李松哲 孫悅 蔡凌云 孫陽(yáng)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,哈爾濱 150040)

氟康唑作為一種廣譜抗真菌藥物[1],在體外對(duì)各種真菌酵母菌有效[2]?；谶@一特性,氟康唑被認(rèn)為可以作為防治細(xì)胞污染的手段[3],并有觀點(diǎn)指出在5%～10%用量時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成明顯損害[3-5]。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染現(xiàn)象雖然偶發(fā),但由于感染來(lái)源及菌種眾多,一旦出現(xiàn)便較為棘手,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,尤其對(duì)于貴重細(xì)胞常采取保守的補(bǔ)救措施。但是,隨著研究的進(jìn)一步深入,有相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為氟康唑可能對(duì)細(xì)胞具有遺傳毒性/致突變的作用[6],不僅如此,根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的用藥指導(dǎo),氟康唑具有肝毒性風(fēng)險(xiǎn),且對(duì)于腎功能不全的患者,應(yīng)當(dāng)減少氟康唑的使用劑量。這意味著氟康唑可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷而影響實(shí)驗(yàn)的客觀性,本文將通過(guò)虛擬篩選技術(shù),使用3種細(xì)胞株驗(yàn)證氟康唑?qū)?xì)胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞購(gòu)自FuHeng(上海)。人胚肝HHL-5細(xì)胞和人胚腎HEK-293細(xì)胞購(gòu)自O(shè)two Biotech (深圳)。DMEM高糖和1640培養(yǎng)液購(gòu)自BOSTER。氟康唑氯化鈉注射液購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒和Hoechst 33342染色液購(gòu)自MeilunBio。碘化丙啶(PI)購(gòu)自Sigma。RNAeasyTMAnimal RNA Isolation Kit with Spin Column和BeyoRTTMIII First Strand cDNA Synthesis Master Mix (5X)購(gòu)自Beyotime。ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自Vazyme。引物合成購(gòu)自Comate Bioscience Co.,Ltd,引物序列見(jiàn)表1。

1.2 虛擬篩選實(shí)驗(yàn)

潛在靶點(diǎn)的收集 根據(jù)FDA對(duì)氟康唑的用藥原則,推測(cè)可能損傷的靶點(diǎn)范圍,以“hepatotoxicity”“nephrotoxicity”和“cytotoxicity”分別作為關(guān)鍵詞,挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)(2022年1月下載)涉及毒性損傷的潛在靶點(diǎn),所搜集的靶點(diǎn)僅保留相關(guān)性得分≥30的信息。

構(gòu)建與分析“毒性靶點(diǎn)”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò) 為進(jìn)一步明晰核心毒性靶點(diǎn),將3次檢索所得的潛在靶點(diǎn)取交集,通過(guò)Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/people)完成hepatotoxicity、nephrotoxicity和cytotoxicity的交集處理,并繪制韋恩圖。再將交集靶點(diǎn)提交至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[7](https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型,“Organism”設(shè)定為“Homo sapiens”,置信度設(shè)為0.4,得到PPI網(wǎng)絡(luò)。再將此網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入CytoScape3.70中分析,根據(jù)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的“Combined degree”值大小,通過(guò)對(duì)可視化參數(shù)的調(diào)整篩選核心潛在蛋白質(zhì)。

氟康唑與核心靶點(diǎn)蛋白的搜集 通過(guò)Zinc15數(shù)據(jù)庫(kù)[8]檢索氟康唑分子結(jié)構(gòu),下載mol2文件。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)明確潛在的核心靶點(diǎn),通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/) 下載這些靶基因?qū)?yīng)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)。

分子對(duì)接軟件及前期準(zhǔn)備 分子對(duì)接軟件采用autodockTools 1.5.6中的vina模塊[9],其中根據(jù)vina報(bào)道,經(jīng)vina處理的分子-靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果中,均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)<2的比例高達(dá)78%,RMSD<2被認(rèn)為對(duì)接方案可行,故通過(guò)vina的分子對(duì)接預(yù)測(cè)可以被認(rèn)為可行性、準(zhǔn)確性較高。根據(jù)之前的對(duì)接辦法[10],將氟康唑小分子和靶點(diǎn)蛋白通過(guò)去除水分子,加氫進(jìn)行預(yù)處理,采用半柔性及盲性對(duì)接法實(shí)行預(yù)測(cè),其余參數(shù)均采用默認(rèn)值,得到預(yù)測(cè)結(jié)果,因本次實(shí)驗(yàn)最終采取qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,故忽略其生成氫鍵等可行性前提,結(jié)果僅取最小結(jié)合能作為參考,且可視化對(duì)接結(jié)果。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞和人胚腎HEK-293細(xì)胞使用含10%胎牛血清與1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),人胚肝HHL-5細(xì)胞使用含10%胎牛血清與1%青/鏈霉素的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。3種細(xì)胞使用25 cm2培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代處理,將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液分瓶傳代,傳代后放入恒定37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

分別將3種細(xì)胞等量鋪于96孔板上,每孔體積100 μL,然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育貼壁12 h。貼壁后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加藥處理,設(shè)置空白組、對(duì)照組與給藥組,給藥組加5%與10%的氟康唑,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,待完成后按每孔10 μL加入CCK-8試劑,暗孵育1～1.5 h,置于酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度,酶標(biāo)儀參數(shù)為37 ℃環(huán)境,450 nm波長(zhǎng)檢測(cè),得到數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)OD值,依據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率=[(對(duì)照孔吸光度-給藥孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.5 Hoechst 33342/PI雙染實(shí)驗(yàn)

配置Hoechst 33342母液為1 mg/mL,PI母液為2 mg/mL。分別制備3種細(xì)胞的細(xì)胞懸液,每孔細(xì)胞配懸液加至1 mL,放入培養(yǎng)箱培育過(guò)夜。次日更換培養(yǎng)液并加入5%與10%的氟康唑持續(xù)24 h,待完成后棄上清,使用PBS清洗3次,最后每孔加入1 mL的PBS、5 μL的Hoechst 33342和2.5 μL的PI,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育20 min,于熒光顯微鏡下觀察,1 h內(nèi)完成觀察拍照。

1.6 總RNA提取和qRT-PCR檢測(cè)

設(shè)置對(duì)照組與給藥組,給藥組加10%氟康唑。作用24 h后,用離心柱提取對(duì)照組和給藥組的總RNA。使用BeyoRTTMⅢ First Strand cDNA Synthesis Master Mix (5X)按照說(shuō)明將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix配置擴(kuò)增反應(yīng)體系,PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃持續(xù)15 s,56 ℃處理15 s并在72 ℃下延伸25 s。以GAPDH為內(nèi)參基因檢測(cè)目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品重復(fù)3次,基因的相對(duì)表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔct計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行,通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 虛擬篩選實(shí)驗(yàn)

潛在靶點(diǎn)的獲取 根據(jù)相關(guān)度篩選后,以“hepatotoxicity”關(guān)鍵詞共獲靶點(diǎn)633個(gè),以“nephrotoxicity”關(guān)鍵詞共獲靶點(diǎn)553個(gè),以“cytotoxicity”關(guān)鍵詞共獲靶點(diǎn)8581個(gè)。

“毒性靶點(diǎn)”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將3個(gè)關(guān)鍵詞篩選的靶點(diǎn)取交集,并通過(guò)Venn網(wǎng)站繪制韋恩圖,見(jiàn)圖1A。得到毒性共同靶點(diǎn)216個(gè)。再將相同靶點(diǎn)提交至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析,輸出數(shù)值使用CytoScape 3.70進(jìn)行可視化分析,見(jiàn)圖1B。網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)模型共包含節(jié)點(diǎn)210個(gè),表示預(yù)測(cè)的作用靶標(biāo),邊線3430條,表示蛋白之間的相互作用關(guān)系。節(jié)點(diǎn)的顏色越深,圓圈越大,代表連接度的值越大?？梢暬蟀l(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素(IL)-6、抑癌基因(TP53)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)以及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)這6個(gè)靶標(biāo)的連接度值最大,表明這6個(gè)靶標(biāo)在本次模型中關(guān)聯(lián)度最強(qiáng),所以可認(rèn)為這6個(gè)靶標(biāo)是氟康唑潛在的毒性核心靶標(biāo)。

對(duì)接靶點(diǎn)的收集與結(jié)果 根據(jù)“combined degree”收集排名前6的核心靶點(diǎn),將氟康唑與核心靶點(diǎn)逐一對(duì)接,結(jié)合自由能單位為kcal·mol-1,靶點(diǎn)PDB編號(hào)、分辨率及對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表2。依據(jù)所得數(shù)據(jù)分別可視化核心靶點(diǎn)的最優(yōu)對(duì)接數(shù)據(jù),利用VMD軟件可視化對(duì)接構(gòu)象疊合圖,使用蛋白質(zhì)配體相互作用圖譜(protein-ligand interaction profiler, PLIP)對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析[11],核心靶點(diǎn)的對(duì)接展示見(jiàn)圖2。

表2 靶蛋白編號(hào)及對(duì)接結(jié)果Tab.2 Target protein numbers and docking results

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在5%和10%的藥物濃度下對(duì)3種細(xì)胞進(jìn)行了CCK8檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖3A～C,總體來(lái)看,氟康唑?qū)MMC-7721細(xì)胞和HHL-5細(xì)胞具有抑制作用,抑制率在10%左右,而對(duì)HEK-293細(xì)胞則表現(xiàn)出促增殖作用。當(dāng)藥物濃度在5%時(shí),對(duì)SMMC-771細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的抑制/增殖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),對(duì)HHL-5細(xì)胞具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)藥物濃度在10%時(shí),對(duì)3種細(xì)胞的抑制/增殖皆有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 Hoechst 33342/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

熒光染色結(jié)果見(jiàn)圖4。鏡下觀察氟康唑在不同濃度下作用細(xì)胞24 h后的形態(tài)學(xué)變化,其中凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)光,晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色和強(qiáng)藍(lán)色熒光。由圖可見(jiàn),SMMC-7721細(xì)胞與HHL-5細(xì)胞在氟康唑作用下不同程度的表現(xiàn)出凋亡/壞死細(xì)胞增加,其中,細(xì)胞密度隨濃度的增加呈遞減趨勢(shì),而5%濃度下的凋亡細(xì)胞高于10%濃度,可能是由于高濃度下能更快誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而被吞噬導(dǎo)致的。而HEK-293細(xì)胞的凋亡/壞死細(xì)胞略有增多,但總體無(wú)明顯改變。

圖4 熒光染色結(jié)果Fig.4 Fluorescence staining results

2.4 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞基因mRNA表達(dá)

在10%藥物濃度下對(duì)3種細(xì)胞進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè),繪制火山圖,見(jiàn)圖3D～F。其中灰色代表表達(dá)不顯著。綠色代表log2 fold change差異顯著,log2 fold change為對(duì)照組與給藥組mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異比較,負(fù)值為藥物起到抑制表達(dá)作用,正值為起到促進(jìn)表達(dá)作用。藍(lán)色代表P值顯著。紅色代表log2 fold change和P值皆顯著。由圖可知,通過(guò)對(duì)潛在核心毒性靶點(diǎn)的qRT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)10%的氟康唑會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的mRNA表達(dá)改變,這種基因水平上的干預(yù)可能對(duì)癌細(xì)胞更為敏感。在靶點(diǎn)干預(yù)上,尤其對(duì)IL1-β、IL-6和EGFR有更明顯的調(diào)控作用。

3 討 論

虛擬篩選技術(shù)是提高藥物命中靶點(diǎn)概率的常用方法,能夠降低實(shí)驗(yàn)成本,更快的篩選藥物作用目標(biāo)[12]。目前,有證據(jù)認(rèn)為10%的氟康唑能夠用來(lái)防治細(xì)胞污染,且不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害,但該結(jié)論缺乏分子層面的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。根據(jù)FDA的報(bào)道,氟康唑具有肝毒性[13],藥代動(dòng)力學(xué)也受腎功能不全的顯著影響[14-15],所以,無(wú)差別地用來(lái)防治細(xì)胞污染可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的客觀性。

本次實(shí)驗(yàn)利用虛擬篩選辦法,分別對(duì)3種細(xì)胞使用了5%和10%濃度的氟康唑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟康唑在5%的濃度下就已經(jīng)對(duì)人胚肝HHL-5細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的抑制作用(P<0.01),在10%濃度下對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人胚肝HHL-5細(xì)胞和人胚腎HEK-293細(xì)胞的增殖/抑制具有明顯的干預(yù)作用(P<0.01),并且會(huì)影響mRNA的表達(dá)水平。其中氟康唑?qū)MMC-7721細(xì)胞和HHL-5細(xì)胞具有抑制作用,抑制率在10%左右,而對(duì)HEK-293細(xì)胞具有促增殖作用,熒光染色結(jié)果也符合細(xì)胞活性檢測(cè)趨勢(shì)。在對(duì)mRNA的檢測(cè)上,對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的基因調(diào)控更加明顯,約占67%;而對(duì)HHL-5細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的基因調(diào)控較少,各占33%左右。

結(jié)果顯示氟康唑具有普遍調(diào)控作用的核心靶點(diǎn)為IL1-β、IL-6和EGFR。IL1-β由各種類型的細(xì)胞分泌產(chǎn)生,能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生與免疫反應(yīng)[16]。IL-6是具有多效性的細(xì)胞因子,抗IL-6療法可減少炎癥、肝臟急性期蛋白和貧血,并具有抗血管生成作用[17]?？傊甀L1-β[18]和IL-6[19]參與多條炎癥和癌癥通路[20]。Poursheikhani等[21]發(fā)現(xiàn)EGFR能夠通過(guò)MEKK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑驅(qū)動(dòng)上皮性卵巢癌細(xì)胞的化學(xué)抗性,進(jìn)而起到逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用。Moon等[22]發(fā)現(xiàn)含有WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子1與EGFR信號(hào)通路的協(xié)同激活能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌和膽管癌。除此之外,EGFR也是非小細(xì)胞肺癌[23]、乳腺癌[24]等癌種的經(jīng)典治療靶點(diǎn)。由此認(rèn)為,氟康唑并不適合廣泛的應(yīng)用于治療細(xì)胞污染,尤其對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言,可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性情況,降低實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。

所以,當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞污染時(shí),應(yīng)盡量將污染細(xì)胞舍棄處理。若要進(jìn)行除菌操作,可選用低速離心法或增加三抗處理,若要通過(guò)氟康唑進(jìn)行除菌操作,應(yīng)摸索適合于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的毒性臨界濃度,并比對(duì)除菌前后細(xì)胞靶點(diǎn)的表達(dá)水平,盡量避免影響實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

4 結(jié) 論

10%的氟康唑并不適合作為防治細(xì)胞污染的安全劑量,對(duì)于某些細(xì)胞具有一定的抑制作用,并且能夠調(diào)控某些靶點(diǎn)mRNA水平的表達(dá)。