可延緩腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展,具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明[12]。本研究旨在建立大鼠慢性抗Thy-1 腎炎模型探究益腎化濕顆粒是否介導(dǎo)TGF-β/Smads/ERK 通路活化參與MsPGN 的腎保護(hù)作用。
1.1 動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)別SD 大鼠30 只,8 周齡,體質(zhì)量200~250 g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (新)2018-0002],飼養(yǎng)環(huán)境為室內(nèi)溫度22~26 ℃,相對(duì)濕度40% ~70%,自由飲水?dāng)z食。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均通過(guò)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理號(hào)2022 倫審(151)號(hào)]。
1.2 藥物與試劑 益腎化濕顆粒(規(guī)格10g/袋,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090250,廣州康臣藥業(yè)有限公司); 纈沙坦分散片(規(guī)格80 mg/片,國(guó)藥準(zhǔn)字H20090092,魯南貝特制藥有限公司)。兔抗大鼠Thy-1 多克隆抗體(貨號(hào)bs-0778R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司); 尿蛋白定量測(cè)試盒(貨號(hào)C035-2-1,南京建成生物工程研究所有限公司); TGF-β1抗體(貨號(hào)ab215715,英國(guó)Abcam 公司); 兔抗p-Smad2/3[貨號(hào)abs130992,愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司];Smad2/3 抗體、ERK1/2 抗體、p-ERK1/2 抗體、Fibronectin抗體、GAPDH 多克隆抗體、HRP-山羊抗兔二抗 (貨號(hào)BA1395、BM4326、BM4156、M00564-3、A00227-1、BM3894,武漢博士德生物工程有限公司); 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、牛血清白蛋白(BAS)、ECL 發(fā)光液、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)。
1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司); 高速冷凍離心機(jī)、NanoDrop2000 核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司); 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);酶標(biāo)儀、電泳儀、PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)。
2.1 造模、分組及給藥 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后在麻醉下行左腎摘除術(shù),術(shù)前禁食不禁水10 h,術(shù)后自由攝食水。單腎摘除1 周后隨機(jī)選取6 只大鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水作為對(duì)照組,其余24 只大鼠參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道,經(jīng)尾靜脈注射2.5 mg/kg 的Thy-1 抗體復(fù)制慢性不可逆型大鼠腎炎模型。將抗Thy-1 腎炎大鼠隨機(jī)分為為模型組、纈沙坦(8.5 mg/kg)組和益腎化濕顆粒低、高劑量組(3.125、6.25 g/kg),每組6 只分籠飼養(yǎng)。益腎化濕顆粒溶于40 ℃生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL 的溶液; 纈沙坦分散片溶于40 ℃生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 的溶液。各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物,對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水,每天1 次,連續(xù)6 周。
2.2 一般情況觀察 觀察大鼠精神、活動(dòng)度、飲水?dāng)z食情況、皮毛光澤度及體質(zhì)量變化。計(jì)算大鼠體質(zhì)量增速,公式為體質(zhì)量增速= (處死前體質(zhì)量-造模前體質(zhì)量)/42。
2.3 尿蛋白定量檢測(cè) 造模后第7、14、28、42 天,采用代謝籠分別收集各組大鼠24 h 尿液,采用考馬斯亮藍(lán)法(CBB)測(cè)定尿蛋白水平。
2.4 血清肌酐、尿素氮水平檢測(cè) 給藥結(jié)束后,腹腔采血,離心取血清,于-80 ℃冰箱中保存,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐、尿素氮水平。
2.5 腎組織病理學(xué)檢測(cè) 給藥結(jié)束后處死大鼠,取右腎稱量濕重,部分腎組織置于-80 ℃冰箱冰凍保存; 其余部分腎組織于4%多聚甲醛中固定,脫水、透明后浸蠟,石蠟包埋并切片(厚度3.0 μm)。分別對(duì)切片進(jìn)行HE、Masson染色,于顯微鏡下觀察并拍照; 采用Image J 軟件對(duì)采集的圖像進(jìn)行半定量分析,估計(jì)腎小球內(nèi)細(xì)胞核數(shù),計(jì)算藍(lán)色染色面積并賦分評(píng)估腎組織纖維化程度(藍(lán)染面積≤5%記為0 分,5%<藍(lán)染面積≤25%記為1 分,25% <藍(lán)染面積≤50%記為2 分,50%≤藍(lán)染面積<75%記為3 分,藍(lán)染面積≥75%記為4 分),每只大鼠至少評(píng)估10 個(gè)腎小球。
2.6 免疫組化(IHC)染色檢測(cè)腎組織TGF-β1的分布及表達(dá)強(qiáng)度 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,EDTA 微波抗原修復(fù)后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,3% 過(guò)氧化氫(H2O2)室溫孵育10 min 清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS 沖洗,BSA 室溫封閉20 min,加入TGF-β1一抗(1 ∶500),4 ℃孵育過(guò)夜,PBST 沖洗后加入二抗(1 ∶500),室溫孵育30 min,PBST 沖洗后DAB 顯色,自來(lái)水沖洗,復(fù)染細(xì)胞核,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,樹(shù)膠封片,于光鏡下觀察細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色顆粒沉積為陽(yáng)性。將采集圖片參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道方法,應(yīng)用Image J 軟件計(jì)算平均光密度值(AOD),以此評(píng)估TGF-β1染色面積及強(qiáng)度。
2.7 Western blot 法檢測(cè)腎組織TGF-β1、Smad2/3、FN 及ERK1/2 蛋白表達(dá) 取于-80 ℃冰箱中保存腎組織,剪取約50 mg 放入無(wú)酶EP 管中,加入RIPA 裂解液并在預(yù)冷研磨機(jī)中充分研磨至懸混液,12 000 r/min 離心30 min 后取上清液,采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度后統(tǒng)一配平為2 μg/μL 的蛋白樣品,水浴鍋中煮沸10 min 使蛋白充分變性。取5 μL 樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF 膜,加入脫脂奶粉或BSA 封閉,加入TGF-β1(1 ∶ 1 000)、Smad2/3 (1 ∶ 500)、p-Smad2/3(1 ∶500)、FN (1 ∶1 000)、ERK1/2 (1 ∶500)、p-ERK1/2(1 ∶500)及GADPH (1 ∶1 000)一抗于4 ℃冰箱中搖床孵育過(guò)夜,TBST 溶液洗滌3 次,每次10 min,室溫下孵育二抗(1 ∶5 000)2 h,清洗后加入ECL 發(fā)光液并于暗室曝光。以GAPDH 為內(nèi)參,應(yīng)用Image J 軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。
2.8 RT-qPCR 法檢測(cè)腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達(dá) 取于-80 ℃冰箱中保存腎組織,采用TRIzol 法提取總RNA,通過(guò)Nanodrop 儀器測(cè)定RNA 濃度,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制25 μL 反應(yīng)體系,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,共循環(huán)40 次。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各組CT值,以2-ΔΔCT法計(jì)算TGF-β1、FNmRNA 表達(dá)。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)Primer-BLAST 設(shè)計(jì)引物,由美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司合成,序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列
2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)性、皮毛光澤度、飲食情況以及大小便方面表現(xiàn)均良好; 模型組大鼠有不同程度的精神狀態(tài)不佳,食量、活動(dòng)度及皮毛光澤度下降等情況,總體體質(zhì)量增長(zhǎng)率較對(duì)照組稍偏低; 而益腎化濕顆粒各劑量組大鼠隨著藥物干預(yù)進(jìn)程,精神狀態(tài)、攝食積極性較前有明顯好轉(zhuǎn),食量、活動(dòng)度增加。如表2 所示,益腎化濕顆粒各劑量組體質(zhì)量增長(zhǎng)速率較模型組和纈沙坦組均升高(P<0.05,P<0.01)。
表2 各組大鼠體質(zhì)量增速比較(x±s,n=6)
3.2 益腎化濕顆粒對(duì)慢性MsPGN 大鼠24 h 尿蛋白定量的影響 如表3 所示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h 尿蛋白水平均升高(P<0.01); 與模型組比較,益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組隨著給藥時(shí)間推移,24 h 尿蛋白水平降低更明顯(P<0.05,P<0.01); 與益腎化濕顆粒低劑量組比較,益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠24 h 尿蛋白水平降低更明顯(P<0.05)。
表3 各組大鼠24 h 尿蛋白定量比較(mg,x±s,n=6)
3.3 益腎化濕顆粒對(duì)慢性MsPGN 大鼠腎功能的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清肌酐、尿素氮水平升高(P<0.05); 與模型組比較,益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組大鼠血清肌酐、尿素氮水平降低(P<0.05),見(jiàn)表4。
表4 各組大鼠腎功能比較(x±s,n=6)
3.4 益腎化濕顆粒對(duì)慢性MsPGN 大鼠腎組織病理變化的影響 如圖1A 所示,對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)基本正常; 而模型組大鼠腎組織主要呈現(xiàn)出不同程度且不可逆的系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)彌漫性增多的病理改變,部分腎小球內(nèi)毛細(xì)血管受壓、管腔狹窄,出現(xiàn)廣泛膠原蛋白沉積,結(jié)合尿蛋白定量結(jié)果,提示本實(shí)驗(yàn)慢性MsPGN 動(dòng)物模型復(fù)制成功; 益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)異常增殖情況有一定程度的改善。
圖1 益腎化濕顆粒對(duì)慢性MsPGN 大鼠腎組織病理變化的影響(×400,±s,n=6)
如圖1B~1C 所示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎小球內(nèi)核計(jì)數(shù)增加(P<0.01),纖維化程度加重(P<0.01);與模型組比較,益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組腎小球內(nèi)核計(jì)數(shù)減少(P<0.01),纖維化程度減輕(P<0.01);與益腎化濕顆粒低劑量組比較,益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組腎組織病理?yè)p傷緩解效果更佳 (P<0.05,P<0.01)。
3.5 益腎化濕顆粒對(duì)慢性MsPGN 大鼠腎組織TGF-β1分布及表達(dá)強(qiáng)度的影響 如圖2、表5 所示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿及腎小球系膜區(qū)呈現(xiàn)不同程度的棕色顆粒沉積,AOD 值較高(P<0.01); 與模型組比較,益腎化濕顆粒各劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度降低(P<0.01); 與益腎化濕顆粒低劑量組比較,益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠AOD 值較低(P<0.05)。
圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1 免疫組化染色(×200)
表5 各組大鼠腎組織TGF-β1 AOD 值比較(x±s,n=6)
3.6 益腎化濕顆粒對(duì)慢性MsPGN 大鼠腎組織TGF-β1、Smad2/3、FN 及ERK1/2 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、FN 及p-ERK1/2 蛋白表達(dá)升高(P<0.01); 與模型組比較,纈沙坦組和益腎化濕顆粒各劑量組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、FN 及p-ERK1/2 蛋白表達(dá)降低(P<0.01); 與益腎化濕顆粒低劑量組比較,益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、FN 及p-ERK1/2 蛋白表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01)。
圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1、FN、p-Smad2/3 及p-ERK1/2 蛋白表達(dá)(±s,n=6)
3.7 益腎化濕顆粒對(duì)慢性MsPGN 大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達(dá)的影響 如表6 所示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達(dá)升高(P<0.01); 與模型組比較,纈沙坦組和益腎化濕顆粒各劑量組大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表達(dá)降低(P<0.01); 與益腎化濕顆粒低劑量組比較,益腎化濕顆粒高劑量組和纈沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、FNmRNA 表降低(P<0.05,P<0.01)。
表6 各組大鼠腎組織TGF-β1、FN mRNA 表達(dá)比較(x±s,n=6)
隨著腎臟病學(xué)及腎臟病理學(xué)的發(fā)展,MsPGN 的病因機(jī)制越來(lái)越明確,非特異性情況下不再被描述為一種特定的腎小球疾病,而是許多腎小球疾?。ㄈ鏘gA 腎病、Ⅱ型狼瘡腎炎、感染后腎小球腎炎、IgM 腎病等)共通的病理?yè)p傷模式[15]。因此,對(duì)MsPGN 治療策略的研究可為一眾腎小球疾病的治療提供參考和依據(jù)。
臨床上,MsPGN 的基線治療主要是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素受體拮抗劑,有CKD 進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)時(shí)加用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等[16],考慮到上述藥物的局限性,越來(lái)越多的學(xué)者提倡中西醫(yī)結(jié)合治療慢性腎小球疾病。本研究結(jié)果顯示,益腎化濕顆??山档涂筎hy-1 腎炎大鼠蛋白尿,減輕腎小球系膜細(xì)胞增殖、ECM 積累、腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等病理改變,表明益腎化濕顆粒對(duì)MsPGN 大鼠具有保護(hù)作用。
蛋白質(zhì)能量消耗在CKD 患者中很常見(jiàn),會(huì)隨著腎小球?yàn)V過(guò)率的降低而逐漸明顯[17]。同時(shí),腎臟病營(yíng)養(yǎng)指南表明低水平的身體質(zhì)量指數(shù)是CKD1-5 期非透析者及CKD5D 期維持性血透患者死亡率升高的因素之一[18]。益腎化濕顆粒在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出具有改善患者食欲的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn),益腎化濕顆粒低、高劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)較纈沙坦組、模型組明顯,推測(cè)這與其降低大鼠蛋白尿、改善腎功并增加大鼠食欲相關(guān),而增加體質(zhì)量或許在一定程度上有助于延緩疾病進(jìn)程。
越來(lái)越多的研究證實(shí)TGF-β1與腎臟纖維化關(guān)系密切[20]。在腎臟疾病中,TGF-β1激活經(jīng)典的Smads 信號(hào)通路,在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控促纖維分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯,誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞激活和ECM 蛋白合成[21]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)升高,下游p-Smad2/3 亦呈上調(diào)趨勢(shì),免疫組化顯示TGF-β1集中表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞和系膜區(qū),提示TGF-β1/Samds 信號(hào)通路參與了慢性MsPGN 纖維化進(jìn)程。從蛋白和基因?qū)用姘l(fā)現(xiàn),益腎化濕顆粒可抑制抗Thy-1 腎炎大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、FN 的表達(dá)。此外,TGF-β1還可調(diào)控非經(jīng)典信號(hào)通路,如磷脂酰肌醇-3激酶,絲裂原活化蛋白激酶家族等[22],后者主要包括ERK1/2,p-38 和JNK[23]。ERK 信號(hào)通路的活化參與腎小球系膜細(xì)胞的增殖及ECM 沉積[24],與腎臟纖維化密切相關(guān)[25]。有研究指出ERK 可磷酸化Smad2 和Smad3 連接子區(qū)域殘基,調(diào)控Smad3 依賴的基因轉(zhuǎn)錄[26],提示TGF-β1/Samds 與ERK1/2 之間存在環(huán)形信號(hào)交互。本研究發(fā)現(xiàn),抗Thy-1 腎炎大鼠腎組織p-ERK1/2 表達(dá)升高,益腎化濕顆??梢种艵RK 活化,提示益腎化濕顆粒可下調(diào)TGF-β1/Samds信號(hào)通路,抑制ERK1/2 磷酸化。
綜上所述,益腎化濕顆??筛纳坡钥筎hy-1 腎炎大鼠蛋白尿,減輕系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)積累,增加大鼠體質(zhì)量,延緩腎功能進(jìn)展,發(fā)揮腎保護(hù)作用,該作用可能與抑制TGF-β1/Smad2/3/ERK1/2 信號(hào)通路的活化相關(guān)。