曹邦卿,吳支喜,曾麗珍,易衛(wèi)環(huán)

江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330012

支氣管哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病,其發(fā)病受季節(jié)變化的影響,主要病變部位位于氣道及兩側(cè)肺葉。患者表現(xiàn)為喘息、氣急和胸悶等癥狀,病情反復(fù)發(fā)作,尤其在夜間或清晨發(fā)作頻率較高。近年來,我國支氣管哮喘發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)上升態(tài)勢,該病臨床尚無特效治療方法,嚴(yán)重危害患者健康[1-2]。

目前,支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。現(xiàn)有研究認(rèn)為,多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了支氣管哮喘的發(fā)病過程。其中,Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)通路在細(xì)胞免疫、生長和分化等方面發(fā)揮重要作用,成為當(dāng)前研究較為關(guān)注的途徑[3-4]。防御素是一種陽離子多肽,作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分,其在功能上與中醫(yī)理論中的“衛(wèi)氣”表現(xiàn)出顯著相似性。益氣溫陽護(hù)衛(wèi)法由洪廣祥教授提出,并在臨床廣泛應(yīng)用,研究表明,其可增強(qiáng)呼吸道防御機(jī)能和免疫調(diào)節(jié)能力,同時(shí)降低氣道反應(yīng)性。該法在臨床防治支氣管哮喘方面取得了顯著成效,但其與防御素之間的關(guān)聯(lián)研究相對不足[5-6]。因此,本研究旨在基于JAK/STAT信號(hào)通路探討益氣溫陽護(hù)衛(wèi)法干預(yù)支氣管大鼠防御素水平的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物選取SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,體質(zhì)量 200～220 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-0011。所有大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房內(nèi),溫度18～25 ℃,相對濕度60%～70%,12 h/12 h明暗交替,動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審批號(hào):JXKY2388456。

1.2 藥物與試劑卵清蛋白(ovalbumin,OVA)、氫氧化鋁(Sigma公司,貨號(hào):SLCD9242、239186);白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)酶聯(lián)免疫試劑盒(聯(lián)科生物科技有限公司,貨號(hào):230430316);干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ)酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):A30015209);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司,貨號(hào):RR037A);超純RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,貨號(hào):W0581M)。

1.3 儀器402型超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司);Rea1-time PCR儀(美國ABI公司,型號(hào):ABI PRISM7100);高速低溫離心機(jī)(BECKMAN公司,型號(hào):J-6、J-2);多功能酶標(biāo)儀(MDC公司,型號(hào):SPECTRAMAX M5);-80 ℃超低溫冰箱(美國Forma Scientific公司,型號(hào):8525)。

2 方法

2.1 藥物制備益氣溫陽護(hù)衛(wèi)湯:黃芪200 g,白術(shù)、防風(fēng)、淫羊藿各150 g,桂枝、白芍、生姜、大棗、仙茅各100 g,炙甘草50 g,由江西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。所有藥材加入8倍量水浸泡30 min,煎煮 60 min 后過濾藥汁;剩余藥渣加6倍量水煎煮 40 min,過濾藥汁;將兩次藥汁合并后濃縮,調(diào)至生藥濃度為2 g·mL-1的溶液,存放于4 ℃冰箱中備用。

2.2 大鼠支氣管哮喘模型制備造模第1天,大鼠腹腔注射1 mL抗原液(含10 mg卵清蛋白和100 mg氫氧化鋁)致敏,并于造模第2天、第3天、第8天以相同劑量重復(fù)注射;第15天將大鼠放在特制的透明玻璃容器中,采用超聲霧化器以1% OVA進(jìn)行霧化吸入激發(fā),每次30 min,每天1次,持續(xù)14 d。大鼠弓背蜷縮在霧化箱角落,出現(xiàn)明顯煩躁不安,呼吸急促,抓耳撓腮,打噴嚏,躲避遠(yuǎn)離霧化出氣口,口唇發(fā)紺等表現(xiàn),提示支氣管哮喘模型復(fù)制成功。

2.3 動(dòng)物分組及給藥50只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及益氣溫陽護(hù)衛(wèi)湯低劑量組(5 g·kg-1)、中劑量組(10 g·kg-1)、高劑量組(20 g·kg-1),每組10只。正常組:以生理鹽水(1 mL)替代抗原液進(jìn)行腹腔注射,后續(xù)不進(jìn)行霧化激發(fā);模型組和各藥物組:采用“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行造模。造模成功后的第8天開始灌胃,各藥物組給予相應(yīng)劑量的益氣溫陽護(hù)衛(wèi)湯,正常組和模型組給予等體積生理鹽水,每天2次,持續(xù)4周。

2.4 樣本制備

2.4.1 血清和肺組織制備末次灌胃后2 h采集樣本,腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采血,1 500 r·min-1離心,取上清,保存在-80 ℃冰箱中備用;分離大鼠肺組織,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 肺泡灌洗液制備腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠,將大鼠仰臥位固定于操作臺(tái),在頸部正中作 1 cm 切口,鈍性分離頸部軟組織并充分暴露氣管;注射器抽取無菌冰PBS,沿氣管緩慢注入肺內(nèi),可見胸廓擴(kuò)張;注射結(jié)束開始計(jì)時(shí),2 min后將大鼠調(diào)整為足高頭低位;重復(fù)灌洗3次后,用注射器緩慢回抽,收集肺泡灌洗液,4 ℃離心(3 000 r·min-1)10 min,收集上清液,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 ELISA檢測血清IFN-γ、IL-4水平嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠血清IFN-γ、IL-4水平。

2.6 RT-PCR檢測肺組織β-防御素(human beta-defensin,HBD-1、HBD-2、HBD-3、HBD-4)mRNA、JAKmRNA、STAT6mRNA表達(dá)水平嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,采用Trizol法提取肺組織總RNA,隨后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物通過Bio-Rad CFX Manager軟件設(shè)計(jì),由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,內(nèi)參基因選擇GAPDH。目的基因的相對表達(dá)水平根據(jù)2-△△CT法算出,引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 瑞士染色法檢測肺泡灌洗液免疫細(xì)胞水平取肺泡灌洗液,在4 ℃條件下離心5 min(2 000 r·min-1),去除上清液,取少許細(xì)胞沉淀,使用瑞士染液染色,100×10油鏡下計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織β-防御素基因表達(dá)水平與正常組比較,模型組和各藥物組大鼠肺組織β-防御素基因表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,各藥物組肺組織β-防御素基因表達(dá)水平降低(P<0.05);各藥物組肺組織β-防御素基因表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3.2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4水平比較與正常組比較,模型組和各藥物組大鼠血清IFN-γ水平降低(P<0.05);與模型組比較,各藥物組血清IFN-γ水平升高(P<0.05)。與正常組比較,模型組和各藥物組大鼠血清IL-4水平升高(P<0.05);與模型組比較,各藥物組IL-4水平降低(P<0.05)。各藥物組血清IFN-γ、IL-4 水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組大鼠肺組織β-防御素基因表達(dá)水平比較

表3 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4 水平比較

3.3 各組大鼠肺組織JAKmRNA、STAT6mRNA表達(dá)水平比較與正常組比較,模型組和各藥物組大鼠肺組織JAKmRNA、STAT6mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,各藥物組肺組織JAKmRNA、STAT6mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);各藥物組肺組織JAKmRNA、STAT6mRNA表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肺組織JAK mRNA、STAT6 mRNA 表達(dá)水平比較

3.4 各組大鼠肺泡灌洗液免疫細(xì)胞水平比較與正常組比較,模型組和各藥物組大鼠肺泡灌洗液的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平升高(P<0.05);與模型組比較,各藥物組肺泡灌洗液的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平降低(P<0.05);各藥物組肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠肺泡灌洗液免疫細(xì)胞水平比較

4 討論

中醫(yī)學(xué)并無支氣管哮喘這一病名,根據(jù)其癥狀可歸屬于“喘證”“哮證”等范疇,經(jīng)過長期探索積累了豐富的臨床辨治經(jīng)驗(yàn)。從中醫(yī)理論角度分析,本病是由外感寒邪,肺臟功能失調(diào),導(dǎo)致肺氣宣降失司,痰飲積聚氣道,濁氣難以消散而成。氣陽虛弱是支氣管哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因素,益氣溫陽護(hù)衛(wèi)法是基于“氣陽虛弱、衛(wèi)氣不固”的理論而設(shè)立。該方法著重于調(diào)補(bǔ)腎、脾、肺之氣陽虛弱,旨在增強(qiáng)呼吸道防御和免疫調(diào)節(jié)能力。研究表明,益氣溫陽護(hù)衛(wèi)法治療支氣管哮喘具有顯著療效,但其具體作用機(jī)制仍不明確[7-9]。

目前普遍認(rèn)為,輔助型T細(xì)胞1(T helper 1 cell,Th1)/輔助型T細(xì)胞2(T helper 2 cell,Th2)失衡,即Th1型免疫反應(yīng)異常減弱,Th2型免疫反應(yīng)異常增強(qiáng),是支氣管哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。因此,調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡對于支氣管哮喘的防治策略具有重要意義。支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,這些通路分別對炎癥因子、細(xì)胞因子以及黏液分泌相關(guān)因子的產(chǎn)生和活性進(jìn)行調(diào)控。JAK/STAT信號(hào)通路在支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10-11],該通路包括JAKs家族和STATs家族。其中,JAKs是一種蛋白酪氨酸激酶,在生物體內(nèi)廣泛表達(dá);當(dāng)任意一個(gè)JAKs家族成員被激活,均可引起STAT家族的一個(gè)或多個(gè)成員發(fā)生磷酸化。JAK/STAT通路對支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的影響主要體現(xiàn)在STAT6環(huán)節(jié),即STAT6與受體二聚體結(jié)合后,經(jīng)JAK1催化磷酸化激活,形成同源或異源二聚體。在含有核定位信號(hào)肽段的小分子蛋白協(xié)助下,二聚體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[12-14]。支氣管黏膜中Th2型細(xì)胞合成的炎癥介質(zhì)能夠激活JAK/STAT通路,引發(fā)大量黏液分泌,加劇支氣管哮喘進(jìn)展。支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病,涉及中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞,上述免疫細(xì)胞通過JAK/STAT信號(hào)通路傳遞信息,誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性[15-17]。

防御素是一種抗菌肽,構(gòu)成了機(jī)體抵御外部病原微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障,具有免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞趨化等作用,是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分[18]。防御素主要分布于脊椎動(dòng)物的黏膜、皮膚等上皮組織,其中β-防御素作為陽離子性極強(qiáng)的小分子抗菌肽,具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒活性及廣譜抗菌等功能。呼吸道上皮細(xì)胞分泌的抗菌肽在防御微生物入侵過程中發(fā)揮重要作用,構(gòu)成了上皮組織的天然防御屏障[19-20]。研究表明,β-防御素可誘導(dǎo)輔助型T淋巴細(xì)胞向Th2轉(zhuǎn)化,從而調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞平衡,減少白細(xì)胞介素1α(interleukin 1α,IL-1α)等促炎細(xì)胞因子分泌,進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[21-22]。另外,作為Th1、Th2的特征性細(xì)胞因子,IFN-γ、IL-4水平正常,有助于氣道Th1/Th2亞群平衡,從而降低氣道炎癥反應(yīng)[23-24]。余建瑋等[25]發(fā)現(xiàn),支氣管哮喘大鼠肺組織的防御素基因表達(dá)水平升高,經(jīng)益氣溫陽護(hù)衛(wèi)法治療后,防御素基因表達(dá)水平顯著降低,這與本研究的結(jié)果一致。因此,益氣溫陽護(hù)衛(wèi)法可減輕支氣管哮喘大鼠的氣道炎癥,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)防御素表達(dá)水平有關(guān)。

《素問·痹論》有云:“衛(wèi)者,水谷之悍氣也?！毙l(wèi)氣,即運(yùn)行于脈外皮膚、肌肉之間的氣,具有防御外邪侵襲、護(hù)衛(wèi)肌表及溫養(yǎng)皮毛、肌肉、臟腑等組織器官的功能[26-27]。β防御素在調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)免疫反應(yīng)方面具有較強(qiáng)作用,與中醫(yī)理論中的“衛(wèi)氣”具有相似之處。益氣溫陽護(hù)衛(wèi)湯通過改善機(jī)體衛(wèi)氣不固、陽氣虛弱的證候,激發(fā)其自我防御機(jī)制,增強(qiáng)β防御素表達(dá)水平,從而緩解炎癥因子對呼吸系統(tǒng)的損傷[28-29]。益氣溫陽護(hù)衛(wèi)湯中,黃芪補(bǔ)中益氣,白術(shù)健脾益氣,防風(fēng)疏風(fēng)解表,淫羊藿、仙茅溫補(bǔ)腎陽,桂枝溫經(jīng)通脈、助陽化氣,白芍平肝潛陽、養(yǎng)血調(diào)經(jīng),生姜溫中止嘔、解表散寒、止咳化痰,大棗益氣養(yǎng)血,炙甘草調(diào)和諸藥,全方共奏益氣溫陽之效。藥理學(xué)研究表明,黃芪具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用;淫羊藿可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能,發(fā)揮顯著的抗感染作用;防風(fēng)具有抗炎、抗菌、解熱、提高免疫力等作用。

綜上所述,益氣溫陽護(hù)衛(wèi)法可減輕支氣管哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng),降低β-防御素基因表達(dá)水平,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路有關(guān)。