虞岱瑤 馮文莉

(山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院皮膚性病科,太原 030001)

白念珠菌(Candidaalbicans)是人類最常見的真菌病原體之一[1],通常寄生于個體的皮膚和/或黏膜表面,免疫功能正常的機體很少出現(xiàn)念珠菌播散性疾病,但惡性腫瘤、器官移植、醫(yī)療器械植入和廣譜抗生素的長期使用等,可增加真菌感染的易感性和發(fā)病率[2],如導致念珠菌血癥,嚴重危害人們的健康[3]。目前,念珠菌病的治療主要依靠抗真菌藥物,但隨著抗菌藥物的廣泛使用和白念珠菌生存環(huán)境的改變,白念珠菌的發(fā)病率和耐藥性逐年增加,已成為臨床治療的一大難題[4]。 因此,探索白念珠菌的致病機制,尋找新的抗真菌藥物靶點刻不容緩。本文旨在闡述和概括對轉(zhuǎn)錄因子Stp1和Stp2在白念珠菌致病機制中的研究進展,以便為白念珠菌的治療提供新的理論基礎(chǔ)和藥物靶點。

1 概 述

1.1 Stp1

Stp1是一種非活性前體,是正確利用肽所必需的,在細胞外氨基酸存在的情況下被蛋白水解激活,但它對于氨基酸的分解代謝沒有影響。Stp1控制非常有限的一組基因,包括多胺轉(zhuǎn)運蛋白基因(OPT1、DUR35)、鐵還原酶基因(CFL2)、金屬蛋白酶基因(APE2)和核苷轉(zhuǎn)運蛋白基因(NUP32)[5-6]。

在酵母細胞中轉(zhuǎn)錄因子Stp1參與調(diào)控氮源代謝,包括調(diào)控SPS氨基酸感應通路和雷帕霉素(rapamycin,RAPA)結(jié)合蛋白TOR通路,并且Stp1的水平同時會影響到這兩條通路。在SPS氨基酸感應通路中,Stp1被SPS復合物[6]激活,這是一種由Ssy1、Ssy5和Ptr3組成的跨膜氨基酸傳感器,通過對氨基末端結(jié)構(gòu)域的蛋白水解切割導致轉(zhuǎn)位[7]。由于白念珠菌具有Gln3和Gat1的同源物,因此和釀酒酵母一樣,STP1的氮調(diào)節(jié)取決于GATA 因子Gln3和Gat1,它們對作為其氮源的硫酸銨的存在十分敏感,是在各種氮源上最佳生長所必需的。

胞外蛋白質(zhì)分解代謝所需的編碼蛋白基因的表達可被白念珠菌中經(jīng)過加工的Stp1激活,包括分泌型天冬氨酸蛋白酶SAP2,這些酶可能通過降解組織屏障、促進黏附、消化宿主蛋白以供給營養(yǎng)以及破壞免疫球蛋白和補體蛋白等宿主防御系統(tǒng),使真菌進入宿主致病,其中是最重要的毒力因子[8]。STP1同SAP2一樣,均受到氮分解代謝物抑制的調(diào)節(jié),SAP2的氮分解代謝抑制是通過調(diào)節(jié)STP1的表達來介導的,最終造成白念珠菌的毒力致病[9]。此外,Stp1可在氮源的誘導下發(fā)生自噬,造成的SAP2高表達,促進白念珠菌生物膜的形成,參與調(diào)控對宿主的致病。

1.2 Stp2

轉(zhuǎn)錄因子Stp2能激活氨基酸滲透酶基因(AAP)的表達,當氨基酸以低濃度存在時,Stp2是唯一被加工的因子,是環(huán)境堿化和菌絲生長所必需的。Stp2具有更廣泛的調(diào)節(jié)子,部分依賴于Ssy1氨基酸傳感器(氨基酸攝取和分解代謝),部分依賴于Ssy1(與絲狀生長相關(guān)的基因,包括調(diào)控因子UME6和SFL2)[5-6]。

在白念珠菌中,Stp2是氨基酸作為碳源的利用和分解代謝以及由此產(chǎn)生的氨排出所必需的,SPS系統(tǒng)調(diào)節(jié)Stp2負調(diào)控域的蛋白水解切割,Stp2的Ssy5依賴性處理發(fā)生在SPS傳感器信號傳導的較低水平,缺失氨基末端核排斥結(jié)構(gòu)域的STP2基因可以抑制SPS突變體的生長和pH中和缺陷[10]。

此外,Stp2對白念珠菌生物膜的形成很重要,它有助于黏附和誘導形態(tài)發(fā)生,并介導成熟生物膜中的營養(yǎng)適應和細胞壽命。在生物膜發(fā)育的過程中,Stp2調(diào)節(jié)黏附和胚管形成,對生物膜的啟動至關(guān)重要[11]。STP2的缺失使得由饑餓誘導的菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)變更快,同時還增加了RAPA敏感性,因此Stp2是黏附非生物表面所必需的[12]。

1.3 Sap2

白念珠菌能分泌多種水解酶,包括能消化細胞外蛋白的分泌型天冬氨酸蛋白酶(Saps)。Saps由10個相關(guān)基因家族(SAP1-SAP10)編碼。SAP活性產(chǎn)物主要是寡肽,它被一個由8個成員組成的基因家族(OPT1-OPT8)編碼的寡肽轉(zhuǎn)運體家族(Opts)轉(zhuǎn)運到細胞中,SAP基因根據(jù)生長條件受到差異性調(diào)節(jié),并且在優(yōu)質(zhì)氮源和高濃度氨基酸存在的情況下被抑制[13]。Saps在促進致病性生長方面有多種作用,Saps催化的宿主細胞膜蛋白水解促進黏附和組織侵襲,它還參與中和宿主防御系統(tǒng)的細胞和分子,從而使白念珠菌細胞能夠避免或抵抗宿主攻擊[14]。

其中,Sap2是關(guān)鍵毒力因子,在酸性條件下高度表達,可通過降解黏膜表面的大分子蛋白為自身生長提供營養(yǎng),同時增加白念珠菌黏附和侵入宿主的能力。當前,Sap2已被廣泛研究,缺乏這種蛋白質(zhì)的念珠菌細胞表現(xiàn)出感染哺乳動物宿主的能力降低。它是在蛋白質(zhì)作為唯一氮源的情況下在體外培養(yǎng)時最豐富的分泌蛋白質(zhì),使用蛋白酶抑制劑胃酶抑素A的研究表明[15],在白念珠菌中的表達也通過正反饋機制調(diào)節(jié),Sap2的整體結(jié)構(gòu)符合以胃蛋白酶為代表的經(jīng)典天冬氨酸蛋白酶折疊。

此外,Sap2具有廣泛的底物特異性,它可以切割的蛋白質(zhì)種類繁多,這種廣泛的底物特異性在念珠菌的發(fā)病機制中起到了重要的作用,Sap2會降解許多人類蛋白質(zhì),包括黏蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白、許多免疫系統(tǒng)分子、內(nèi)皮細胞蛋白以及凝血因子,這不僅可以為生長提供必需的氮,而且還可以通過去除宿主屏障來增強對宿主組織的附著、定植和滲透,大大增強了白念珠菌的致病能力[16-17]。

2 與Stp1相關(guān)的表達調(diào)控

2.1 SPS氨基酸感應通路調(diào)控Stp1與Stp2

釀酒酵母能夠通過質(zhì)膜中的傳感器評估胞外營養(yǎng)物的可用性,這些營養(yǎng)吸收系統(tǒng)的誘導表達需要一個質(zhì)膜定位的傳感器復合物,稱為SPS傳感器。該系統(tǒng)由SSY1、PTR3和SSY5三種基因產(chǎn)物組成。Ssy1是一種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白同源物,可感知細胞外環(huán)境中的氨基酸,但不具有轉(zhuǎn)運活性[18];Ptr3是一種外周膜相關(guān)蛋白,它介導酪蛋白激酶 I (CKI)與Ssy5(糜蛋白酶樣絲氨酸內(nèi)切蛋白酶)的相互作用[19],這種內(nèi)切蛋白酶在抑制結(jié)構(gòu)域中過度磷酸化,催化具有活性片段的蛋白水解釋放;Ssy5切割兩個轉(zhuǎn)錄因子Stp1和Stp2的核排斥域,促進它們移位到細胞核[20]。

SPS傳感器作為配體激活的外部氨基酸受體,控制兩個轉(zhuǎn)錄因子Stp1和Stp2的核定位。Stp1和Stp2以嚴格依賴SPS傳感器的方式進行,Stp1和Stp2的全長形式由于其N端末端調(diào)節(jié)域中存在細胞質(zhì)保留信號而定位于胞漿,這些保留信號可以有效阻止未處理的全長形式進入細胞核。在細胞外氨基酸充足時,Stp1通過內(nèi)蛋白溶解去除N端細胞質(zhì)保留基序激活,其由Ssy5的蛋白水解活性介導,使其進入細胞核并激活AAP的轉(zhuǎn)錄[9]。而這些轉(zhuǎn)錄因子與氨基酸控制基因啟動子中不同的上游激活序列 (UASaa) 結(jié)合,Stp1在細胞核誘導Sap和寡肽轉(zhuǎn)運蛋白OPT1和OPT3的表達,加工后的Stp1與蛋白質(zhì)利用所需基因的啟動子(如SAP2、OPT1)中的UASaa1結(jié)合,而加工后的Stp2與UASaa2結(jié)合,誘導AAP的表達。此外,SPS傳感器正確誘導Stp1和Stp2所需的另一個成分是完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)膜成分Shr3。Shr3是SPS傳感途徑的最上游成分,它是Aaps和Ssy1正確定位到白念珠菌細胞質(zhì)膜所必需的,缺少SHR3的突變體既不能感知也不能攝取氨基酸[21]。

2.2 Stp1調(diào)控TOR通路

Stp1是SPS氨基酸傳感途徑的關(guān)鍵效應因子,它的降解受酵母中RAPA活性的控制。SPS傳感器系統(tǒng)負責傳感細胞外氨基酸,而TOR途徑主要參與傳感細胞內(nèi)氨基酸[22]。TOR靶信號通路在真核細胞的生長調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用,胞外環(huán)境中的氮源可以激活TOR信號通路,TOR激酶編碼磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族,并作為反映真核細胞生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[23]。與其他真核生物一樣,酵母細胞中含有兩種TOR復合物,稱為TOR復合物1(TORC1)和TOR復合物2(TORC2),TORC1介導營養(yǎng)信號傳導,并對RAPA敏感[24]。而TORC2調(diào)節(jié)細胞代謝,包括脂肪生成和葡萄糖轉(zhuǎn)運,對RAPA不敏感[25]。因此,Stp1的降解至少受到兩種不同機制的調(diào)節(jié):TORC1非依賴性泛素蛋白酶體途徑和TORC1依賴性Rrd1-Sit4途徑[26]。RAPA與酵母FKBP12同系物Fpr1形成復合物,并且這種RAPA-Fpr1復合物抑制TORC1活性,RAPA通過誘導氮分解代謝物抑制基因的轉(zhuǎn)錄[27]來滅活TORC1。胞外氨基酸是激活TOR信號通路的重要營養(yǎng)素,并且被SPS傳感器所感知,來自SPS傳感器的氨基酸信號被傳遞到細胞內(nèi)部,并調(diào)節(jié)參與氮吸收的許多基因的轉(zhuǎn)錄[28]。Andreasson等[29]的實驗表明Stp1的處理與TORC1的活性無關(guān),僅取決于細胞外氨基酸的存在。當TOR途徑失活時,只有局限于細胞核中經(jīng)過加工的Stp1容易降解。此外,由于RAPA處理或當?shù)厥艿较拗茣r,泛素-蛋白酶體途徑會參與維持在正常條件下Stp1的穩(wěn)態(tài)水平[30]。

Stp1依賴性氨基酸攝取與RAPA敏感的TOR信號通路密切相關(guān)。細胞外氨基酸是激活TOR途徑的重要營養(yǎng)線索,并且Stp1通過介導從質(zhì)膜到細胞核的氨基酸信號傳導以攝取細胞外氨基酸,提示Stp1與TOR途徑之間存在聯(lián)系。Shin等[26]的實驗表明,Stp1的表達水平影響細胞對RAPA敏感性,Stp1的過表達導致RAPA產(chǎn)生耐藥性,而TORC1的失活導致Stp1以PP2A樣磷酸酶Sit4依賴性方式降解[31]。Sit4是一種在酵母中發(fā)現(xiàn)的PP2A樣磷酸酶,它除了負調(diào)控TOR途徑外,在正常細胞生長中也有重要作用。Rrd1是哺乳動物磷酸酪氨酸磷酸酶激活劑(PTPA)的酵母同源物,是Sit4的激活劑。而PP2A(蛋白質(zhì)磷酸酶2A型)是由TOR途徑感知的細胞內(nèi)氨基酸信號傳導的主要效應子[32],對Stp1的降解起重要作用。Stp1是一種磷酸化蛋白,正常條件下,在所有野生型細胞中Rrd1和Sit4都是磷酸化狀態(tài)。Rrd1-Sit4參與了RAPA處理過程中Stp1的去磷酸化,這可能是TORC1失活促進Stp1降解的先決條件[33-34]。

2.3 Stp1參與調(diào)控自噬

自噬是真核生物降解細胞物質(zhì)的主要途徑,通過在溶酶體或液泡室內(nèi)的降解,促進真核生物大分子和細胞器的整體降解。在釀酒酵母的氮饑餓期間,自噬對于它的存活以及完成芽孢形成的分化過程至關(guān)重要[35]。研究表明,自噬在白念珠菌中保守存在[36],且影響白念珠菌的毒力[37]。在應激刺激或者氮饑餓等營養(yǎng)缺陷的狀態(tài)下,Stp1誘導白念珠菌自噬。白念珠菌在處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和氧化應激的條件下,可以通過增強自噬以減緩應激反應和增強菌體存活能力[38-39]。因此,自噬與白念珠菌的致病性和適應性息息相關(guān)。

在白念珠菌細胞中,液泡水解酶氨肽酶I (API)和α-甘露糖苷酶(AMS)通過CVT(cytoplasm-to-vacuole targeting)途徑從細胞質(zhì)傳遞到液泡。CVT途徑和自噬途徑在很大程度上依賴于相同的細胞機制,許多在自噬方面有缺陷的突變體也被阻斷在CVT途徑中[40]。在白念珠菌中,自噬主要是依靠氮饑餓應答[41],除此之外,還可以通過RAPA直接抑制保守的TORC1,誘導自噬[42]。研究表明[43],RAPA不能有效誘導STP1敲除菌株中自噬相關(guān)基因的表達,當Stp1轉(zhuǎn)錄因子缺失時,表現(xiàn)出對RAPA耐受,STP1敲除菌株發(fā)生自噬缺陷,自噬小體不能與液泡進行融合,說明轉(zhuǎn)錄因子Stp1可能通過調(diào)控CVT途徑誘導細胞自噬。

與RAPA誘導自噬不同的是,在氮饑餓誘導的自噬中,TORC1沒有直接被抑制,因為RAPA是TORC1的直接抑制劑。但相同的是,轉(zhuǎn)錄因子Stp1的缺失,都使自噬發(fā)生缺陷,從而增強了菌體在饑餓條件下的存活能力。因此無論是通過RAPA直接抑制TORC1發(fā)生自噬還是通過氮饑餓間接抑制TORC1發(fā)生自噬,都需要轉(zhuǎn)錄因子Stp1的參與[43]。

3 Stp1的氮源依賴性毒力以及與Sap2的關(guān)系

3.1 氮源的利用

在致病性白念珠菌中,氮源的利用率可以調(diào)節(jié)白念珠菌毒力表型,包括絲狀生長和蛋白酶的分泌。銨滲透酶Mep2是一種胞質(zhì)膜蛋白,介導優(yōu)選氮源銨的攝取。它的表達由GATA轉(zhuǎn)錄因子Gat1和Gln3調(diào)節(jié)。在有限氮源的條件下,Mep2誘導從酵母到絲狀生長的轉(zhuǎn)換[44]。這些中樞調(diào)節(jié)因子也控制著Sap2的表達,當?shù)鞍踪|(zhì)是唯一可用的氮源時,該蛋白酶被誘導。在這些條件下,Gat1和Gln3上調(diào)STP1的表達,STP1編碼一種蛋白水解激活的轉(zhuǎn)錄因子,反過來介導Sap2和蛋白質(zhì)生長所需的幾種寡肽轉(zhuǎn)運蛋白的表達。通過這種方式,白念珠菌將不同毒力相關(guān)表型的表達整合到控制氮代謝的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中[45]。見圖1。

圖1 蛋白酶分泌的調(diào)節(jié)。GATA轉(zhuǎn)錄因子Gat1和Gln3控制MEP2和的表達,在限制性氮的條件下,Gat1和Gln3可能通過直接與MEP2啟動子結(jié)合來誘導MEP2的表達。相反,GATA因子對和OPT1和OPT3的調(diào)節(jié)是通過STP1的上調(diào)間接發(fā)生的。當?shù)鞍踪|(zhì)是唯一可用的氮源時,Stp1被蛋白水解激活[45] 圖2 酵母中氮分解代謝物抑制 (NCR) 的示意圖,Gln3和Gat1是NCR的兩個陽性GATA效應子,通常在優(yōu)選的氮富集條件下從細胞核中排除。核排斥認為是通過Gln3與Ure2蛋白之間的磷酸化相互作用而發(fā)生的[46]Fig.1 Regulation of protease secretion. Control of MEP2 and expression by the GATA transcription factors Gat1 and Gln3. Under limiting nitrogen conditions, Gat1 and Gln3 induce expression of the ammonium permease MEP2 presumably by directly binding to the MEP2 promoter. In contrast, regulation of the, OPT1 and OPT3 by the GATA factors occurs indirectly, via upregulation of the transcription factor STP1. Stp1 is proteolytically activated when proteins are the only available nitrogen source Fig.2 Schematic diagram of nitrogen catabolite repression (NCR) in yeast. Gln3 and Gat1 are two positive GATA effectors of NCR that are normallyexcluded from the nucleus under preferred nitrogen replete conditions. Nuclear exclusion is thought to occur via the interaction of Gln3 with the phosphorylated version of the Ure2 protein[46]

對氮源的利用控制著白念珠菌的不同表型特征,這些表型特征與白念珠菌的毒力有關(guān),轉(zhuǎn)錄因子Gat1和Gln3對基因表達的適當調(diào)控對白念珠菌的致病性十分重要。

3.2 氮分解代謝物抑制(nitrogen catabolism repression,NCR)

除了感知細胞外氮源的利用率,酵母細胞還可以衡量內(nèi)化氮源的質(zhì)量,并作出適當?shù)姆磻哉{(diào)整新陳代謝。氮分解代謝物抑制 (NCR) 是一種超途徑,當首選氮源可用時,它通過抑制利用次級氮源所需的基因來控制氮源利用[46]。

蛋白質(zhì)作為一種替代或次要氮源,即當首選氮源充足,即使在蛋白質(zhì)存在時,SAP和OPT基因的表達仍受到抑制,這種抑制是由于在高濃度的銨、谷氨酰胺或尿素存在下,導致STP1表達下調(diào)所引起的,STP1的強制表達消除了氮分解代謝對表達的抑制,并導致Sap2的分泌和胞外蛋白的降解[47]。因此,通過控制STP1的表達水平,間接調(diào)控因子Gat1和Gln3介導的Sap2的氮分解代謝抑制,并允許當?shù)鞍踪|(zhì)作為唯一可用的氮源時,Stp1誘導蛋白酶。轉(zhuǎn)錄因子Stp1受NCR的控制,在這些條件下不表達,這限制了Stp1依賴性分泌蛋白酶Sap2和寡肽轉(zhuǎn)運蛋白的表達[48]。見圖2。

4 結(jié) 語

綜上所述,對于Stp1在白念珠菌中的研究目前集中于其調(diào)控SPS氨基酸感應通路和RAPA結(jié)合蛋白TOR通路、參與調(diào)控自噬以及毒力致病方面,其中Stp1誘導細胞發(fā)生自噬,造成高表達,進而影響細胞生物膜的形成,增強白念珠菌的致病力。在白念珠菌致病的過程中,白念珠菌生物膜以一種屏障形式導致了真菌耐藥,白念珠菌生物膜是由細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)包裹酵母細胞、菌絲細胞和假菌絲細胞組成的致密的網(wǎng)狀系統(tǒng),呈有機的三維結(jié)構(gòu)和廣泛的空間不均一性[49],由于組織感染白念珠菌后會形成生物膜,使治療難度增加,預后更差。但目前有關(guān)于Stp1影響生物膜形成的機制以及與Stp2之間的調(diào)控關(guān)系尚不清楚,因此,從疾病的預后以及治療方面,今后可從Stp1誘導細胞自噬進而影響生物膜形成方面進行研究,Stp1有望成為白念珠菌感染性疾病治療的新靶點。綜上,轉(zhuǎn)錄因子Stp1對于白念珠菌的致病過程是十分重要的,但其具體耐藥機制仍需進一步研究,Stp1、Stp2與Sap2和生物膜之間的聯(lián)系仍待進一步明確。當前,隨著白念珠菌的耐藥性不斷增加,對Stp1新靶點的研究已是目前的當務之急。