陳婷 李嘉龍 白蕊 史曉燕 段麗芳 李翠娟,3 范妤,3**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,陜西 咸陽 712046;3.陜西省中醫(yī)體制與疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 咸陽 712046)

肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,病發(fā)率和死亡率均位居癌癥前列[1-3]。當(dāng)前臨床多采用手術(shù)、化療、中藥及聯(lián)合療法等治療方式。由于多數(shù)患者發(fā)病隱匿,發(fā)現(xiàn)時(shí)多已是中后期,使得治療選擇受限,化療成為肝癌患者治療的主要手段[4]。對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是化療中常見的棘手現(xiàn)象,極大程度降低了化療藥物治療效果[5]。近年來,多藥耐藥性成為臨床肝癌治療中亟待解決的問題[6-9]。有研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)化療藥物可以通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌的作用,而腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抗凋亡作用則是誘發(fā)MDR的重要機(jī)制之一[10-11]。

華蟾素是由干蟾皮通過水提醇沉法獲得的中成藥制劑,廣泛應(yīng)用于肝癌[12-15]、肺癌[16-18]、乳腺癌等多種惡性腫瘤[19-21]的臨床治療中,療效顯著。有研究顯示,華蟾素及其有效成分可通過激活線粒體凋亡途徑誘發(fā)大腦膠質(zhì)瘤[22]、淋巴瘤等[23]惡性腫瘤細(xì)胞凋亡。華蟾素還可以提高肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[24],但目前關(guān)于華蟾素對肝癌化療中耐藥作用及其作用機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。本研究以人肝癌HepG2細(xì)胞和阿霉素耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM為研究對象,從對細(xì)胞增殖的影響、細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)等方面深入探究華蟾素逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥的機(jī)制,旨在為華蟾素的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞 人肝癌 HepG2由陜西中醫(yī)藥大學(xué)晁旭教授惠贈(zèng),HepG2/ADM細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物有限公司(批號:20220723)。

1.2藥物與試劑 將華蟾素膠囊(陜西東泰制藥有限公司,批號:1K0907151)溶于DMSO溶液(DMSO終濃度<0.1%);以DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋為相應(yīng)質(zhì)量濃度應(yīng)用于實(shí)驗(yàn),即用即配[25];阿霉素購于深圳萬樂藥業(yè)有限公司(批號:2110E2);青霉素鏈霉素混合液(貨號P1400),胰蛋白酶(貨號:T1300),噻唑蘭(貨號:1334MG250)購自北京Solarbio公司;胎牛血清(貨號:FSP500)購自依科賽生物公司;DMEM 培養(yǎng)基(貨號XT-SH30022,01B)購于美國hyclone公司;Caspase-3一抗(貨號:19677-1-AP)購于美國Proteintech 公司;Caspase-9一抗(貨號:9508S)購于美國 Cell Signaling Technology;BAX一抗(貨號:sc-20067)、Bcl-2 一抗(貨號:sc-56015)購于美國santa cruz公司;β-actin一抗(貨號:bs-0061R)、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(貨號:BA1135)、羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗(貨號:BA1050)購自購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.3儀器 高速低溫離心機(jī)(Eppendorf 5430R);超低溫冰箱(Thermo Scientific Forma 702);分析天平(中國Mettler Toledo);制冰機(jī)(寧波 Grant XB100);渦旋混合器(美國 Scientific Industries);水平搖床(海門 Kylin-Bell BETS-M5);蛋白印跡電泳系統(tǒng)(美國 Bio-Rad);凝膠成像系統(tǒng)(Protein Simple FluorChemFC3);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備);超純水器(美國 Millipore);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Nuaire NU-4950E);倒置顯微鏡(日本 Olympus)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞于含 12%胎牛血清和 1%雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng);HepG2/ADM細(xì)胞接種于加入1 μg·mL-1阿霉素的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中,維持細(xì)胞的耐藥特性[26]。細(xì)胞均置于 37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育,在對數(shù)生長期進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2華蟾素對HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞增殖的影響 分別制備密度為1×105個(gè)·mL-1的HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞懸液,以100 μL/孔接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后,給予HepG2細(xì)胞含有0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、10 μg·mL-1華蟾素干預(yù);給予HepG2/ADM細(xì)胞含有0、1、2、4、8、16、32 μg·mL-1華蟾素干預(yù);繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,加入20 μL/孔 MTT溶液,避光孵育4 h,棄去液體后加入150 μL/孔 DMSO,室溫震蕩10 min,紫色結(jié)晶完全溶解后,全自動(dòng)酶標(biāo)儀在490 nm 處測定吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=(1-華蟾素組OD值/空白對照組OD值)×100%;計(jì)算華蟾素對兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50)及藥物的耐藥倍數(shù),耐藥倍數(shù)=IC50耐藥株/IC50敏感株[27]。每組6個(gè)復(fù)孔,重復(fù)測定3次。

2.3倒置顯微鏡觀察HepG2/ADM細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 將密度為1×105個(gè)·mL-1HepG2/ADM細(xì)胞懸液接種于96孔板,100 μL/孔。待細(xì)胞貼壁后分別加入0、4、8、16 μg·mL-1華蟾素溶液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.4藥物蓄積實(shí)驗(yàn) 把實(shí)驗(yàn)分為HepG2組、HepG2/ADM組、不同濃度華蟾素組。分別將密度為1×104個(gè)·mL-1的HepG2細(xì)胞和HepG2/ADM細(xì)胞,接種于24孔板內(nèi),孵育24 h后,HepG2組、HepG2/ADM組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基,不同濃度華蟾素組分別加入含4、8、16 μg·mL-1華蟾素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,除HepG2組外,其余各組均加入含5 μg·mL-1阿霉素的培養(yǎng)基,孵育4 h,4%多聚甲醛避光固定35 min后加入DAPI染液室溫避光放置5 min,抗熒光淬滅封片劑封片,避光存放。熒光顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞核呈紫藍(lán)色熒光,阿霉素自發(fā)紅色熒光。采用 ImageJ6.0軟件計(jì)算細(xì)胞阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度值。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 分組及處理方法同2.4,收集細(xì)胞,提取總蛋白,BCA法定量蛋白濃度,制備上樣蛋白,經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,分別加入 Bcl-2抗體(1∶1500)、Bax抗體(1∶1000)、Caspase-9抗體(1∶1000)、 Caspase-3抗體(1∶1000)、β-actin抗體(1∶1000),4 ℃孵育過夜;室溫孵育二抗,凝膠成像儀顯影。應(yīng)用Image J6.0 軟件分析蛋白條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1華蟾素抑制HepG2、HepG2/ADM細(xì)胞增殖 與空白組比較,華蟾素在0.125至10 μg·mL-1濃度范圍能夠抑制HepG2細(xì)胞增殖,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.01),IC50為(11.27±1.15)μg·mL-1;華蟾素在1至32 μg·mL-1濃度范圍能夠抑制HepG2/ADM細(xì)胞增殖(P<0.01),IC50為(52.60±11.04)μg·mL-1。華蟾素對兩種細(xì)胞的增殖抑制作用均具有劑量依賴性。耐藥倍數(shù)為4.67。根據(jù)華蟾素對HepG2/ADM細(xì)胞的增殖抑制情況,選取4、8、16 μg·mL-1作為后續(xù)處理劑量。結(jié)果見圖1,2。

注:與空白對照組相比**P<0.01

注:與空白對照組相比**P<0.01

3.2華蟾素對HepG2/ADM細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化影響 倒置顯微鏡下觀察華蟾素對 HepG2/ADM 細(xì)胞形態(tài)的影響,結(jié)果顯示, HepG2/ADM 細(xì)胞形態(tài)清晰,有明顯突起,貼壁牢固。經(jīng)華蟾素干預(yù) 24 h后,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞數(shù)量減少,體積變小,細(xì)胞皺縮突起減少,貼壁松散,細(xì)胞間連接減少。見圖3。

圖3 華蟾素對HepG2/ADM細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化影響(×200)

3.3華蟾素對HepG2/ADM細(xì)胞藥物蓄積的影響 與HepG2細(xì)胞組比較,HepG2/ADM細(xì)胞中ADM的含量無顯著差異(P>0.05)。與HepG2/ADM細(xì)胞比較,華蟾素處理組細(xì)胞中ADM的含量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖4。

注：與HepG2組相比與##P<0.01;與HepG2/ADM組相比**P<0.01

3.4華蟾素對 HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與HepG2細(xì)胞組比較,HepG2/ADM細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著升高,Caspas e-9 蛋白表達(dá)下降(P<0.05),Bax 及 Caspase-3 蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.01);與HepG2/ADM細(xì)胞比較,華蟾素處理組 Bax、Capase-9 及 Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高, Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖5。

注：與HepG2組相比與#P<0.05,##P<0.01;與HepG2/ADM組相比*P<0.05,**P<0.01

4 討論

全球范圍內(nèi),腫瘤疾病已經(jīng)成為人類重大的公共健康問題之一,在我國肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居消化系統(tǒng)惡性腫瘤前列[1]。目前臨床治療主要以手術(shù)、化療、放療、中藥及聯(lián)合治療等,由于肝癌發(fā)病隱匿,多數(shù)患者失去了手術(shù)機(jī)會(huì),因此化療成為多數(shù)肝癌患者采用的主要治療方案,化療藥物易發(fā)生多藥耐藥,使患者對藥物敏感性下降,成為致使化療療效不盡如人意的主要原因之一[9]。

中醫(yī)藥是中華文明的瑰寶,來源于天然動(dòng)植物藥物顯示出良好的抗癌功效。中藥復(fù)方、中藥注射液、中藥單體在逆轉(zhuǎn)肝癌化療耐藥方面機(jī)制研究也日益增加。華蟾素是從蟾蜍中提取分離出的主要活性成分,具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等多種功效,對包括肝癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用[24]。

本實(shí)驗(yàn)研究中,我們選用HepG2細(xì)胞作為對照,以HepG2/ADM細(xì)胞株作為研究對象。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,華蟾素對HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用,且具有明顯的劑量依賴性;倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)華蟾素處理度干預(yù)后,隨著藥物濃度的增加,HepG2/ADM細(xì)胞數(shù)量減少,體積變小,細(xì)胞皺縮突起減少,細(xì)胞間連接減少,貼壁不牢固,形態(tài)學(xué)變化與MTT結(jié)果相符。

阿霉素(Adriamycin,ADM),也稱多柔比星(Doxorubicin,Dox),是蒽環(huán)類家族成員,具有細(xì)胞毒性,臨床多作為肝癌及其他腫瘤的一線化療藥。阿霉素穿過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)聚集能夠自發(fā)紅色熒光,這一特點(diǎn)便于觀察藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積情況[28]。熒光顯微鏡下觀察顯示,與HepG2和HepG2/ADM細(xì)胞相比,華蟾素處理后的HepG2/ADM細(xì)胞,胞質(zhì)中紅色熒光明顯增強(qiáng)增多,表明ADM在HepG2/ADM細(xì)胞中含量增加,外排減少,HepG2/ADM對ADM的敏感性增強(qiáng)。

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥的原因和機(jī)制復(fù)雜,主要與影響凋亡調(diào)控的相關(guān)蛋白表達(dá)、藥物靶點(diǎn)基因突變、酶系統(tǒng)活躍、自噬誘導(dǎo)、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)等多種因素有關(guān)[11]。凋亡蛋白的異常調(diào)控是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要原因[29]。多數(shù)化療藥物能夠通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑瘤作用。線粒體不僅是細(xì)胞凋亡的觸發(fā)開關(guān)、細(xì)胞死亡的直接通路,也與腫瘤多藥耐藥間存在密切關(guān)系[26,30]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)華蟾素處理后,HepG2/ADM細(xì)胞中Bax、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達(dá)水平可顯著上調(diào),Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),表明華蟾素可以通過激活HepG2/ADM線粒體凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制HepG2/ADM細(xì)胞增殖。

綜上所述,華蟾素對肝癌耐藥細(xì)胞具有增殖抑制作用,可以通過增加阿霉素在細(xì)胞內(nèi)蓄積增加、促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮抗耐藥作用。在后續(xù)研究中,我們也將對華蟾素聯(lián)合化療藥物應(yīng)用的療效進(jìn)行深入的在體和離體實(shí)驗(yàn)研究,為華蟾素在肝癌治療的臨床應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。