鄭婭雯 袁夢(mèng) 劉秀娟 張欣

(1.南京體育學(xué)院研究生部;2.南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院 江蘇南京 210014)

電脈沖刺激（Electrical Pulse Stimulation，EPS）應(yīng)用于細(xì)胞系和培養(yǎng)的原代骨骼肌細(xì)胞的骨骼肌肌管已被證明是研究收縮誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)的主要工具［1］，其中C2C12細(xì)胞是體外研究骨骼肌內(nèi)部機(jī)制的常用細(xì)胞模型［2］，可以表達(dá)各種成熟骨骼肌中存在的標(biāo)志蛋白，因此為體外研究成肌細(xì)胞增殖和分化的首選模型［3］。用電脈沖刺激模擬神經(jīng)元刺激激活體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞，從而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞收縮達(dá)到模擬運(yùn)動(dòng)的效果。已有研究表明，人體肌管的體外EPS（急性、高頻和慢性、低頻）可用于研究運(yùn)動(dòng)的效果，目前有關(guān)的電脈沖刺激骨骼肌細(xì)胞構(gòu)建生物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)逐漸增多，電刺激方案中可變換的維度較多，故產(chǎn)生了模擬各類運(yùn)動(dòng)類型的電刺激骨骼肌細(xì)胞模型，例如：急性或慢性抗阻運(yùn)動(dòng)模型、耐力運(yùn)動(dòng)模型［4］、向心運(yùn)動(dòng)模型等，其依據(jù)是許多研究發(fā)現(xiàn)EPS能夠誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)和代謝特征的變化［5］，在骨骼肌內(nèi)，各類運(yùn)動(dòng)類型變化包括基因（例如GLUT4表達(dá)增加）、代謝（例如葡萄糖攝取增加）和形態(tài)學(xué)變化（例如肥大）。因此，體外運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅仨氉C明在該模型中觀察到轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)或代謝變化等方面的運(yùn)動(dòng)效應(yīng)，才可以做出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拇碳?qiáng)度可以類比鍛煉程度的結(jié)論。例如選用IL-6（白細(xì)胞介素6）、P38 絲裂原活化蛋白激酶（P38）作為骨骼肌細(xì)胞收縮指標(biāo)［6-7］。此外，在小鼠在體實(shí)驗(yàn)中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）可作為骨骼肌損傷指標(biāo)［8］，而將CK和LDH作為骨骼肌損傷指標(biāo)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鮮有，以此為創(chuàng)新點(diǎn)之一。選用CK、LDH 作為骨骼肌損傷指標(biāo)，探究可行的電脈沖刺激方案，本研究著重探究不同電壓（10 V、23 V、40 V）刺激條件下的EPS對(duì)C2C12 細(xì)胞收縮與損傷的影響，試圖建立由EPS 誘發(fā)的C2C12細(xì)胞離心運(yùn)動(dòng)損傷模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

細(xì)胞培養(yǎng)基（gibco：DMEM培養(yǎng)基）、青霉素鏈霉素溶液（biosharp）、胰蛋白酶（gibco）、胎牛血清、馬血清、PBS（中喬新舟）、鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（欣友生物技術(shù)有限公司）、六孔細(xì)胞培養(yǎng)板（costar）、培養(yǎng)瓶（CORNING）、肌酸激酶（CK）測(cè)定試劑盒（南京建成）、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A020-2）、RIPA 裂解液（碧云天）、蛋白酶/磷酸酶抑制劑（碧云天）混合溶液、Loading Buffer（生工）、P38 一抗（巴傲得）、二抗（巴傲得）、離心管（15ml/50ml）、電刺激儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱（調(diào)至37℃、5%CO2飽和濕度）、超凈臺(tái)、顯微鏡、離心機(jī)、細(xì)胞刮刀、0.5 mlEP 管、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、電泳儀、轉(zhuǎn)印機(jī)、發(fā)光機(jī)（Bio-Rad Laboratories）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在細(xì)胞培養(yǎng)前做好高壓滅菌耗材以及試劑準(zhǔn)備工作，之后進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞換液、細(xì)胞傳代，待細(xì)胞傳代至實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞量，將細(xì)胞平均種于六孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行分化，分化經(jīng)過5至8天，細(xì)胞分化為肌管，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 電刺激

將電刺激儀分別調(diào)至10 V、23 V、40 V 的刺激強(qiáng)度，刺激時(shí)間40 min，頻率1 Hz、20 ms，隨后將電刺激板插入六孔板，確保電極接觸細(xì)胞培養(yǎng)基，將六孔板連帶電刺激板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，之后開始電刺激。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

每天在顯微鏡40倍物鏡下觀察分化期間的C2C12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，隨著分化時(shí)間的延長，細(xì)胞間距逐漸縮小，形態(tài)逐漸拉長形成肌管，彼此之間縱橫交錯(cuò)，相互融合。

1.3.3 Western Blot檢測(cè)P38蛋白變化

將六孔板中的蛋白經(jīng)過PBS 沖洗后刮下收于EP管中，加入適量細(xì)胞裂解液，經(jīng)過裂解、吸取上清、蛋白定量和蛋白變性后，用于WB檢測(cè)，最后使用Image Lab分析軟件對(duì)其進(jìn)行定量分析

1.3.4 比色法檢測(cè)CK活力

吸取細(xì)胞培養(yǎng)液測(cè)量CK 活力。依照肌酸激酶（CK）測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行，之后使用分光光度計(jì)在波長660 nm 下讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查找CK 酶活力。

1.3.5 ELISA法檢測(cè)LDH活性

吸取細(xì)胞培養(yǎng)液測(cè)量LDH活性。依照乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行，之后使用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測(cè)定吸光度值，經(jīng)過計(jì)算得出LDH活性。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。顯著水平取P＜0.05，極顯著水平取P＜0.01，作圖軟件采用Excel 和GraphPad Prism 6。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 電刺激強(qiáng)度對(duì)C2C12細(xì)胞P38蛋白表達(dá)的影響

如圖1所示，V1組細(xì)胞經(jīng)10 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激后，與C組相比，刺激結(jié)束后4 h、8 h、24 h后的H4、H8、H24 組細(xì)胞內(nèi)P38 蛋白含量呈極顯著性增加。

圖1 各組C2C12細(xì)胞內(nèi)P38蛋白相對(duì)含量

V2組細(xì)胞經(jīng)23 V、20 ms、1 Hz，40 min的電脈沖刺激后，與C 組相比，H0、H4 組細(xì)胞內(nèi)P38 蛋白含量呈顯著性增加；與H0組相比，H48組細(xì)胞內(nèi)P38蛋白含量呈顯著性下降；與H4 組相比，H2、H8、H48 組細(xì)胞內(nèi)P38含量顯著性下降。

V4組細(xì)胞經(jīng)40 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激后，與C組相比，H0組細(xì)胞內(nèi)P38蛋白含量呈極顯著性增加，H24、H48 組呈極顯著性下降，H8 組呈顯著性下降；與H0 組相比，H2、H4、H8、H24、H48 組細(xì)胞內(nèi)P38蛋白含量呈極顯著性下降。

2.2 電刺激強(qiáng)度對(duì)C2C12細(xì)胞CK活力的影響

如圖2所示，V4組細(xì)胞經(jīng)40 V、20 ms、1 Hz，40 min的電脈沖刺激后，與C 組相比，H0、H2、H4、H8 組細(xì)胞內(nèi)CK 活力呈極顯著性增加，H24 組呈顯著性增加；與H0 組相比，H8 組細(xì)胞內(nèi)CK 活力呈顯著性增加，H8 組呈顯著性下降，H24組呈極顯著性下降；與H8組相比，H2、H24 和H48 組細(xì)胞內(nèi)CK 活力呈極顯著性下降，H4組呈顯著性下降。

圖2 V4組C2C12細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)肌酸激酶（CK）活性

2.3 電刺激強(qiáng)度對(duì)C2C12細(xì)胞LDH活性的影響

如圖3所示，V4組細(xì)胞經(jīng)40 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激后，與C組相比，H0、H2組細(xì)胞內(nèi)LDH活性呈顯著性增加；與H0 組相比，H24 組呈極顯著性下降，H48 組呈顯著性下降；與H4 組相比，H24 組呈極顯著性下降，H48組呈顯著性下降。

圖3 V4組C2C12細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）活性

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別以10 V、23 V、40 V的電壓，及20 ms、1 Hz的頻率持續(xù)40 min刺激C2C12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在這3種電壓強(qiáng)度下，P38 蛋白均有不同程度的增加，證明這3 種電壓均可引起C2C12 細(xì)胞收縮。選擇增加幅度最大、恢復(fù)趨勢(shì)最穩(wěn)定的V4組進(jìn)行進(jìn)一步的損傷指標(biāo)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)40 V電脈沖刺激方案的刺激后，細(xì)胞液中的CK極顯著增加，LDH顯著增加，進(jìn)一步證明該電刺激方案不僅能夠引起細(xì)胞收縮，并且能夠?qū)е录?xì)胞損傷。綜上所述，用40 V、20 ms、1 Hz、40 min的電脈沖刺激C2C12細(xì)胞可以構(gòu)建骨骼肌離心運(yùn)動(dòng)損傷模型，且隨著指標(biāo)的恢復(fù)進(jìn)程發(fā)現(xiàn)，這種損傷在4～8 h內(nèi)得以恢復(fù)。

4 不足與展望

電刺激方案可變換與可探究的維度還有許多，本研究以電壓強(qiáng)度為變量，探究出了可以建立運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)細(xì)胞模型的電刺激方案，但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在不足，一方面，忽略了電刺激頻率的影響，未來可以設(shè)計(jì)更加精確的電脈沖刺激時(shí)間與刺激頻率的方案，進(jìn)而構(gòu)建出更多、更精確的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；另一方面，指?biāo)的選擇也有待進(jìn)一步優(yōu)化，排除不可控的代謝干擾，進(jìn)一步彌補(bǔ)組織培養(yǎng)和分離技術(shù)逐漸顯露的弊端，能夠有助于利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒鉀Q更多科學(xué)問題。