滕國(guó)杰 聶秀紅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,北京 100053)

既往研究表明,多種抗真菌藥物除了對(duì)真菌的殺滅作用外,還具有免疫調(diào)節(jié)作用,其可能通過(guò)宿主免疫細(xì)胞信號(hào)通路,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),影響免疫細(xì)胞對(duì)真菌的作用。兩性霉素B可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放[1],而氟康唑可以減少曲霉菌絲刺激后人全血IL-6、IL-8和TNF-α的釋放[2]。伏立康唑作為三唑類(lèi)抗真菌藥物,也具有免疫調(diào)節(jié)作用。Simitsopoulou等[3]的研究顯示伏立康唑通過(guò)TLR2的上調(diào)來(lái)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的促炎程序,Fidan等[4]發(fā)現(xiàn),伏立康唑作用下,白念珠菌刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞的IL-2、γ干擾素(interferon γ, IFN-γ)和IL-6水平顯著增加。在伏立康唑作用下,煙曲霉誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞更加顯著的炎癥基因表達(dá),包括干擾素-γ和TNF-α等基因的表達(dá)明顯增強(qiáng),釋放TNF-α、IL-1β明顯增加[5]。

伏立康唑濃度差異是否會(huì)對(duì)免疫狀況存在不同影響,目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。為此,本研究觀察THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞加入不同濃度伏立康唑及滅活煙曲霉菌液,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10分泌水平及細(xì)胞膜表面模式識(shí)別受體TLR2、TLR4、Dectin-1表達(dá)的變化,探討伏立康唑藥物濃度對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響差異。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞及試劑 人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株(human acute monocytic leukemia cell line, THP-1細(xì)胞株)來(lái)源于中科院細(xì)胞庫(kù),RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco-Invitrogen 公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(美國(guó)Gibco-Invitrogen 公司),青霉素-鏈霉素-二抗溶液(美國(guó)Gibco-Invitrogen 公司),肉豆蔻酸佛波醇乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)(中國(guó)碧云天試劑公司),伏立康唑(美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(美國(guó)Sigma公司)。

煙曲霉菌液的制備 煙曲霉感染患者的分離株,接種在沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱下培養(yǎng)5 d,以形成分生孢子。分生孢子通過(guò)70 nm細(xì)胞篩進(jìn)行過(guò)濾,使用RPMI 1640重懸分生孢子,在37 ℃和5%CO2的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育,12 h部分分生孢子形成菌絲,進(jìn)行收集,將孵育后的煙曲霉分生孢子和菌絲形成的菌液在玻璃管中于120 ℃高壓滅活30 min[6-7]。

伏立康唑藥液配置 伏立康唑粉劑微量電子天平稱(chēng)取10 mg,無(wú)菌操作下溶解于二甲基亞砜,國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用[8],加入無(wú)內(nèi)毒素蒸餾水補(bǔ)足至1 mL,進(jìn)行分裝,使用時(shí)加入完全培養(yǎng)基,倍比稀釋至所需濃度。

1.2 方法

THP-1來(lái)源的細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞 文獻(xiàn)報(bào)道,THP-1細(xì)胞使用100 ng/mL佛波酯(PMA)誘導(dǎo)48 h分化為巨噬細(xì)胞[9],具有與人外周血單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞類(lèi)似的功能[10]。受不同微環(huán)境的影響,使用PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞為巨噬細(xì)胞,該細(xì)胞可以向M1表型進(jìn)一步分化,也可以向M2表型進(jìn)一步分化[11]。用100 ng/mL PMA在37 ℃誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞48 h,倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞變化。培養(yǎng)48 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變,細(xì)胞由懸浮細(xì)胞改為貼壁、并出現(xiàn)聚集、偽足伸出。誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞形成巨噬細(xì)胞。將細(xì)胞加入0.02%乙二胺四乙酸溶液,使細(xì)胞脫離貼壁,離心收集。

CCK-8法檢測(cè)不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活的煙曲霉菌液對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的毒性 THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)形成的巨噬細(xì)胞,以每孔100 μL培養(yǎng)液中包含5×103個(gè)細(xì)胞的濃度,接種于96孔培養(yǎng)板。每個(gè)孔加入濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的伏立康唑后,再加入濃度為5×102個(gè)/mL的滅活煙曲霉液,并且設(shè)置僅含有THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞和滅活煙曲霉菌液的對(duì)照孔。分別37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6、12、24 h。之后每孔加入10 μL的CCK-8溶液培養(yǎng)2 h后,用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液體外刺激THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞 每孔1 mL培養(yǎng)基中包含1×106個(gè)THP-1細(xì)胞形成的巨噬細(xì)胞,接種于2個(gè)6孔培養(yǎng)板。孵育過(guò)夜。在培養(yǎng)板中,第1孔作為空白孔,其余各孔中加入終濃度為105個(gè)/mL的滅活煙曲霉菌液之后,再加入濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的伏立康唑。并且設(shè)置僅含有THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞和滅活煙曲霉菌液的對(duì)照孔,在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h[12]。培養(yǎng)后,收集培養(yǎng)板中每孔的上清液測(cè)定培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10的水平。收獲貼壁的巨噬細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的TLR2、TLR4、Dectin-1表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

流式細(xì)胞檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞表面TLR2、TLR4、Dectin-1表達(dá) 流式管中加入熒光標(biāo)記抗體:BD Pharmingen[TM]PE Mouse Anti-Human CD369 (Clec7A)(Dectin-1),BD Horizon[TM]BB515 Mouse Anti-Human CD282(TLR2),BD OptiBuild[TM]BV421 Mouse Anti-Human CD284(TLR4),各5 μg,加入待檢測(cè)的細(xì)胞,同型對(duì)照管加入同型抗體:BD Pharmingen[TM]PE Mouse IgG2a κ Isotype Control,BD Horizon[TM]BB515 Mouse IgG1 κ Isotype Control, BD Horizon[TM]BV421 Mouse IgG2a κ Isotype Control,各5 μg,震蕩混勻,應(yīng)用BD FACS Canto型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面TLR2、TLR4、Dectin-1的表達(dá)檢測(cè)。通過(guò)Flowjo軟件進(jìn)行分析,計(jì)算表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件(IBM, Armonk, NY, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間的比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)表示,組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 THP-1誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞

THP-1細(xì)胞呈類(lèi)圓形,在完全培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)。加入100 ng/mL的PMA后24 h后完全貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)改變;48 h后,細(xì)胞呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞特征、表現(xiàn),形態(tài)不規(guī)則,胞體增大、胞漿疏松出現(xiàn)空泡、細(xì)胞表面伸出偽足,包膜周?chē)梢?jiàn)突起,形成THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞,見(jiàn)圖1。

圖1 加入100 ng/mL的PMA刺激48 h THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞(×40) 圖2 不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的毒性:作用12 h:* P<0.05,作用24 h:# P<0.01(與未加入伏立康唑的對(duì)照組相比) 圖3 不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液刺激THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10濃度。* P<0.05,# P<0.01(與IAFL組相比) 圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞膜表面受體表達(dá)Fig.1 THP-1 cells were stimulated with 100 ng/mL PMA for 48 h and differentiated into macrophages (×40) Fig.2 Toxicity of voriconazole combined with IAFL to THP-1-derived macrophages: 12 h: * P<0.05, 24 h: # P<0.01 (compared with the control group without voriconazole) Fig.3 Levels of TNF-α, IL-1β and IL-10 in culture supernatant of different concentrations of voriconazole combined with IAFL stimulated THP-1-derived macrophages, * P<0.05, # P<0.01 (compared with IAFL group) Fig.4 The expression of THP-1-derived macrophage membrane surface receptor was detected by flow cytometry

2.2 不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的毒性

THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞中加入不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液,分別作用6、12、24 h,使用CCK-8法計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力,繪制成活力曲線,見(jiàn)圖2。

結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,作用于6 h,在伏立康唑濃度為64 μg/mL時(shí),對(duì)細(xì)胞抑制作用為4.30%±6.1%(P>0.05),作用12 h,伏立康唑濃度64 μg/mL時(shí),顯示19.9%±1.6%的抑制作用(P<0.05);作用24 h后,伏立康唑濃度8 μg/mL及64 μg/mL時(shí),顯示23.1%±7.0%和28.7%±8.1%的抑制作用(P均<0.01)。結(jié)果表明,隨時(shí)間延長(zhǎng)和伏立康唑濃度升高,伏立康唑?qū)HP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞毒性作用顯示出隨時(shí)間和劑量依賴(lài)的增強(qiáng)。

2.3 不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液體外刺激THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10濃度變化

文獻(xiàn)報(bào)道,人巨噬細(xì)胞細(xì)胞在受到外界刺激后,TNF-α等炎癥因子釋放在6 h內(nèi)達(dá)到峰值[12],本研究最終選擇6 h作為細(xì)胞功能研究的時(shí)間。

在對(duì)照組中(LAFL組:僅含THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞和滅活煙曲霉菌液),培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β濃度分別(471.94±56.51) pg/mL和(110.56±15.04) pg/mL,加入不同濃度伏立康唑后,上清液中TNF-α、IL-1β濃度逐漸升高,在伏立康唑濃度4～64 μg/mL之間時(shí), TNF-α、IL-1β濃度較對(duì)照組出現(xiàn)顯著升高(P均<0.05)。在伏立康唑的濃度為16 μg/mL和8 μg/mL時(shí),TNF-α和IL-1β濃度分別達(dá)到峰值,為(728.32±113.58) pg/mL和(210.08±41.39) pg/mL。不同伏立康唑濃度組之間IL-10濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3。

2.4 不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液體外刺激THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞膜表面TLR2、TLR4、Dectin-1表達(dá)

在對(duì)照組中(LAFL組:僅含THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞和滅活煙曲霉菌液),流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜表面模式識(shí)別受體TLR2、TLR4的平均熒光強(qiáng)度位于較低水平。加入不同濃度伏立康唑后,細(xì)胞膜表面TLR2、TLR4的平均熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),在伏立康唑濃度為1～64 μg/mL時(shí),TLR2、TLR4的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)(P<0.05),在伏立康唑濃度為4 μg/mL時(shí),細(xì)胞膜表面TLR2、TLR4的平均熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值。模式識(shí)別受體Dectin-1對(duì)伏立康唑濃度變化更為敏感。伏立康唑濃度在0.5～64 μg/mL時(shí),Dectin-1的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著升高(P<0.01),在伏立康唑濃度為1 μg/mL時(shí),Dectin-1的平均熒光強(qiáng)度即達(dá)到峰值,見(jiàn)圖4、5。

圖5 不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液刺激THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞膜表面TLR2、TLR4、Dectin-1平均熒光強(qiáng)度。* P<0.05,# P<0.01(與IALF組相比)Fig.5 MFI of TLR2, TLR4 and Dectin-1 on the membrane surface of THP-1-derived macrophages stimulated by different concentrations of voriconazole combined with IAFL. * P <0.05, # P <0.01 (compared with IAFL group)

3 討 論

對(duì)于曲霉感染患者而言,指南推薦長(zhǎng)期口服抗真菌藥物治療,以防止曲霉感染的復(fù)發(fā)。侵襲性肺曲霉病指南推薦持續(xù)治療6～12周[13],慢性肺曲霉病指南推薦至少口服治療6個(gè)月,對(duì)于存在持續(xù)性免疫抑制的患者,則可能需要終身治療[14]。在如此長(zhǎng)時(shí)間里,藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響尤為明顯。

不同組織中伏立康唑的濃度不同,伏立康唑在肺泡上皮襯液中的濃度最高,約為血漿濃度的11倍[15];腦組織中的濃度為血漿濃度的2～3倍[16];房水中的濃度僅僅為血漿濃度的0.53倍[17]。指南推薦伏立康唑血藥濃度應(yīng)維持在0.5～6 μg/mL,故而推測(cè)在肺泡上皮襯液中的濃度約5.5～66 μg/mL,房水中的濃度為0.25～3 μg/mL。在不同組織中,伏立康唑的濃度范圍是0.25～66 μg/mL。本研究觀察了濃度為0.25～64 μg/mL時(shí)伏立康唑?qū)HP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。

TNF-α、IL-1β均為促炎因子,在抗曲霉感染中起重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示,加入滅活煙曲霉菌液后,THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β濃度顯著升高,在滅活煙曲霉菌液存在情況下,伏立康唑的濃度為4～64 μg/mL時(shí),刺激THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β較對(duì)照組顯著升高(P<0.05),提示伏立康唑誘導(dǎo)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞促炎因子的分泌,但這種分泌的增加并不隨伏立康唑濃度的倍增而持續(xù)遞增,在伏立康唑濃度為8 μg/mL或16 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。

IL-10是一種有效的抗炎和免疫抑制細(xì)胞因子,能降低單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性,抑制單核細(xì)胞對(duì)曲霉菌絲的氧化爆發(fā)和抗真菌活性[19]。有研究報(bào)道,在伏立康唑作用下,暴露于曲霉的THP-1細(xì)胞IL-10的基因表達(dá)無(wú)變化[5]。本研究結(jié)果同樣表明,不同濃度伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液,對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10濃度無(wú)顯著影響(P>0.05)。

參與曲霉識(shí)別的模式識(shí)別受體主要是TLR2、TLR4和Dectin-1,其中細(xì)胞膜表面Dectin-1可以特異性識(shí)別真菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖[20-24]。有研究表明,伏立康唑通過(guò)上調(diào)固有免疫系統(tǒng)中模式識(shí)別受體TLR2 mRNA表達(dá),增強(qiáng)吞噬細(xì)胞促炎程序,促進(jìn)炎癥因子TNF-α的分泌[3]。本研究結(jié)果表明,在滅活煙曲霉菌液存在情況下,濃度為1～64 μg/mL伏立康唑可以刺激THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞膜表面TLR2、TLR4和Dectin-1表達(dá)。推測(cè)伏立康唑可以通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞膜表面模式識(shí)別受體TLR2、TLR4和Dectin-1的表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)宿主對(duì)曲霉的識(shí)別,進(jìn)而殺滅曲霉。但這種表達(dá)的增強(qiáng)同樣不隨伏立康唑濃度的倍增而持續(xù)遞增,在伏立康唑濃度為4 μg/mL、4 μg/mL、1 μg/mL時(shí),TLR2、TLR4和Dectin-1的表達(dá)分別達(dá)到峰值。

出現(xiàn)這種情況的原因,推測(cè)與高濃度的伏立康唑?qū)?xì)胞的毒性作用有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道,伏立康唑濃度達(dá)100 μg/mL以上時(shí)會(huì)降低小鼠成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)[25]。伏立康唑濃度≥100 μg/mL時(shí)增加人角膜內(nèi)皮損傷的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示,濃度64 μg/mL伏立康唑聯(lián)合滅活煙曲霉菌液作用于巨噬細(xì)胞12～24 h,表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞抑制作用,證實(shí)高濃度伏立康唑?qū)HP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞具有的毒性作用。推測(cè)伏立康唑濃度高達(dá)64 μg/mL時(shí)導(dǎo)致THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞免疫活性的下降,引起炎癥因子釋放減少以及細(xì)胞膜表面模式識(shí)別受體表達(dá)減少。

本研究結(jié)果提示,對(duì)于需要長(zhǎng)期口服伏立康唑治療的曲霉病患者,適當(dāng)濃度的伏立康唑可能更有利于促進(jìn)患者巨噬細(xì)胞的免疫活性。宿主的免疫機(jī)制與曲霉的感染之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜,涉及多種細(xì)胞及不同的作用機(jī)制,本研究?jī)H進(jìn)行了初步探討。進(jìn)一步對(duì)相關(guān)免疫細(xì)胞及其機(jī)制進(jìn)行深入研究,將為臨床工作提供更加有力的理論依據(jù)。